课题课题2 2土壤中分解土壤中分解(fnji)(fnji)(fnji)(fnji)尿素的细菌尿素的细菌的分离与计数的分离与计数专题专题(zhunt)(zhunt)(zhunt)(zhunt)2 2微生物的培养与应用微生物的培养与应用第一页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).一、课题一、课题(kt)(kt)(kt)(kt)背景背景1 1、尿素尿素(nio s)(nio s)(nio s)(nio s)的利的利用用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能(cinng)(cinng)(cinng)(cinng)被植物利用。被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶脲酶CO(NHCO(NH2 2) )2 2脲酶脲酶+ H+ H2 2O O+ CO+ CO2 2NHNH3 3第二页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).3 3、常见、常见(chn jin)(chn jin)(chn jin)(chn jin)的分解尿素的微生物的分解尿素的微生物芽孢芽孢(y bo)(y bo)(y bo)(y bo)杆菌杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌。某些真菌和放线菌。4 4、课题、课题(kt)(kt)(kt)(kt)目的目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照第三页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课). 1 1、实例、实例(shl)(shl)(shl)(shl)：启示启示(qsh)(qsh)(qsh)(qsh)：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。原因原因：因为热泉：因为热泉(r qun)(r qun)(r qun)(r qun)温度温度707080800 0C C，淘汰了绝大多，淘汰了绝大多 数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应是一种多聚酶链式反应是一种在体外将少量在体外将少量DNADNA大量复制大量复制的技术，此项技术要求使用的技术，此项技术要求使用耐高温（耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合聚合酶酶。第四页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课). 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；营养、生理、生长条件等；方法：方法：方法：方法：抑制大多数微生物不能生长抑制大多数微生物不能生长抑制大多数微生物不能生长抑制大多数微生物不能生长造成有利于该菌生长的环境造成有利于该菌生长的环境造成有利于该菌生长的环境造成有利于该菌生长的环境结果：结果：结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板(pngbn)(pngbn)(pngbn)(pngbn)稀释稀释稀释稀释等方法对它进行纯化培养分离。等方法对它进行纯化培养分离。等方法对它进行纯化培养分离。等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选、实验室中微生物的筛选(shixun)(shixun)原理：原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件人为提供有利于目的菌株生长的条件人为提供有利于目的菌株生长的条件人为提供有利于目的菌株生长的条件( (包括包括包括包括(boku)(boku)营养、营养、营养、营养、温度、温度、温度、温度、pHpH等等等等) )，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。第五页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌、土壤中分解尿素的细菌(xjn)(xjn)(xjn)(xjn)的分离与计数所需的分离与计数所需培养基：培养基：从物理性质从物理性质(wl xngzh)(wl xngzh)(wl xngzh)(wl xngzh)看此培养基属于哪类看此培养基属于哪类？固体固体(gt)(gt)(gt)(gt)培养基培养基第六页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).在此培养基中哪些在此培养基中哪些(nxi)(nxi)(nxi)(nxi)作为碳源、氮源？作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素(nio s)(nio s)(nio s)(nio s) 氮源：尿素氮源：尿素(nio s)(nio s)(nio s)(nio s)思考思考2该培养基对微生物该培养基对微生物 （具有，（具有，不具有）选择作用。如果不具有）选择作用。如果(rgu)具有，其选具有，其选择机制是择机制是 。具有具有只有能够以尿素作为只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在氮源的微生物才能在该培养基上生长该培养基上生长第七页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课). 培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以才能分解尿素，以尿素尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制殖，而受到抑制(yzh)(yzh)(yzh)(yzh)，所以用此培养基就能够选择，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。出分解尿素的微生物。4 4、培养基选择分解尿素、培养基选择分解尿素(nio s)(nio s)(nio s)(nio s)的微生物的原理的微生物的原理第八页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).1 1、显微镜直接、显微镜直接(zhji)(zhji)(zhji)(zhji)计计数：数： 利用血球计数板，在显微镜下计算利用血球计数板，在显微镜下计算(j sun)(j sun)(j sun)(j sun)一定容一定容积里样品中微生物的数量。积里样品中微生物的数量。（二）（二）.统计菌落统计菌落(jnlu)(jnlu)数目：数目： 不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点第九页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).（比例（比例(bl)计数计数法）法）待测样品待测样品(yngpn)等量等量(dn lin)的已知含量的红细的已知含量的红细胞胞 混匀混匀涂抹涂抹测定：测定： 红细胞数目红细胞数目细菌数目细菌数目计算单位体积内的细菌数目计算单位体积内的细菌数目 将含已知数目的红细胞液体与待测的菌液按将含已知数目的红细胞液体与待测的菌液按1：1均匀混均匀混合，在显微镜下数出各自的数目，然后求菌液中的细胞数目。合，在显微镜下数出各自的数目，然后求菌液中的细胞数目。细菌细菌红细胞红细胞【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。