单个核细胞的分离单个核细胞的分离实验目的 1熟悉免疫细胞分离的常用方法。 2掌握外周血单个核细胞分离方法的原理、操作规程。 免疫系统免疫系统 免疫器官免疫器官 免疫细胞免疫细胞 免疫分子免疫分子外周血细胞成分外周血细胞成分淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞粒细胞粒细胞红细胞和血小板红细胞和血小板不同细胞密度不同不同细胞密度不同人的红细胞密度为人的红细胞密度为 粒细胞密度为粒细胞密度为 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 血小板：血小板：细胞分离基本原理细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞表面分化抗原不同人外周血单个核细胞（人外周血单个核细胞（peripheral blood peripheral blood mononuclear cellmononuclear cell，PBMCPBMC）包括淋巴细胞和单核）包括淋巴细胞和单核细胞细胞, ,是免疫学实验中常用的细胞群。是免疫学实验中常用的细胞群。 【实验原理】 人外周血单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。因此利用一种介于之间而近于等渗的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque 比重比重 1.0770.001 ）混合分离液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。从而分离出PBMC。Ficoll分层液分层液聚蔗糖聚蔗糖-泛影葡胺泛影葡胺:商品名为商品名为Ficoll ,其密度为其密度为1。 主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。种单次差速密度梯度离心的分离法。 其主要成分其主要成分:2份浓度为浓度为6、密度为密度为1.020 g/L聚蔗糖聚蔗糖(商品名为商品名为Ficoll )与与1份浓度为浓度为34、密度为密度为1.200 g/L泛影葡胺水溶液混合。泛影葡胺水溶液混合。用的分层液可将细胞分离用的分层液可将细胞分离 密度梯度离心密度梯度离心(Ficoll)(Ficoll)离心离心试剂与器材试剂与器材1.标标 本本 外外 周周 静静 脉脉 血血 加加 EDTA-K2抗抗 凝凝 ， 或或1000U/ml肝素抗凝血。肝素抗凝血。2.淋淋巴巴细细胞胞分分离离液液（聚聚蔗蔗糖糖-泛泛影影葡葡胺胺，比比重重）有商品供应。有商品供应。3.Hanks液液5.器材器材 水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。 操作方法操作方法1.取取静静脉脉血血放放入入抗抗凝凝管管，摇摇匀匀，先先作作白白细细胞胞计计数数，然然后后取加入等量取加入等量Hank液，混匀。液，混匀。 Ficoll分分离离液液置置于于灭灭菌菌离离心心管管内内，用用毛毛细细吸吸管管将将稀稀释释血血液液3ml沿沿管管壁壁徐徐徐徐加加入入离离心心管管，使使稀稀释释血血液液重重叠叠于于淋淋巴巴细细胞胞分分离离液液上上（分分层层液液与与稀稀释释血血液液体体积积比比例例为为1：2），二者之间有一明显的界面。二者之间有一明显的界面。 3.用水平离心机以用水平离心机以2000r/min离心离心20min，离心离心后管内容物分为四层，上层为血浆（内含血小后管内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分离液，底层为红细胞和多形板），中间层为分离液，底层为红细胞和多形白细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色白细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层浑浊的单个核细胞层4.用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘吸取该层单个核细胞，移入吸取该层单个核细胞，移入EP管，管，2000r /min 5min离心去血浆，离心去血浆，加加 1mlHanks混匀，混匀，2000r/min离心离心5min，弃上弃上清液清液。5.末末次次离离心心后后，吸吸尽尽上上清清后后，将将细细胞胞悬悬液液体体积积用用Hanks还还原原至至1ml，取取一一滴滴细细胞胞悬悬液液置置血血细细胞计数板内计数，计算单个核细胞的回收率。胞计数板内计数，计算单个核细胞的回收率。100%单个核细胞回收率单个核细胞回收率= 分离后细胞悬液分离后细胞悬液ml每毫升单个核细胞数每毫升单个核细胞数 全血全血ml数数全血中每毫升单个核细胞数全血中每毫升单个核细胞数单个核细胞数单个核细胞数1毫升细胞悬液毫升细胞悬液)4个大方格内细胞总数个大方格内细胞总数10 1032(稀释倍数稀释倍数) 4取取2滴细胞悬液与滴细胞悬液与1滴台盼蓝染液混匀，加盖玻滴台盼蓝染液混匀，加盖玻片，显微镜高倍镜观察。片，显微镜高倍镜观察。细胞活力百分率细胞活力百分率=蓝色细胞数蓝色细胞数/100个单个细胞数个单个细胞数结果判断结果判断活活细细胞胞不不着着色色，折折光光强强，由由于于染染料料可可渗渗入入死死亡亡细细胞胞被被染染成成蓝蓝色色，体体积积略略膨膨大大。正正常常情情况况下下，活细胞应在活细胞应在95%以上以上。实验讨论实验讨论1. 注意事项注意事项将稀释的血液加分层液上将稀释的血液加分层液上时，一定要细心，动作要轻，使分离液时，一定要细心，动作要轻，使分离液与血液的界面清楚，避免冲散分层液面与血液的界面清楚，避免冲散分层液面或与分层液混合影响分离结果。或与分层液混合影响分离结果。1 1为好；小鼠为为好；小鼠为1.088,1.088,而马则为而马则为1.0901.090。配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗，配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗，有缓冲作用，并对细胞无毒性有缓冲作用，并对细胞无毒性方法评价方法评价密密度度梯梯度度离离心心法法是是一一种种分分离离单单个个核核细细胞胞的的常常用用方法，方法，用该方法不能除去其中的单核细胞。用该方法不能除去其中的单核细胞。临床意义临床意义分分离离所所得得的的单单个个核核细细胞胞可可满满足足许许多多实实验验的的需需要要，可可用用于于细细胞胞的的分分类类鉴鉴定定，及及各各种种功功能能，也也可可用用于于进进一一步步纯纯化化淋淋巴巴细细胞胞，分分离离单单个个核核细细胞胞技技术术是进行细胞免疫试验的重要技术之一。是进行细胞免疫试验的重要技术之一。