叶绿素荧光原理与应用光合作用过程简介叶绿素吸收光能的去向光合机构吸收的光能有三个可能的去向：光合机构吸收的光能有三个可能的去向： 一一、光光化化学学反反应应, ,引引起起反反应应中中心心的的电电荷荷分分离离及及后后来来的的电电子子传传递递和和光光合合磷磷酸酸化化, ,形形成成用用于于固固定定、还还原原二二氧氧化化碳的同化力碳的同化力( (ATPATP和和NADPH),NADPH),氮素还原，光呼吸等。氮素还原，光呼吸等。 二、转变成热散失；二、转变成热散失； 三、以荧光的形式发射出来。三、以荧光的形式发射出来。 由由于于这这三三者者之之间间存存在在此此消消彼彼长长的的相相互互竞竞争争关关系系, ,所所以可以通过荧光的变化探测光合作用的变化以可以通过荧光的变化探测光合作用的变化( (图图1)1)。实实际际上上, ,以以荧荧光光形形式式发发射射出出来来的的光光能能在在数数量量上是很少的上是很少的, ,还不到吸收的总光能的还不到吸收的总光能的3%3%。 在在很很弱弱的的光光下下, ,光光合合机机构构吸吸收收的的光光能能大大约约97%97%被被用用于于光光化化学学反反应应,2.5%,2.5%被被转转变变成成热散失热散失,0.5%,0.5%被变成荧光发射出来；被变成荧光发射出来； 在在很很强强的的光光下下，当当全全部部PSIIPSII反反应应中中心心关关闭闭时时，吸吸收收的的光光能能95%95%97%97%被被变变成成热热，而而2.5%2.5%5.0%5.0%被变成荧光发射。被变成荧光发射。调制式荧光仪的作用原理 调制光用于叶绿素荧光测定和猝灭分析是调制光用于叶绿素荧光测定和猝灭分析是荧光测定的一个革命性进展。在这样的系荧光测定的一个革命性进展。在这样的系统中，用于测定荧光的光源被调制，也就统中，用于测定荧光的光源被调制，也就是使用以很高频率不断开关的光源。在这是使用以很高频率不断开关的光源。在这样的系统中，检测器选择性放大，仅仅检样的系统中，检测器选择性放大，仅仅检测被调制光激发的荧光，就可以在田间条测被调制光激发的荧光，就可以在田间条件下，即在田间很强的太阳光存在的情况件下，即在田间很强的太阳光存在的情况下测定相对的荧光产额。下测定相对的荧光产额。调调制制荧荧光光技技术术把把作作用用光光信信号号与与荧荧光光信信号号区区分分开开，在在测测定定时时，给给植植物物材材料料施施加加一一个个脉脉冲冲调调制制光光束束，该该脉脉冲冲光光使使植植物物叶叶片片产产生生一一个个脉脉冲冲的的荧荧光光信信号号，当当有有自自然然光光存存在在时时，检检测测到到由由脉脉冲冲调调制制光光束束诱诱导出的脉冲荧光信号。导出的脉冲荧光信号。 脉脉冲冲荧荧光光信信号号的的大大小小可可以以反反映映出出叶叶片片生生理理状状况况，由由脉脉冲冲调调制制光光束束诱诱导导出出的的脉脉冲冲荧荧光光信信号号作作为为光光系统系统IIII光能利用效率大小的探针。光能利用效率大小的探针。叶绿素荧光诱导动力学l当一片经过充分暗适应的叶片从黑当一片经过充分暗适应的叶片从黑暗中转入光下后，叶片的荧光产额暗中转入光下后，叶片的荧光产额会随时间发生规律性的变化，即会随时间发生规律性的变化，即kautskykautsky效应效应，典型荧光诱导动力学，典型荧光诱导动力学曲线上几个特征性的点分别被命名曲线上几个特征性的点分别被命名为为O O、I I、D D、P P、S S、M M和和T T叶绿素荧光诱导动力学曲线 在在照照光光的的第第一一秒秒钟钟内内，荧荧光光水水平平从从O O上上升到升到P,P,这一段被称为快相；这一段被称为快相； 在在接接下下来来的的几几分分钟钟内内，荧荧光光水水平平从从P P下下降到降到T T，这一段被称为慢相。这一段被称为慢相。 快快相相与与PSIIPSII的的原原初初过过程程有有关关，慢慢相相则则主主要要与与类类囊囊体体膜膜上上和和间间质质中中的的一一些些反反应应过程包括碳代谢之间的相互作用有关。过程包括碳代谢之间的相互作用有关。荧光测定和猝灭分析需要几种不同的光源：荧光测定和猝灭分析需要几种不同的光源：1.1.检检 测测 光光 （ 调调 制制 光光 ） 绿绿 光光 ： 光光 强强 PPFDPPFD小小 于于1010 molmol mm-2-2 s s-1-1，用于测用于测FoFo。2.2.作作用用光光通通常常用用白白光光，用用于于推推动动光光合合作作用用的的光光化学反应，光强可因实验目的不同而变化。化学反应，光强可因实验目的不同而变化。3.3.