第十页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).举例：已知红细胞浓度举例：已知红细胞浓度(nngd)为为M个个/mL，从，从体积为体积为N mL的大肠杆菌培养液中取出大杆菌液的大肠杆菌培养液中取出大杆菌液与红细胞液等量均匀混合后，涂片，染色，镜与红细胞液等量均匀混合后，涂片，染色，镜检。在同一视野中发出有红细胞检。在同一视野中发出有红细胞W个，大肠杆菌个，大肠杆菌Y个，求个，求NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X是多少？是多少？XNM YW(个个)观察观察(gunch)到的红细胞平均数到的红细胞平均数/观察观察(gunch)到的细菌平均数到的细菌平均数红细胞含量红细胞含量/细菌含量细菌含量 公公 式式 第十一页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法） 原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落基上所形成的一个菌落(jnlu)(jnlu)(jnlu)(jnlu)是由一个单细胞繁殖而是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落成的，即一个菌落(jnlu)(jnlu)(jnlu)(jnlu)代表原先的一个单细胞。代表原先的一个单细胞。 常用方法：常用方法：稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M其中，其中，C C代表代表(dibio)(dibio)(dibio)(dibio)某一稀释度下平板上生长的平某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表代表(dibio)(dibio)(dibio)(dibio)涂布平板时所用的稀释液涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表代表(dibio)(dibio)(dibio)(dibio)稀释倍数。稀释倍数。第十二页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).注意事项注意事项为了保证为了保证(bozhng)(bozhng)(bozhng)(bozhng)结果准确，一般选择菌落数在结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板的平板上进行计数。上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或同一稀释度加到三个或三个以上的平皿三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均中，经涂布，培养计算出菌落平均数。数。统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目低低。恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键，一一般以三个稀释度中的般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落第二个稀释度所出现的平均菌落数在数在5050个左右为最好个左右为最好。第十三页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).如何从平板上的菌落数推测如何从平板上的菌落数推测(tuc)出每克样出每克样品中的菌落数？品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好(zu ho)能统计能统计3个平板，计算出平板菌落数的平个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算均值，然后按课本旁栏的公式进行计算教材教材(jioci)P22第十四页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).计数法计数法直接直接(zhji)(zhji)(zhji)(zhji)计数法、计数法、平板计数法、平板计数法、比浊法、比浊法、膜过滤法膜过滤法第十五页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).实例实例(shl)分析分析P22 你认为哪个同学的结果更接近真实值你认为哪个同学的结果更接近真实值？ 你认为这两位同学的实验需要改进吗？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果如果(rgu)需要，如何改进？需要，如何改进？第十六页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).实例实例(shl)分析分析P22 第一同学只涂布了一个平板，第一同学只涂布了一个平板，没有设置没有设置重复组，因此结果不具有重复组，因此结果不具有(jyu)说服力。说服力。 第二位同学考虑到设置重复组的问题，第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是涂布了三个平板，但是其中其中1个平板的计个平板的计数结果与数结果与2个相差太远，说明在操作过程个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值个平板的计数值用来求平均值。第十七页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课). 设置对照的设置对照的主要目的主要目的是是排除实验组中非测试排除实验组中非测试(csh)(csh)(csh)(csh)因因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。（三）（三）.设置设置(shzh)(shzh)对照：对照： 实例实例(shl)(shl)(shl)(shl)：教材：教材P23P23 原原因因：土土样样不不同同，培培养养基基污污染染或或操操作作失失误误(或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质)第十八页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).小结：通过这个事例可以小结：通过这个事例可以(ky)(ky)看出，实验结果要有看出，实验结果要有说服力，说服力，对照的设置是必不可少的对照的设置是必不可少的。方案方案(fng n)(fng n)一：由其他同学用与一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：将方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况同学配制的培养基在不加土样的情况下进行下进行(jnxng)(jnxng)培养，作为空白对照，以证明培养基是培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：如果结果与结果预测：如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；如无误；如果结果不同，则证明果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配同学存在操作失误或培养基的配制有问题。制有问题。第十九页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).菌落计数菌落计数配制土壤配制土壤溶液溶液系列稀释系列稀释涂布平板涂布平板与培养与培养根据图示根据图示27填写以下填写以下(yxi)实验流程：实验流程：试验试验(shyn)(shyn)设设计：计：第二十页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课). 