课题课题2多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNA片段片段高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件课程标准课程标准尝尝试试PCR技技术术的基本操作和的基本操作和应应用。用。课标解读课标解读1.理理解解PCR技技术术的基本原理。的基本原理。2.知道知道PCR技技术术的基本操作的基本操作过过程。程。3.讨论讨论PCR技技术术的的应应用。用。 高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件1生物体内生物体内DNA分子复制的条件分子复制的条件(1)四四种种 是合成子是合成子链链的原料。的原料。(2) 提供了提供了DNA复制的模板。复制的模板。(3) 打开了打开了DNA双双链链。(4) 催化合成催化合成DNA子子链链。(5) 使使DNA聚聚合合酶酶能能够够从从 开开始始连连接接脱脱氧氧核苷酸。核苷酸。PCRPCR技术的原理及反应过程技术的原理及反应过程 脱氧核苷酸脱氧核苷酸DNADNA母母链链解旋解旋酶酶DNADNA聚合聚合酶酶引物引物引物的引物的3 3端端高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件2PCR扩增的原理及条件扩增的原理及条件(1)概概念念PCR即即 ，是是一一种种 迅迅速速 的的技技术术。它它能能以以极极少少量量的的 为为模模板板，在在短短时时间间内内复复制制出出上上百百万万份的份的 。(2)原理原理DNA的的热热变变性性：在在 的的温温度度范范围围内内，DNA双双螺螺旋旋结结构构解解体体，双双链链分分开开，这这个个过过程程称称为为 。当当温温度度缓缓慢慢 后，两条彼此分离的后，两条彼此分离的DNA链链又会重新又会重新 。子子链链的的合合成成：a.需需要要 ；b.合合成成方方向向总总是是从从子子链链的的 端端向向 端延伸。端延伸。多聚多聚酶酶链链式反式反应应体外体外扩扩增增DNADNA片段片段DNADNADNADNA拷拷贝贝8080100100变变性性降低降低结结合成双合成双链链引物引物5 53 3高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件(3)条件条件 模板。模板。分分别别与模板与模板DNA两条模板两条模板链链相相结结合的两种合的两种 。A、T、G、C四种四种 。耐耐热热DNA聚合聚合酶酶，一般用，一般用 。需要一定的需要一定的 和能和能严严格控制格控制 的温控的温控设备设备。DNADNA引物引物脱氧核苷酸脱氧核苷酸耐高温的耐高温的TaqTaqDNADNA聚合聚合酶酶缓缓冲溶液冲溶液温度温度高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件3PCR反应过程反应过程PCR一一般要般要经历经历 次循次循环环，每次循，每次循环环可以分可以分为为 、 和和 三步。三步。(1) ：当温度上升到：当温度上升到 以上以上时时，双，双链链DNA解聚解聚为单链为单链。(2) ：温度下降到：温度下降到 左右，左右， 通通过过 与两条与两条单链单链DNA结结合。合。(3) ：温温度度上上升升到到 左左右右，溶溶液液中中的的四四种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸在在 的作用下，根据碱基互的作用下，根据碱基互补补配配对对原原则则合成新的合成新的DNA链链。三十多三十多变变性性复性复性延伸延伸变变性性9090复性复性5050两种引物两种引物碱基互碱基互补补配配对对延伸延伸7272DNADNA聚合聚合酶酶高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件思维激活思维激活1 DNA复复制制缘缘何必何必须须有引物？有引物？提提示示DNA聚聚合合酶酶不不能能从从头头合合成成DNA，而而只只能能以以3延延伸伸DNA链链，故故DNA合合成成时时，必必须须加加入入引引物物(其其3游游离离)以以作作为为延延长长DNA子子链链的的“引子引子”。