流式细胞术原理及与肿瘤学的相关应用2012.11娄全博娄全博流式细胞术（FlowCytometry，FCM）流式细胞术是应用流式细胞仪对悬浮液中的细胞或细胞器进行快速测量和多参数检测的细胞分析技术，是上世纪70年代在单细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞理化特性，诸如大小、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量并分类收集的高科技技术。它综合了激光技术，计算机技术，流体力学，细胞化学，单克隆抗体，荧光化学，分子生物学等各门学科，在对细胞群体的亚群进行定量分析时，具有其它手段无法比拟的优越性。临床型光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握科研型同时配备多种波长的激光器，并可快速的将感兴趣的细胞分选到特定的培养孔上，适用于广泛且灵活的科研应用流式细胞仪基本组成结构1.流动室和液流系统（流动室和液流驱动系统）2.光学系统（激光光源和光束形成、收集系统）3.数据处理系统喷嘴喷嘴激光激光激光激光液液鞘鞘流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，鞘液流是一种稳定的液体流动，鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。流式细胞仪光信号1、散射光信号：FSC和SSC前向散射光信号(FSC)：与激光束方向同轴的称前向散射光信号，反映细胞大小激光器激光器激光器激光器接收接收器器大颗粒大颗粒小颗粒小颗粒侧向散射光信号(SSC)：与激光束方向垂直的称为侧向散射光信号，主要反映了细胞的内部结构，内部结构越复杂，SSC信号越强，反映细胞内颗粒性。激光器激光器接收器接收器散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析；可检测的样本种类多样(单细胞悬浊液)-(1)外周血，骨髓，细针穿刺液，洗脱液，实体组织，培养细胞-(2)血清、血浆、细胞裂解液流式细胞仪特点及检测标本样品制备1、新鲜或冰冻实体组织：酶消化法、机械法、化学试剂处理法等。剪碎法：取新鲜或冰冻（浸泡于生理盐水中）实体组织0.5cm3，眼科手术剪剪碎，加入生理盐水，300目尼龙膜过滤，200ml离心5min，生理盐水洗涤二次。注意事项：由于各种实体组织成份、特性各不相同，对不同的实体组织必须采用不同的单细胞分散方法，才能使单细胞产量高，细胞损伤小。2、石蜡包埋组织：扩大了FCM分析应用范围，并可以对大量临床随访病例资料进行重新研究与利用。标体制备：二甲苯脱蜡法组织清洁剂脱蜡法甲酸双氧水处理法。注意事项：脱蜡完全：检验方法加入100%乙醇，如果无絮状物浮起，即可视为脱净，反之则没有脱净。掌握消化时间，避免细胞核消化掉。切片薄厚适宜，过薄组织碎片多，过厚不宜脱蜡。3、骨髓、血液及体液：去除红细胞及浓缩有核细胞。骨髓及血液：淋巴细胞分离液体液：一般需经300ml离心5min，PBS洗涤二次。如体液中红细胞太多，可用溶血素去除红细胞。注意事项：每次同时制备对照血液淋巴细胞标本，作为二倍体细胞外参标准。视标本中有核细胞浓度的高低进行调整，一般细胞浓度调至510X109/L。荧光染色PBS洗细胞12次加（荧光）单抗，暗处孵育1530分钟PBS洗细胞一次过300目尼龙网上机检测通过DNA检测进行细胞周期分析细胞周期：G0、G1、S、G2、M细胞周期中DNA含量：G0/G1-2C（二倍体）S期-2C4C、G2/M-4C（四倍体）流式细胞周期与DNA倍体分析的基本原理4CM期：细胞分裂期4CG2期：DNA合成后期2C-4CS期：DNA合成期2CG1期：DNA合成前期2CG0期：DNA合成静止期DNA倍体细胞周期：FCM分析细胞周期的基本方法DNA荧光染料特异性与细胞DNA结合DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度与DNA所吸收荧光分子多少成正比。最常用的荧光染料：碘化丙啶（PI）DNA含量的表示细胞群的DNA含量在FCM中一般以DNA指数（DNAindex，DI)表示相对含量，一个正常的二倍体细胞峰，其G0/G1期细胞DNA含量为2C，DI值为1.0。DI=（样本G0/G1期细胞峰平均荧光道数）/（正常二倍体标准细胞G0/G1期细胞峰平均荧光道数）DIDI= =样本样本G0/G1G0/G1期细胞峰平均荧光道数期细胞峰平均荧光道数正常二倍体标准细胞正常二倍体标准细胞G0/G1G0/G1期细胞峰平均荧光道数期细胞峰平均荧光道数DNA倍体的判定标准二倍体的DI为1.0，四倍体的DI为2.0。变异系数（CV）：标准细胞CV3%，新鲜组织标本CV5%。对于一个正常人体的二倍体细胞群，G0/G1期占85-90%以上，S+G2M细胞占10-15%以下。以二倍体参考细胞G0/G1期细胞DNA含量定为2C值DI=1.0，基于标准二倍体细胞的CV在5%以下，即判定标准：DNA二倍体=2C+2CV，DNA异倍体不等于2C+2CV。1.DI=1.00.1(0.91.10)为二倍体。2.DI=1.00.15(0.851.15)为近二倍体。3.DI=2.00.1(1.902.10)为四倍体。4.DI2.10为多倍体5.其余DI均为异倍体。FCM分析在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的应用 DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志，有助于癌变的早期诊断。淋巴瘤在病理形态学还不能作出诊断前，FCM倍体分析可以提供准确的诊断信息。DNA非整倍体的交界瘤应按恶性肿瘤对待。形态学表现为良性的肿瘤出现非整倍体提示有恶变的可能。DI可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标FCM分析DNA含量和DNA倍体的预后意义通常认为DNA含量高，非整倍体的肿瘤恶性程度高，预后差，二倍体或近二倍体肿瘤预后好。除DI及倍体外，反映肿瘤细胞增殖状态的S期细胞比例也被作为判断预后的指标。FCM分析在肿瘤脱落细胞学检查中的应用(1)发现DNA非整倍体细胞峰诊断为癌。(2)如无明显的非整倍体细胞峰，但有一个突出的四倍体细胞峰和15%的超二倍体细胞（S期细胞），并伴有G0/G1峰的CV9%，诊断为癌。(3)无明显的非整倍体细胞峰，但G0/G1峰CV值增大，并伴有10%15%超二倍体细胞和一个突出的四倍体峰，诊断为可疑癌。为治疗方案和药理学研究提供依据不同类型的肿瘤对化疗药物的敏感性不同。可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白（P-gp）亲脂化合物，包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性排出泵。从人淋巴细胞排除荧光染料与细胞内P-gp的含量直接相关。当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时，患者对化疗药物开始出现耐药性，需要考虑其他治疗方式。FCM可精确定量DNA含量,能对早期癌变的检出、癌前病变及病变的性质、癌变的发展趋势、化疗指导以及预后评估做出判断