饱饱 和和 脉脉 冲冲 光光 通通 常常 用用 白白 光光 ， 光光 强强 PPFDPPFD大大 于于30003000 molmol mm-2-2 s s-1-1，确确保保Q QAA全全部部还还原原，用用于于测测FmFm和和FmFm。4.4.弱弱远远红红光光（或或暗暗）以以便便PSIPSI推推动动Q QAA氧氧化化，测测FoFo 前使用。前使用。 测定与分析基本步骤 在植物对各种环境胁迫响应的分子机理研究中，为了获得未遭受任何环境胁迫的对照叶片的基本荧光参数，首先需要让对照叶片经过一个充分的暗适应过程。 首先，给一个经过充分暗适应的叶片照射检测光，经过一小段时间（12min）荧光水平稳定后得到荧光参数Fo。接着，给一个饱和脉冲光，一个脉冲后关闭 ， 得 到 荧 光 参 数 Fm， 于 是 得 到 荧 光 参 数Fv/Fm(Fv=Fm-Fo)，即潜在的PS II的光化学效率叶片荧光的暗光适应曲线 荧光猝灭 荧荧光光猝猝灭灭就就是是荧荧光光产产额额降降低低。一一切切使使荧荧光光产产额额低低于于其其最最大大值值的的过过程程，都都被被称称为为荧荧光光猝猝灭灭过过程程。对对于于不不同同荧荧光光猝猝灭灭组组分分的的分分辨辨，能能够够提提供关于光合机构功能状态的重要资料。供关于光合机构功能状态的重要资料。 荧光猝灭可分两类：荧光猝灭可分两类： 一一、光光化化学学猝猝灭灭，即即由由光光化化学学反反应应引引起起的的荧光产额的降低，它有赖于氧化态荧光产额的降低，它有赖于氧化态Q QA A的存在。的存在。 二二、非非光光化化学学猝猝灭灭，即即由由非非光光化化学学过过程程，例例如如热热耗耗散散过过程程引引起起的的荧荧光光产产额额的的降降低低。它它是是植物体内光合量子效率调节的一个重要方面。植物体内光合量子效率调节的一个重要方面。 非光化学猝灭涉及三个不同的机理：非光化学猝灭涉及三个不同的机理：qEqE依依赖赖类类囊囊体体膜膜内内外外的的质质子子浓浓度度差差，暗暗弛弛豫豫的的半半时时间间t t1/21/21min1min，快相。快相。qTqT依依赖赖状状态态1 1向向状状态态2 2的的转转换换，PS PS IIII的的捕捕光光复复合合体体磷磷酸酸化化，脱脱离离PS PS IIII，从从类类囊囊体体的的基基粒粒区区迁迁移移到到间间质质片片层层区区，从从而而减减少少激激发发能能向向PS PS IIII的的分分配配，增增加加激激发发能能向向PS PS I I的的分分配配，t t1/21/2=8min=8min，中中间相。它比间相。它比qEqE和和qIqI小得多，强光下小得多，强光下qEqE和和qIqI增加，而增加，而qTqT受抑制。受抑制。qIqI与与光光合合作作用用的的光光抑抑制制有有关关，可可变变荧荧光光与与最最大大荧荧光光比比值值的的降降低低，t t1/21/2=40min=40min，慢慢相相。关关于于这这后后一一种种非非光光化化学学猝猝灭灭，有有三三种种假假说说。假假说说一一：这这种种非非光光化化学学荧荧光光猝猝灭灭起起源源于于PS PS IIII的的反反应应中中心心，部部分分PS PS IIII中中心心发发生生变变化化，虽虽然然还还能能捕捕捉捉激激发发能能，但但不不能能进进行行光光化化学学反反应应，而而把把能能量量变变成成热热。假假说说二二：这这种种非非光光化化学学荧荧光光猝猝灭灭起起源源于于PS PS IIII的的天天线线色色素素，它它通通过过非非辐辐射射能能量量耗耗散散消消耗耗激激发发能能，与与叶叶黄黄素素循循环环过过程程中中生生成成的的玉玉米米黄黄素素有有关关。假假说说三三：这这种种非光化学荧光猝灭与非光化学荧光猝灭与D1D1蛋白的失活和降解有关蛋白的失活和降解有关 荧光参数 关关于于各各种种荧荧光光参参数数的的命命名名和和定定义义，在在不不同同时时期期和和不不同同作作者者的的文文章章中中很很不不一一致致。不不同同的的资资料一定对应荧光动力学曲线理解。料一定对应荧光动力学曲线理解。2.1 基础参数Fo有有多多种种名名称称，最最小小（minimal）、基基底底（ground）、暗暗 （ dark） 、 初初 始始 （ initial） 和和 不不 变变 （ un-changed,constant）荧荧光光强强度度等等。它它是是已已经经暗暗适适应应的的光光合合机机构构全全部部PSII中中心心都都开开放放时时的的荧荧光光强强度度，qP=1，qN=0。