分子生物学基本研究法（上）分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术第五章 扉页：扉页： 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀翅膀”，否，否则，你就不可能走在别人的前面。则，你就不可能走在别人的前面。RNA基本操作技术基本操作技术真真核核生生物物基基因因组组DNA庞庞大大，有有大大量量重重复复序序列列，很很难难直直接接分分离离得得到到靶靶基基因因片片段段。而而cDNA来来自自反反转转录录的的mRNA，无无冗冗余余序序列列，通通过过筛筛选选cDNA文文库库，可可较较快快地分离到相关基因。地分离到相关基因。5.3 RNA基本操作技术基本操作技术5.3.1 总总RNA的提取的提取5.3.2 mRNA的纯化的纯化5.3.3 cDNA的合成的合成5.3.4 cDNA文库的构建文库的构建5.3.5 基因文库的筛选基因文库的筛选5.3.1 总总RNA的提取的提取细胞中的总细胞中的总RNA包括：包括： mRNA 1%5% rRNA 80%85% tRNA sRNA15%20%Trizol总总RNA提取试剂提取试剂 TIANGEN rRNA电泳后的三条特征性条带电泳后的三条特征性条带28S、18S、5S (特别是特别是28S和和18S特征性条带特征性条带) 是鉴定总是鉴定总RNA纯度纯度和完整性的重要参数。和完整性的重要参数。RNA的抽提方法 1.1.实验室常用方法：实验室常用方法：实验室常用方法：实验室常用方法：异硫氰酸胍苯酚抽提法异硫氰酸胍苯酚抽提法异硫氰酸胍苯酚抽提法异硫氰酸胍苯酚抽提法 TrizolTrizol试剂：苯酚和异硫氰酸胍组成，可迅速破坏细试剂：苯酚和异硫氰酸胍组成，可迅速破坏细试剂：苯酚和异硫氰酸胍组成，可迅速破坏细试剂：苯酚和异硫氰酸胍组成，可迅速破坏细胞结构，释放细胞质及细胞核中的胞结构，释放细胞质及细胞核中的胞结构，释放细胞质及细胞核中的胞结构，释放细胞质及细胞核中的RNARNA，并使核糖，并使核糖，并使核糖，并使核糖体蛋白与体蛋白与体蛋白与体蛋白与RNARNA分子分离，还能保证分子分离，还能保证分子分离，还能保证分子分离，还能保证RNARNA的完整。的完整。的完整。的完整。 TrizolTrizol提取步骤：首先在液氮中研磨材料，匀浆，加提取步骤：首先在液氮中研磨材料，匀浆，加提取步骤：首先在液氮中研磨材料，匀浆，加提取步骤：首先在液氮中研磨材料，匀浆，加入入入入trizoltrizol试剂，再加入氯仿抽提，分离水相，异丙醇试剂，再加入氯仿抽提，分离水相，异丙醇试剂，再加入氯仿抽提，分离水相，异丙醇试剂，再加入氯仿抽提，分离水相，异丙醇沉淀。沉淀。沉淀。沉淀。RNA Extraction by TRIzol使用BioSpcetrometer分光光度计进行快速检测核酸mRNA Extraction from Cell CulturemRNA Extraction from Tissue2. 硅胶膜纯化柱法硅胶膜纯化柱法 将含有目的将含有目的RNA的细胞破碎液通过该的细胞破碎液通过该柱，柱，RNA吸附在硅胶膜上，然后在低盐浓吸附在硅胶膜上，然后在低盐浓度下可从硅胶上直接洗脱度下可从硅胶上直接洗脱RNA。RNA的浓度和纯度的判断：的浓度和纯度的判断： 可通过测定其可通过测定其OD260和和OD280 OD2601时，相当于浓度为时，相当于浓度为40g/mL，当，当OD260/OD2801.82.0时，说明时，说明RNA纯度纯度较好。较好。5.32. mRNA的纯化寡聚（寡聚（dT）纤维素柱色谱法：）纤维素柱色谱法：利用利用mRNA3端含有端含有PolyA+的特点，当的特点，当RNA流经寡聚流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，用下，mRNA被特异性地结合在柱上，再用被特异性地结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次此。经过两次此柱可得到较高纯度的柱可得到较高纯度的mRNA.Promega PolyAT tract mRNA 分离系统分分离系统分离多聚离多聚(A)mRNA。将用生物素标记的寡聚。将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的连的mRNA。图图5-14PolyATtractmRNA的分离的分离纯化过程简图。纯化过程简图。每个Oligotex Kit 包括用于结合poly A+ mRNA的Oligotex 树脂，和用于洗涤、洗脱结合的mRNA的离心柱。Oligotex mRNA Kits可从总RNA中纯化mRNA，回收poly A+体外转录子。Oligotex Direct mRNA Kits 可从细胞和组织中纯化mRNA。mRNA Extraction from Total RNA5.3.3 cDNA的合成cDNA（complementary DNA）：在体外以mRNA为模板，利用反转录酶和DNA聚合酶合成的一段双链DNA。图图图图5-15 5-15 cDNAcDNA合成过程合成过程合成过程合成过程示意图。示意图。示意图。示意图。 第一链第一链第一链第一链cDNAcDNA的合成：的合成：的合成：的合成：以以以以mRNAmRNA为模板，反转为模板，反转为模板，反转为模板，反转录成录成录成录成cDNAcDNA，由反转录酶，由反转录酶，由反转录酶，由反转录酶催化，需引物（常用催化，需引物（常用催化，需引物（常用催化，需引物（常用oligooligo dTdT）。）。）。）