ELISA基础知识及常见问题处理基础知识及常见问题处理北京万泰生物药业股份有限公司北京万泰生物药业股份有限公司 技术工程师技术工程师 崔伟崔伟ELISA（酶联免疫吸附试验）vELISA（酶联免疫吸附试验）是一种酶免疫测定。在临床检验中主要通过抗原抗体于固相或液相载体中反应检测体液中的抗体或抗原性物质。通过辣根过氧化物酶（HRP)与底物液TBM的反应指示出所检测物质的有无。v1抗原抗原：抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。v2抗体抗体：抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。 机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。ELISA检测方法检测方法 v夹心法夹心法:双抗原（抗体）夹心法是检测抗原最常用的方法，其检测方法：双抗原夹心： 固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标抗原Ag* Ag-Ab-Ag* + 底物(TMB)显色双抗体夹心： 固相(包被)抗体Ab + 样品(抗原Ag) + 酶标抗体Ab * Ab-Ag-Ab* + 底物(TMB)显色v间接法间接法间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。其检测方法： 固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标二抗Ab* Ag-Ab-抗Ab* + 底物(TMB)显色v竞争法竞争法其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应：固相(包被)抗原Ag + 样品(抗体Ab) + 酶标抗体Ab* Ag-Ab + 底物(TMB)不显色(+)固相(包被)抗原Ag + 样品(无抗体Ab) + 酶标抗体Ab* Ag-Ab* + 底物(TMB)显色(-)诊断试剂所用的质量指标及相互关系：诊断试剂所用的质量指标及相互关系： 灵敏度灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示检测下限的能力。v相对灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）100%v测定方法及表示方法：灵敏度标准品、质控血清、阳性标本稀释终点、血清盘（pannel）及临床标本阳性率。v灵敏度标准品可以从卫生部临检中心购买，质控血清可以从卫生部临检中心购买，也可以自己配制。因为质控血清不一定是原倍血清，或由于片段、亚型、位点等原因，评定试剂盒的灵敏度都带有一定的片面性。v阳性标本稀释终点的方法常用于不同试剂盒的比较，但也有上述的片面性。阳性pannel有些可以从卫生部临检中心购买，如HBsAg阳性pannel，也可以自己配制。临床标本阳性率，是一种粗略的估计，但对临床很实用。特异性特异性： 真阴性标本的检出能力。v相对特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）100%v测定及表示方法：质控血清、血清盘、临床标本阴性率。v质控血清、血清盘可以从卫生部临检中心购买，也可以自己配制。自己配制时注意阴性标本的在血清盘中的比例以及代表性。临床标本阴性百分率是临床使用中对试剂盒特异性的粗略的判断。v如果数批产品都通过了特异性参比测定，是否产品的特异性就一样了呢？不一定。因为特异性参比品的数量不可能很大（样本与整体的差异），引起非特异性的因素很多，目前尚不完全清楚。质控血清盘也存在同样的问题。有关名词简介有关名词简介 v质控血清：质控血清是为了对实验结果进行控制而配制的血清。质控血清可以是定值也可以是不定值，可以购置也可以自配。自己配制时要注意选用无脂血的血清或血浆，不能用试剂盒内的阳性对照。若用稀释的血清作为质控血清，应考虑稀释基质成分对结果的影响。因质控血清与临床标本不一致，应该注意对结果的分析，应该注意质控血清只能用于质控活动，不可用于标定仪器或评价方法。用于室内质控的质控血清一般选取用于室内质控的质控血清一般选取CUTOFF值值2-3倍的质控品。倍的质控品。v室内质控：实验室内部使用控制实验结果可靠性的一种质量控制。