实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃从肥沃(fiw)(fiw)、湿润的土壤中取样。先铲去表层土、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。灭菌。.制备培养基：制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。第二十一页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课). 准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择选择(xunz)(xunz)培养基培养基将将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照对照，用来判断，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为泛的范围：稀释倍数为10103 310107 7。每个稀释度下需要。每个稀释度下需要3 3个个选择培养基，选择培养基，1 1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要要1515个选择培养基，个选择培养基，5 5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备还需要准备8 8个个灭菌的试管和灭菌的试管和1 1个个灭菌的移液管。灭菌的移液管。第二十二页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).应在火焰应在火焰应在火焰应在火焰(huyn)(huyn)(huyn)(huyn)旁称取土壤旁称取土壤旁称取土壤旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释分离不同的微生物采用不同的稀释(xsh)(xsh)(xsh)(xsh)度度原因：原因：不同微生物在土壤中含量不同不同微生物在土壤中含量不同目的：目的：保证获得菌落数在保证获得菌落数在3030300300之间、适于计数之间、适于计数的平板的平板 三三三三 样样样样品品品品(yngpn)(yngpn)的的的的稀稀稀稀释释释释第二十三页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课). 由于初次由于初次(ch c)(ch c)实验，对于稀释的范围没有把握，实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为10103 310107 7。每个稀释度下需要。每个稀释度下需要3 3个个选择培养基，选择培养基，1 1个牛肉膏蛋个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要白胨培养基，因此共需要1515个选择培养基，个选择培养基，5 5个牛肉膏蛋个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备白胨培养基。此外，还需要准备8 8个个灭菌的试管和灭菌的试管和1 1个个灭灭菌的移液管。菌的移液管。第二十四页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课). 为为什什么么分分离离不不同同的的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测测定定土土壤壤(trng)(trng)中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤(trng)(trng)中中能能分分解解尿尿素素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原原因因：土土壤壤中中各各类类微微生生物物的的数数量量（单单位位：株株/kg/kg）是是不不同同的的。例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 185185万万，放放线线菌菌数数约约为为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。结结论论：为为获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针针对对性性地地提提供供选选择择(xunz)(xunz)(xunz)(xunz)培养的条件。培养的条件。第二十五页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课). .取样取样(qyng)(qyng)涂布涂布实验时要对实验时要对培养培养(piyng)(piyng)皿作皿作好标记。注明好标记。注明培养培养(piyng)(piyng)基类基类型、培养型、培养(piyng)(piyng)时间、稀释度、时间、稀释度、培养培养(piyng)(piyng)物等。物等。 如果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2 2 2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300303003030030300的平板，则的平板，则的平板，则的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数倍数倍数倍数(bish)(bish)(bish)(bish)的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。重新实验。重新实验。重新实验。第二十六页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).微生物的培养与观察微生物的培养与观察(gunch)(gunch)并计数并计数 在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止，以防止 因培养时间不足因培养时间不足(bz)(bz)(bz)(bz)而导致遗漏菌落的数目。而导致遗漏菌落的数目。 培养培养(piyng)(piyng)(piyng)(piyng)不同微生物往往需要不同培养不同微生物往往需要不同培养(piyng)(piyng)(piyng)(piyng)温度。温度。 细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d 放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d 霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。第二十七页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课). 当菌落数目稳定时，选取菌落数在当菌落数目稳定时，选取菌落数在3030300300的平板的平板(pngbn)(pngbn)进行计数。在同一稀释度下，至进行计数。在同一稀释度下，至少对少对3 3个平板个平板(pngbn)(pngbn)进行重复计数，然后求出平进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板均值，并根据平板(pngbn)(pngbn)所对应的稀释度计算所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。出样品中细菌的数目。 第二十八页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).