。 第二链第二链第二链第二链cDNAcDNA的合成：的合成：的合成：的合成：以第一链为模板，由以第一链为模板，由以第一链为模板，由以第一链为模板，由DNADNA聚合酶催化。聚合酶催化。聚合酶催化。聚合酶催化。图图图图5-16 5-16 cDNAcDNA合合合合成中的分子修饰。成中的分子修饰。成中的分子修饰。成中的分子修饰。cDNA 的合成5.3.4 cDNA文库的构建cDNA文库：文库：是指将某种生物体基因组转是指将某种生物体基因组转录的全部录的全部mRNAmRNA经反转录产生的经反转录产生的cDNAcDNA片段片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的菌中，该群体就称该生物基因组的cDNAcDNA文库。文库。构建构建构建构建cDNAcDNA文库的基本程序：文库的基本程序：文库的基本程序：文库的基本程序：mRNAmRNA的提取和纯化。的提取和纯化。的提取和纯化。的提取和纯化。合成合成合成合成cDNAcDNA第一链。第一链。第一链。第一链。将将将将mRNA-mRNA-cDNAcDNA杂交分子转变为双链杂交分子转变为双链杂交分子转变为双链杂交分子转变为双链cDNAcDNA分分分分子。子。子。子。将双链将双链将双链将双链cDNAcDNA重组到噬菌体载体或质粒载体上。重组到噬菌体载体或质粒载体上。重组到噬菌体载体或质粒载体上。重组到噬菌体载体或质粒载体上。将重组子体外包装成具有感染力的噬菌体颗粒将重组子体外包装成具有感染力的噬菌体颗粒将重组子体外包装成具有感染力的噬菌体颗粒将重组子体外包装成具有感染力的噬菌体颗粒导入到大肠杆菌寄主细胞中增殖。导入到大肠杆菌寄主细胞中增殖。导入到大肠杆菌寄主细胞中增殖。导入到大肠杆菌寄主细胞中增殖。构建基因组文库的基本程序：构建基因组文库的基本程序：构建基因组文库的基本程序：构建基因组文库的基本程序：构建基因组文库的基本程序：构建基因组文库的基本程序：构建基因组文库的基本程序：构建基因组文库的基本程序：构建基因组文库的基本程序：构建基因组文库的基本程序：构建基因组文库的基本程序：构建基因组文库的基本程序：基因文库的建立基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较基因组文库与基因组文库与cDNA文库的差别文库的差别基因组文库中包含了所有基因，而基因组文库中包含了所有基因，而cDNA文库只包含表达的文库只包含表达的基因，缺乏内含子和调控序列，在研究基因结构时用处不大基因，缺乏内含子和调控序列，在研究基因结构时用处不大cDNA文库代表了文库代表了mRNA的来源，转录本在丰度上有差别，的来源，转录本在丰度上有差别，而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因序列而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因序列不同细胞类型制备的不同细胞类型制备的cDNA文库包含一些共同序列和独特序文库包含一些共同序列和独特序列，可用于分离差别表达的基因，基因组文库中不能列，可用于分离差别表达的基因，基因组文库中不能基因组文库由于含有不表达序列，比基因组文库由于含有不表达序列，比cDNA文库大文库大mRNA在不同组织之间存在丰度差异，因此在不同组织之间存在丰度差异，因此cDNA文库在构文库在构建时对于建时对于mRNA含量较少的就比较困难，而基因组文库不存含量较少的就比较困难，而基因组文库不存在这样的问题在这样的问题5.3.5 基因文库的筛选基因文库的筛选基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子分子的特定克隆过程。的特定克隆过程。5.3.5.1 核酸杂交法5.3.5.2 PCR筛选法前提：已知足够的序列信息并获得基因特前提：已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。异性引物。步骤步骤：（：（1）将文库保存在多孔培养板上将文库保存在多孔培养板上 （2）用设计好的目的基因探针对每）用设计好的目的基因探针对每个孔进行个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性孔筛选，鉴定出阳性孔 （3）把阳性孔中的克隆稀释到次级）把阳性孔中的克隆稀释到次级多孔板中进行多孔板中进行PCR筛选。筛选。 （4）重复以上程序，直至鉴定出与）重复以上程序，直至鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。目的基因对应的单个克隆为止。5.3.5.3 免疫筛选法免疫筛选法原理：抗原抗体特异性结合原理：抗原抗体特异性结合适用于对表达文库的筛选适用于对表达文库的筛选文库铺于文库铺于文库铺于文库铺于E.coliE.coli形成噬形成噬形成噬形成噬菌斑菌斑菌斑菌斑转移到硝酸纤维素膜转移到硝酸纤维素膜转移到硝酸纤维素膜转移到硝酸纤维素膜保存原板加入一抗筛选膜上的噬菌斑印记保存原板加入一抗筛选膜上的噬菌斑印记保存原板加入一抗筛选膜上的噬菌斑印记保存原板加入一抗筛选膜上的噬菌斑印记吸收吸收吸收吸收噬菌体中噬菌体中噬菌体中噬菌体中表达的外源蛋白表达的外源蛋白表达的外源蛋白表达的外源蛋白洗去未结合的洗去未结合的洗去未结合的洗去未结合的抗体加入酶偶抗体加入酶偶抗体加入酶偶抗体加入酶偶联的二抗联的二抗联的二抗联的二抗E E加底物加底物加底物加底物显色显色显色显色 从保存板中挑从保存板中挑从保存板中挑从保存板中挑出阳性噬菌斑出阳性噬菌斑出阳性噬菌斑出阳性噬菌斑