高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件1细胞内细胞内DNA复制和细胞外复制和细胞外PCR扩增的比较扩增的比较(见下表见下表)项项目目DNADNA复制复制PCRPCR扩扩增增不不同同点点场场所所细细胞内胞内细细胞外胞外能量能量ATPATP提供能量提供能量不需不需ATPATP提供能量提供能量酶酶解旋解旋酶酶、DNADNA聚合聚合酶酶耐耐热热的的TaqTaqDNADNA聚合聚合酶酶是否有是否有转转录录伴有伴有转录转录、产产生引物生引物无无转录转录、需加入两种引物、需加入两种引物特点特点边边解旋解旋边边复制，复制，半保留复制半保留复制体外迅速体外迅速扩扩增增循循环环次数次数受生物体自身控制受生物体自身控制3030多次多次缓缓冲液冲液不需要不需要需要人需要人为为控制控制设备设备无无需要需要严严格控制温度格控制温度变变化的温控化的温控设备设备高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件相相同同点点原料原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸复制原理复制原理严严格遵循碱基互格遵循碱基互补补配配对对原原则则模板模板DNADNA为为模板模板引物引物都需要与模板相都需要与模板相结结合的引物合的引物高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件2.PCR过程过程(1)变变性性当温度上升到当温度上升到90 以上以上时时，双，双链链DNA解聚解聚为单链为单链。(2)复性复性温温度度下下降降到到50 左左右右，两两种种引引物物通通过过碱碱基基互互补补配配对对与与两两条条单单链链DNA结结合。合。高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件(3)延伸延伸温温度度上上升升到到72 左左右右，溶溶液液中中的的四四种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸(A、T、C、G)在在DNA聚合聚合酶酶的作用下，根据碱基互的作用下，根据碱基互补补配配对对原原则则合成新的合成新的DNA链链。高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件特特别别提提醒醒(1)72 左左右右时时，TaqDNA聚聚合合酶酶有有最最大大活活性性，可可使使DNA新链由新链由5端向端向3端延伸。端延伸。(2)DNA聚聚合合酶酶只只能能特特异异性性地地复复制制处处于于两两个个引引物物之之间间的的DNA序序列列，使该段固定长度的序列呈使该段固定长度的序列呈“指数式指数式”扩增。扩增。高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件【巩巩固固1】 标标准准的的PCR过过程程一一般般分分为为变变性性、复复性性、延延伸伸三三大大步步，这这三大步需要的温度依次是三大步需要的温度依次是()。A94 、55 、72 B72 、55 、94 C55 、94 、72 D80 、55 、72 解解析析当当温温度度上上升升到到90 (9096 )以以上上时时，双双链链DNA解解聚聚为为单单链链，称称之之为为变变性性；当当温温度度下下降降到到50 (4060 )左左右右时时，两两种种引引物物通通过过碱碱基基互互补补配配对对与与两两条条单单链链DNA结结合合；当当温温度度上上升升到到72 (7075 )时时，溶溶液液中中的的四四种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸在在Taq DNA聚聚合合酶酶的的作作用用下下，根根据据碱碱基基互互补补配配对对原原则则合合成成新新的的DNA链，称为延伸。链，称为延伸。答案答案A高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件1实验用具实验用具(1)PCR仪仪：该该仪仪器器能能自自动动调调控控 ，实实现现DNA的的扩扩增增。如如果果没没有有PCR仪仪，可用，可用3个个 代替，操作代替，操作时时按程序在按程序在3个个 中中 PCR反反应应的微量离心管。的微量离心管。(2)微量离心管：微量离心管：总总容容积为积为 ，实际实际上是上是进进行行 的的场场所。所。(3)微量移液器：用于微量移液器：用于 。PCRPCR技术的实验操作及评价技术的实验操作及评价 温度温度恒温水浴恒温水浴锅锅水浴水浴锅锅来回来回转转移移0.5mL0.5mL多聚多聚酶酶链链式反式反应应转转移移PCRPCR配方中的液体配方中的液体高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件2操作步骤操作步骤准准备备 混合混合 反反应应。3操作提示操作提示(1)为为避避免免 等等因因素素的的污污染染，实实验验中中使使用用的的一一些些用用具具在在使用前必使用前必须进须进行行 。(2)所用的所用的 和和 应应分装成小份，并在分装成小份，并在 储储存。存。(3)在在 中中添添加加反反应应成成分分时时，每每吸吸取取一一种种试试剂剂后后，移液器上的移液器上的枪头枪头必必须须 。