微微生生物物的的培培养养(piyng)(piyng)与观察与观察第二十九页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).第三十页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课). 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌都是区分细菌(xjn)的重要手段。的重要手段。 第三十一页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课). 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分等等，都是区分(qfn)细菌的重要手段。细菌的重要手段。 第三十二页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课). 关注关注(gunzh)菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。质地等等，都是区分细菌的重要手段。 第三十三页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课). 关注关注(gunzh)菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。质地等等，都是区分细菌的重要手段。 第三十四页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课). 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色(yns)、质地等、质地等等，都是区分细菌的重要手段。等，都是区分细菌的重要手段。 第三十五页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).思考在研究未知微生物时务必规范思考在研究未知微生物时务必规范(gufn)操作，操作，以防被以防被致病微生物致病微生物感染，实验后一定要洗手。感染，实验后一定要洗手。第三十六页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).（六）鉴定（六）鉴定：筛选后必鉴定：筛选后必鉴定 鉴别鉴别培养基培养基：加入某种指示剂或化学药品，加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存不影响微生物的生存1 1、酚红培养基：、酚红培养基： 鉴定分解鉴定分解(fnji)(fnji)尿素的细菌。尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨原理：脲酶催化尿素分解成氨培培养基碱性增强养基碱性增强 酚红变红酚红变红脲酶阳性脲酶阳性2 2、伊红、伊红美蓝培养基：美蓝培养基： 鉴定大肠杆菌。鉴定大肠杆菌。 原理：代谢产物与伊红原理：代谢产物与伊红美蓝结合美蓝结合 菌落呈深紫色并带有金属光泽。菌落呈深紫色并带有金属光泽。第三十七页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).伊红伊红美蓝培养基美蓝培养基是鉴别培养基，可以是鉴别培养基，可以(ky)用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的的代谢产物与伊红代谢产物与伊红美蓝结合美蓝结合，使菌落呈，使菌落呈深紫深紫色并带有金属光泽色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。生物的生长。例如：鉴别例如：鉴别(jinbi)大肠杆菌培养基大肠杆菌培养基第三十八页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)呈呈 黑色中心黑色中心 , ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)(d chn n jn)在伊红美蓝琼脂在伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 第三十九页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).三、操作三、操作(cozu)(cozu)提示提示 无菌操作无菌操作(cozu)(cozu) 做好标记做好标记(bioj)(bioj) 制定计划制定计划 第四十页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).课题成果课题成果(chnggu)与评价与评价 （一）培养物中是否有杂菌污染以（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择及选择(xunz)(xunz)培养基是否筛选出菌落培养基是否筛选出菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选，说明选择培养基已筛选择培养基已筛选(shixun)出一些菌落。出一些菌落。第四十一页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).如果学生选取的是同一种土样，统计的结果如果学生选取的是同一种土样，统计的结果(ji (ji gu)gu)应该接近。如果结果应该接近。如果结果(ji gu)(ji gu)相差太远，需要进一步相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。分析产生差异的原因。（二）样品的稀释操作是否（二）样品的稀释操作是否(sh fu)成功成功 如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上个以上(yshng)(yshng)菌落数目在菌落数目在3030300300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。进行菌落的计数。 （三）重复组的结果是否一致（三）重复组的结果是否一致第四十二页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).本课题本课题(kt)(kt)(kt)(kt)知识小结知识小结: :第四十三页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).课后练习课后练习2.提示：反刍动物提示：反刍动物(fn ch dn w)的瘤胃中含有大的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌厌氧菌的培养氧菌的培养方法进行实验设计。方法进行实验设计。第四十四页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).六、例题六、例题(lt)解析解析 例例1 1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是对细菌群体生长规律测定的正确的表述是A A在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B B至少接种一种至少接种一种(y zhn)(y zhn)细菌细菌 C C接种一个细菌接种一个细菌 D D及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争(du zhng)而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。