中药青蒿的代谢工程中药青蒿的代谢工程Artemisia annua(青蒿青蒿)青蒿素青蒿素(Artemisinin)目的意义目的意义用途：用途：抗抗疟疾疟疾：青蒿素是世界卫青蒿素是世界卫生组织生组织(WHO)推荐的目前推荐的目前最有效的疟疾治疗药物。最有效的疟疾治疗药物。基于青蒿素的综合疗法基于青蒿素的综合疗法(artemisinin-based combination therapies, ACTs)现在已经成为现在已经成为WHO推荐的疟疾治疗一线药物推荐的疟疾治疗一线药物. .2v2011年9月12日，中国科学家屠呦呦获得2011年度拉斯克奖(Lasker Award) “临床医学奖”。获奖理由是“因为发因为发现青蒿素现青蒿素一种用于治疗疟疾的药物，挽救了全球特别一种用于治疗疟疾的药物，挽救了全球特别是发展中国家的数百万人的生命是发展中国家的数百万人的生命”。这也是至今为止，中国生物医学界获得的世界级最高大奖。3全球疟疾感染者分布图：每年有全球疟疾感染者分布图：每年有5亿人感染疟疾，其中有近亿人感染疟疾，其中有近100万人不幸死亡。万人不幸死亡。4青蒿的资源分布青蒿的资源分布v青蒿(Artemisia annua L.)，其分类学上中文学名为黄花蒿, 属于菊科(Compositae)蒿属(Artemisia)一年生草本植物。黄花蒿黄花蒿 (Artemisia annua L.)5青蒿素的生产青蒿素的生产细胞工程手段细胞工程手段传统育种传统育种6artemisininIPPProposed biosynthetic pathway of artemisininADH1ADSCYP71AV1CYP71AV1CYP71AV1Dbr2ALDH1ALDH1FPSSteriodsOther sesquterpenes？7othersesquterpenesSQStriterpenesFPSADS青蒿素生物合成途径及调控策略示意图青蒿素生物合成途径及调控策略示意图squaleneSESFPP“开源开源”“节流节流”81.1.相关基因的挖掘相关基因的挖掘2.2.高效遗传转化系统高效遗传转化系统3.3.青蒿再生体系建立青蒿再生体系建立青蒿代谢工程的关键环节青蒿代谢工程的关键环节9青蒿素生物合成的位点青蒿素生物合成的位点A. annua is the only natural source of artemisinin; however, its content in plants is relatively low (0.10.8% by dry weight).10青蒿腺毛青蒿腺毛cDNAcDNA文库的构建及青蒿素生物合成相关基因的克隆文库的构建及青蒿素生物合成相关基因的克隆EST identification Number of ESTsBest blastx hitsspeciesFarnesyl diphosphate synthaseAmorpha-4,11-diene synthaseCytochrome P450 reductase8-Epicedrol Synthase(3R)-linalool synthaseIPP/DMAPP synthase IPP/DMAPP synthase Cinnamyl alcohol dehydrogenaseCinnamyl alcohol dehydrogenasePutative cyclase1212111111AF112881AY006482ABL09938AF157059AF154125AAD55762ABB88836ABC66107BAA19487NP_567979Artemisia annuaArtemisia annuaArtemisia annuaArtemisia annuaArtemisia annuaNicotiana tabacumStevia rebaudianaZinnia elegansZinnia elegansArabidopsis thaliana关键酶基因关键酶基因候选基因候选基因11v1983年，贺锡纯等首次报道以青蒿的嫩茎和嫩叶为外植体，诱导出愈伤组织，愈伤组织经继代转接后可形成幼苗。青蒿的组织培养青蒿的组织培养青蒿素的紫外吸收曲线青蒿素的紫外吸收曲线a. 标准品标准品 b. 带分化芽的愈伤组织带分化芽的愈伤组织 天然植株和再生植株青蒿素含量的紫外吸收曲线天然植株和再生植株青蒿素含量的紫外吸收曲线a. 天然植株天然植株 b.