加入加入组组分分设设置置PCRPCR的循的循环环程序程序外源外源DNADNA高高压灭压灭菌菌缓缓冲液冲液酶酶2020微量离心管微量离心管更更换换高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件思维激活思维激活2 PCR操操作中模板作中模板DNA是否需解旋？需要旋是否需解旋？需要旋转转酶酶吗吗？提提示示PCR操操作作中中，模模板板DNA仍仍需需解解旋旋，但但该该解解旋旋过过程程不不是是DNA解解旋旋酶酶催催化化的的结结果果，而而是是利利用用DNA热热变变性性的的原原理理，在在80100 温温度度范范围围内内，DNA双双螺螺旋旋结结构构将将解解体体，双双链链分分开开，以以此此达达到到解解旋旋的目的。的目的。高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件1PCR仪：仪：PCR自动化程度较高，参照下表设计程序即可。自动化程度较高，参照下表设计程序即可。循循环环数数变变性性复性复性延伸延伸第第1 1次次94 94 ，10 min10 min3030次次94 94 ，30 s30 s55 55 ，30 30 s s72 72 ，1 min1 min最后一次最后一次94 94 ，1 min1 min55 55 ，30 30 s s72 72 ，1 min 1 min 高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件( (将微量离心管放在离心机上，离心将微量离心管放在离心机上，离心约约10 s10 s。目的是使反。目的是使反应应液集中在离心管底部液集中在离心管底部) ) 高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件3实验中实验中DNA含量的测定含量的测定DNA在在260 nm的的紫紫外外线线波波段段有有一一强强烈烈的的吸吸收收峰峰，峰峰值值的的大大小小与与DNA的的含含量量有有关关。可可以以利利用用DNA这这一一特特点点进进行行DNA含含量量的的测测定，具体方法如下：定，具体方法如下：稀稀释释：2LPCR反反应应液液，加加入入98L蒸蒸馏馏水水，即即将将样样品品进进行行50倍稀倍稀释释对对照照调调零零：以以蒸蒸馏馏水水作作为为空空白白对对照照，在在波波长长260 nm处处，将将紫外分光光度紫外分光光度计计的的读读数数调节调节至零至零高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件测测定定：取取DNA稀稀释释液液100L至至比比色色杯杯中中，测测定定260 nm处处的的光光吸吸收收值值计计算：算：DNA含量含量(g)50(260 nm的的读读数数)稀稀释释倍数倍数特别提醒特别提醒若没有若没有PCR仪，可进行水浴扩增仪，可进行水浴扩增DNA设设置置3个个恒恒温温水水浴浴锅锅，温温度度分分别别为为94 、55 和和72 ，在在3个个水水浴锅中依据浴锅中依据PCR仪的处理时间来回转移仪的处理时间来回转移PCR反应的微量离心管即可。反应的微量离心管即可。高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件【巩巩固固2】 聚聚合合酶酶链链式式反反应应(PCR技技术术)是是体体外外酶酶促促合合成成特特异异DNA片片段段的的一一种种方方法法，由由高高温温变变性性、低低温温退退火火及及适适温温延延伸伸等等几几步步反反应应组组成成一一个个周周期期，循循环环进进行行，使使目目的的DNA得得以以迅迅速速扩扩增增，其其简简要要过过程如程如图图所示。下列关于所示。下列关于PCR技技术术叙述不正确的是叙述不正确的是()。APCR技技术术是在是在实验实验室中以少量室中以少量DNA制制备备大量大量DNA的技的技术术B反反应应中新合成的中新合成的DNA又可以作又可以作为为下一下一轮轮反反应应的模板的模板CPCR技技术术中以核糖核苷酸中以核糖核苷酸为为原料，以指数方式原料，以指数方式扩扩增增D应应用用PCR技技术术与探与探针杂针杂交技交技术术可以可以检测检测基因突基因突变变高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件解解析析PCR技技术术是是人人工工合合成成DNA的的方方法法，原原料料是是脱脱氧氧核核苷苷酸酸而而不不是核糖核苷酸。是核糖核苷酸。答案答案C高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件【例例1】 (2011江苏江苏)请请回答有关回答有关问题问题。