v室间质评：用于考核各个实验室结果可靠性的一种考核，可分为国家级和地方级的室间质评。可以理解为 “各个实验室的质量评比”。临界值（CUTOFF值）：临界值是判断阴阳性或有临床意义水平的数值，临界值的确定是测定大量数据后应用统计学方法确定的。许多试剂都会给出临界值或临界值的计算方法。本底：就是底色。如ELISA HBsAg，阳性显色，阴性不显色，本底就是整个阴性显色的情况。ELISA 抗HBcAb，阳性不显色，阴性显色，本底就是整个阳性显色的情况。阴性对照及阳性对照：阴、阳性对照若有正确的结果，对试剂盒操作的结果可以有粗略的判断。空白对照：对ELISA试剂来说，空白对照实际上是不加标本不加酶做对照。空白对照主要测系统的吸光率。空白对照在单波长测量时显得尤其重要。ELISA 试剂常见问题及解答试剂常见问题及解答vELISA试剂的原理基础为抗原抗体免疫反应，在生产、储存、运输、使用等各环节中，对其质量特性产生影响的因素众多。此外，其显色系统中的过氧化物酶在生物样品中普遍存在，故在客户使用过程中经常会产生某种非期望的结果。对问题进行客观的分析、有针对性的解决问题，不仅是用户的希望，也是促进我们自身产品质量提高的关键。v以下为ELISA试剂盒常见问题处理对策：显色浅 灵敏度低序号原因解决方法1试剂盒运输时间过长，受高温天气影响，酶的活性降低。试剂运输过程加放足够冰袋并尽可能缩短运输时间。2试剂盒（包括未用完的板条及其他组分）保藏条件不正确。试剂盒内所有组分都应当在4冷藏，未使用完的板条要密封保存。3试剂盒使用时已超出有效期。过期试剂盒不可以使用。4温育时间不够。严格按照说明书操作。5恒温箱温度达不到37。注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在370.5。尽量避免频繁开关恒温箱门。经常注意水箱中合适的水位。在保证水不没过酶标板的前提下，使水位尽量高，以保证反应温度。6加样量不足；移液时抽吸排放过快，有气泡、或吸头内残留液体过多。经常校正移液器。注意吸头要与移液器吻合。移液不宜过快，排放要完全。7显色剂加量不足，或加入顺序颠倒。按照说明书要求，先加入A液、后加入B液，并保证加入量。8样品用NaN3防腐，影响了酶的活性。不可以使用NaN3防腐。9试剂、样品使用前未平衡至室温。试剂、样品从低温保藏条件中拿出来后，要先平衡至室温方可以使用。10试剂开启时间过长，污染。试剂开启后应该在尽可能短的时间内用完，在保证正确贮存的前提最长不要超过。12不同批号试剂中混用不同批号试剂不能混用假阳性多，本底高甚至花板 序号原因解决方法1试剂过期过期试剂不能使用2加样时污染注意更换吸头。尽可能避免污染。3加酶时污染对先加样后加酶的操作，加酶时要注意吸头不要接触标本，造成污染。当可能造成污染时，一定要更换吸头，切忌侥幸心理。4恒温箱温度过高注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在370.5。5整个操作时间过长、造成反应时间不同（第一孔与最后一孔反应时间相差很悬殊）。气温高时更明显。在尽可能短的时间内完成操作。尽量不要堆积多块板子操作（尤其手工操作时）。6洗液稀释倍数过高按照要求倍数稀释洗液7洗板次数不够按试剂要求，不可任意减少洗板次数8洗板时浸泡时间不够按要求操作，并适当延长浸泡时间。9手工洗板方式不正确洗板时，垂直加入洗液，保证一定的冲击力；洗液要注满板孔，并保证30-60秒的浸泡时间。10洗板机调试不正确或者有故障（可通过手工洗板判定）手工洗板，并联系仪器厂家维修。11酶被污染防止组分的污染。如使用容器，注意容器的清洁。12显色液B液被污染13显色完后没有终止反应。显色完立即终止反应。重复性不好 1加样量多少不一，操作时间长短不一。重复同一样品时，加样量与加样时间相同；同时注意移液器的校准。加样后应该将酶标板放置在微量振荡器上，充分混合；标本保证一致、无污染；尽可能由同一名操作人员操作。尽可能模拟相同的反应条件。2加入标本后没有混匀。3重复实验的操作人员不同，操作习惯不同。4反应时间、温度等不相同。5标本不同（被混淆或者处理不同）6精密度测定方法不标准采用正确的方法操作白板 1忘记加酶严格按照说明书操作。2忘记加显色液3酶或A、B液被污染失效防止组分被污染，注意保存。4把终止液当A液注意液体组分加样顺序。 谢 谢！