绝大部分学者都认为，绝大部分学者都认为，Fo荧光来自天线叶绿素荧光来自天线叶绿素aFi荧光诱导动力学曲线荧光诱导动力学曲线O-I-D-F-T中中I水平的荧光强度水平的荧光强度Fp荧光诱导动力学曲线荧光诱导动力学曲线O-I-D-P-T中中P水平的荧光强度水平的荧光强度Fs荧光诱导动力学曲线荧光诱导动力学曲线O-I-D-P-T中中T水平的荧光强度水平的荧光强度Fm黑黑暗暗中中最最大大（maximum）荧荧光光，它它是是已已经经暗暗适适应应的的光光合合机机构构全全部部PSII中中心心都都关关闭闭时时的的荧荧光光强强度度，qP=0。这这时时所所有有的的非非光光化化学学过过程程都都最最小小，qN=0，这这是是标标准准的的最最大大荧光。荧光。 Fm光下最大荧光，在光适应状态下全部PSII中心都关闭时的荧光强度，qp=0，qNO。Fm受非光化学猝灭的影响，而不受光化学猝灭的影响。 Fo光下最小荧光，在光适应状态下全部PSII中心都开放时的荧光强度，qp=1，qN0。为了使照光后所有的PSII中心都迅速开放，一般在照光后和测定前应用一束远红光（波长大于680nm，使用的波长735nm，几秒钟）。 Fv黑暗中最大可变（variable）荧光强度，Fv=Fm-Fo。 Fv光下最大可变荧光强度， Fv=Fm-Fo。 表明PSII光化学效率的参数Fv/Fm没有遭受环境胁迫并经过充分暗适应的植物叶片PSII最大的或潜在的量子效率指标，它是比较恒定的，一般在0.800.85之间。有时，Fv/Fm也被称为开放的PSII反应中心的能量捕捉效率。Fv/Fo 是 Fv/Fm的 另 一 种 表 达 方 式 ，Fv/Fo=(Fv/Fm)/(1-Fv/Fm)。Fv/Fo不是一个直接的效率指标，但是它对效率的变化很敏感，一些处理引起的Fv/Fo变化的幅度比Fv/Fm变化的幅度大得多，所以Fv/Fo在一些情况下是表达资料的好形式。此外，Fm/Fo也是Fv/Fm的另一种表达方式，因为Fm/Fo=(Fv+Fo)/Fo=Fv/Fo+1。 (Fm-Fs)/Fm作用光存在时PSII的实际的量子效率(PSII)，即PSII反应中心电荷分离的实际的量子效率。 Fs是稳态荧光水平，Fm是在作用光存在时一个饱和光脉冲激发的荧光水平。计算这个参数不需要准确测定Fo，不受Fo变化的影响。PSII实际的电子传递的量子效率这个参数PSII=(Fm-Fs)/Fm不仅与碳同化有关，也与光呼吸及依赖O2的电子流有关。 由于PSII是PSII光化学反应的量子效率，所以可以利用它计算非循环电子传递速率（ETR）以及体内的总光合电子传递能力： ETR=PSIIPFDa0.5 PFDa是被吸收的光通量密度(光合有效辐射molm-2s-1)，0.5代表光能在两个光系统间的分配系数。如果假设入射到叶片表面的光能平均有84%被叶片吸收，并且平均分配给两个光系统，则上式可以写成： ETR=PSIIPFD0.840.5。 Fv/Fm开放的PSII反应中心的激发能捕获效率，也称谓PSII天线效率。可以计算某PFD下量子效率的相对限制或光合功能的相对限制L(PFD) ： L(PFD)=1-(qpFv/Fm)/0.83。0.83是最适量子效率，qp的最适值是l。由此式可以看到，限制来自qp和Fv/Fm的降低。只有当qp=1和Fv/Fm=0.83时，L(PFD)=0，即不存在限制。 使用Fv/Fm可以来估以下指标： 光化学反应相对份额 P=Fv/Fmqp, 天线热耗散的相对份额D=1-Fv/Fm。 热耗散的速率为(1-Fv/Fm)PFD。荧光猝灭参数 qp=(Fm-Fs)/(Fm-Fo)，光化学猝灭系数。这里，(Fm-Fs)代表光化学猝灭的荧光。qp是表示PSII开放的反应中心所占比例，而1-qp则是关闭的反应中心所占比例，反映QA的还原程度，有时被称为PSII的激发压。 氧化态的QA是PSII电子传递的原初醌受体，它决定PSII的激发能捕获速率，所以光化学猝灭也被称为Q猝灭。 qp和 Fv/Fm、 PSII之 间 有 如 下 关 系 ：Fv/Fm=PSII/qp。 qN=1-(Fm-Fo)/(Fm-Fo)=1-Fv/Fv。实际上，qN是一个定量非光化学猝灭的旧术语，它的计算以测定Fo和Fo为前提，而Fo和Fo的测定不准确会造成计算结果的偏差。 NPQ=(Fm-Fm)/Fm=Fm/Fm-1。 这 里（Fm-Fm）代表非光化学猝灭的荧光。NPQ的变化反映热耗散的变化。这个计算不需要测定Fo和Fo，但是必须测定一个充分暗适应叶片的参比值Fm，最好是经过一个夜晚暗适应的黎明时刻的Fm值，这时光化学效率最大，而热耗散最小。