(1)利利用用PCR技技术术扩扩增增目目的的基基因因，其其原原理理与与细细胞胞内内DNA复复制制类类似似(如如下下图图所所示示)。图图中中引引物物为为单单链链DNA片片段段，它它是是子子链链合合成成延延伸伸的基的基础础。PCRPCR技术的原理技术的原理 高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件从从理理论论上上推推测测，第第四四轮轮循循环环产产物物中中含含有有引引物物A的的DNA片片段段所所占占的比例的比例为为_。在在第第_轮轮循循环环产产物物中中开开始始出出现现两两条条脱脱氧氧核核苷苷酸酸链链等等长长的的DNA片段。片段。(2)设设计计引引物物是是PCR技技术术关关键键步步骤骤之之一一。某某同同学学设设计计的的两两组组引引物物(只只标标注了部分碱基序列注了部分碱基序列)都不合理都不合理(如下如下图图)，请请分分别说别说明理由。明理由。高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件第第1组组：_；第第2组组：_。(3)PCR反反应应体体系系中中含含有有热热稳稳定定DNA聚聚合合酶酶，下下面面的的表表达达式式不不能能正正确反映确反映DNA聚合聚合酶酶的功能，的功能，这这是因是因为为_。高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件思维导图：思维导图：高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件归纳提升归纳提升PCR技术特点：技术特点：(1)PCR不需要解旋酶，而生物体内不需要解旋酶，而生物体内DNA复制时需要解旋酶；复制时需要解旋酶；(2)PCR需需要要耐耐热热的的DNA聚聚合合酶酶，而而生生物物体体内内DNA聚聚合合酶酶在在高高温温时时会变性；会变性；(3)PCR一一般般需需经经三三十十多多次次循循环环，而而生生物物体体内内DNA复复制制需需要要生生物物体体自身的控制。自身的控制。高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件【例例2】 使使用用PCR仪仪具体具体实验实验操作操作顺顺序序应为应为()。设计设计好好PCR仪仪的循的循环环程序程序按配方准按配方准备备好各好各组组分分用用微微量量移移液液器器在在微微量量离离心心管管中中依依次次加加入入各各组组分分进进行行PCR反反应应离心使反离心使反应应液集中在离心管底部液集中在离心管底部A BC D思维导图：思维导图：PCRPCR技术实验操作及注意事项技术实验操作及注意事项 高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件深深度度剖剖析析PCR反反应应的的操操作作步步骤骤一一般般分分为为准准备备(包包括括配配制制配配方方及及将将各各配配方方放放于于实实验验台台上上)移移液液混混合合离离心心反反应应。因因PCR仪仪是是一一种种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。答案答案C高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件单击此处进入单击此处进入 随堂达标检测随堂达标检测高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件教材教材P631提提示示绘绘图图可可参参考考教教科科书书中中图图59。PCR反反应应中中的的DNA片片段段一一般般以以2n的的方方式式积积累累，其其中中n为为反反应应循循环环次次数数。一一个个DNA片片段段在在30次次循循环环后后反反应应物物中中大大约约有有10亿亿个个这这样样的的片片段段(2n2301 073 741 824)。解析解析PCR扩增扩增DNA片段可以使目的片段呈指数增长。片段可以使目的片段呈指数增长。高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件2提提示示根根据据已已知知DNA序序列列设设计计引引物物，因因为为PCR扩扩增增的的是是两两种引物之间的特定种引物之间的特定DNA序列。序列。解析解析PCR引物是根据需要扩增的目标引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实践的经验。计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实践的经验。高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件高二生物同步52多聚酶链式反应扩增DNA片段人教版选修I36张PPT课件