答案：答案：A A第四十五页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ） A. A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B. B.至少至少(zhsho)(zhsho)接种一种细菌接种一种细菌 C. C.接种一个细菌接种一个细菌 D. D.及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 2.2.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（ ） A. A.培养细菌培养细菌 B. B.培养真菌培养真菌 C. C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D. D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ( ) ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.CO C.CO2 2和尿素和尿素 D. D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践实践(shjin)(shjin)训练训练A A C CD D第四十六页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).4.4.下列说法不正确下列说法不正确(zhngqu)(zhngqu)的是（的是（ ） A. A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚合聚合酶酶 B. B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C. C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D. D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。多。5.5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（） A. A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B. B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C. C.青霉素类药物青霉素类药物 D. D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C第四十七页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).（09，宁夏，宁夏，15分）分）（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_等优点，因此常作等优点，因此常作为为(zuwi)遗传学研究的实验材料。遗传学研究的实验材料。 （2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行_（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和_；静止空气中；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。 （3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_。 （4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的_。 （5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是用的检测方法是_。 （6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_处理后才能处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。丢弃，以防止培养物的扩散。答案答案:（1）温度）温度 酸碱度酸碱度 易培养易培养 生活周期短生活周期短 （2）灭菌）灭菌 消毒消毒 损伤损伤DNA的结构的结构 （3）比例合适）比例合适 （4）鉴定）鉴定(或分类或分类) （5）将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间）将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察观察(gunch)培养基上是否有菌落产生培养基上是否有菌落产生. （6）灭菌）灭菌第四十八页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).例例3 3（20052005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是 ，青霉素是青霉菌的，青霉素是青霉菌的 代谢代谢(dixi)(dixi)产物。产物。在生产和科研中，常选用处于在生产和科研中，常选用处于 期的青霉菌作期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛， 和和 比较稳定。比较稳定。对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，经离心分离、反复洗涤后， ，再计算发酵，再计算发酵罐中菌体的总重量。罐中菌体的总重量。异养需氧型异养需氧型次级次级(c j)对数对数(du sh)个体的形态个体的形态生理特性生理特性称菌体的湿重称菌体的湿重 （称烘干后的重量）（称烘干后的重量）第四十九页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).解析：解析：青霉菌属于真菌，其代谢类型应为异养需氧型，而青霉青霉菌属于真菌，其代谢类型应为异养需氧型，而青霉素作为它的代谢产物，并不是它生长、繁殖所必需的，所素作为它的代谢产物，并不是它生长、繁殖所必需的，所以青霉素应属于次级代谢产物。在测定培养基上青霉菌菌以青霉素应属于次级代谢产物。在测定培养基上青霉菌菌体的生长情况时，常用的方法有两种：一种是测量青霉菌体的生长情况时，常用的方法有两种：一种是测量青霉菌的细胞数目，另一种是测重量，取一定体积的发酵液，经的细胞数目，另一种是测重量，取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，离心分离、反复洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，再由此计算出其中的细胞总重量。在细菌再由此计算出其中的细胞总重量。在细菌(xjn)生长的四个生长的四个主要时期中，因为处于对数期的细菌主要时期中，因为处于对数期的细菌(xjn)代谢旺盛，个体代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定，常作为生产用的菌种和科研的形态和生理特性比较稳定，常作为生产用的菌种和科研的材料。的材料。第五十页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).内容(nirng)总结课题2。DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术(jsh)，此项技术(jsh)要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落。对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ）。解析：第五十一页，共五十一页。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课).