再生植株再生植株12青蒿发根遗传转化系统的建立青蒿发根遗传转化系统的建立转基因青蒿发根转基因青蒿发根13青蒿丛生芽遗传转化系统的建立青蒿丛生芽遗传转化系统的建立 GFP expression in the leaf of transgenic plants. A. leaf of untransformed plant; B. leaf of transgenic plant. Transgenic plantlets Sequences between T-DNA right border (RB) and left border (LB). The NPTgene is used as a selectable Kan-resistant plant cells. Arrows indicate the reaction sites of Sma, Sacand Hind .Nos/p NPT Nos/t CaMV35S/p gfp coding seq. Nos/t RB LB Hind Sma Sac 14异源法呢基焦磷酸合酶异源法呢基焦磷酸合酶(FPS)(FPS)对青蒿发根中对青蒿发根中青蒿素生物合成的调控青蒿素生物合成的调控Acetyl-CoAHMG-CoAMVAIPPFPPArtemisininFPS转基因发根的转基因发根的Southern检测检测转基因发根的转基因发根的Northern检测检测pBIFDS植物表达载体的构建植物表达载体的构建转基因发根青蒿素含量检测转基因发根青蒿素含量检测转基因青蒿发根转基因青蒿发根15异源法呢基焦磷酸合酶异源法呢基焦磷酸合酶(FPS)(FPS)对青蒿素对青蒿素生物合成的调控生物合成的调控转基因青蒿植株转基因青蒿植株转基因植株的转基因植株的Southern检测检测转基因植株青蒿素含量检测转基因植株青蒿素含量检测Acetyl-CoAHMG-CoAMVAIPPFPPArtemisininFPSpBIFDS植物表达载体的构建植物表达载体的构建转基因植株的转基因植株的Northern检测检测16内源法呢基焦磷酸合酶内源法呢基焦磷酸合酶(FPS)(FPS)基因基因对青蒿素生物合成的调控对青蒿素生物合成的调控A.A.分子量标准分子量标准B. B. 细胞全蛋白细胞全蛋白C. C. 硫酸铵分级沉淀硫酸铵分级沉淀D. Q-D. Q-epharoseepharose纯化纯化29KDa97KDa68KDa43KDa18KDaABCD不同方法纯化的蛋白不同方法纯化的蛋白AaFPS1的的Michaelis-Menton17转转FPS基因青蒿基因青蒿转转FPS基因青蒿的基因青蒿的Southern杂交杂交转转FPS基因青蒿的基因青蒿的Northern杂交杂交转基因青蒿的转基因青蒿的FPS酶活性分析酶活性分析转基因青蒿的青蒿素含量转基因青蒿的青蒿素含量内源法呢基焦磷酸合酶内源法呢基焦磷酸合酶(FPS)(FPS)基因基因对青蒿素生物合成的调控对青蒿素生物合成的调控18laclorikanADSpETADS(7032bp)T7 terminatorT7 promoterXhoIBamHIATGADS原核表达载体的构建原核表达载体的构建ADS的的SDS/PAGE分析分析 Mr12344355662209636ADS体外催化产物体外催化产物GC-MS检测检测 紫穗槐二烯合酶紫穗槐二烯合酶(ADS)(ADS)基因对青蒿素生物合成的调控基因对青蒿素生物合成的调控actinflowers leaves stems rootsads1ADS基因的组织特异性表达分析基因的组织特异性表达分析Acetyl-CoAMVAIPPFPPArtemisininADSAmorpha-4,11-diene19青蒿青蒿ADS基因植物表达载体基因植物表达载体 HindIIIHindIIIHindIII转基因植株的转基因植株的RT-PCR检测检测转转ADS基因青蒿基因青蒿过表达过表达ADS基因青蒿的分子检测基因青蒿的分子检测转基因植株的转基因植株的PCR检测检测1000 bp1600 bp2000 bpA4A6A7A8A9CKM20不同转基因株系中青蒿素及相关代谢产物的比较不同转基因株系中青蒿素及相关代谢产物的比较47% 79%41%21青青蒿蒿鲨鲨烯烯合合酶酶基基因因对对青青蒿蒿素素生生物物合合成成的的调调控控kD1234567364355668411696鲨烯合酶大肠杆菌表达的鲨烯合酶大肠杆菌表达的SDS/PAGE分析分析 鲨烯合酶体外催化产物鲨烯合酶体外催化产物GC-MS分析分析22反义鲨烯合酶基因对青蒿素生物合成的调控反义鲨烯合酶基因对青蒿素生物合成的调控转反义鲨烯合酶基因青蒿转反义鲨烯合酶基因青蒿转基因青蒿鲨烯含量的检测转基因青蒿鲨烯含量的检测转基因植株中青蒿素含量的检测转基因植株中青蒿素含量的检测转基因植物的转基因植物的RT-PCR检测结果检测结果SQSActinCKASQ2ASQ3ASQ523转反义石竹烯合酶基因青蒿转反义石竹烯合酶基因青蒿cpshmgrsqadsfpsdbr2aldhactin234910CK转基因植株青蒿素生物合成转基因植株青蒿素生物合成相关基因的相关基因的RT-PCR检测检测反义石竹烯合酶基因对青蒿素生物合成的调控反义石竹烯合酶基因对青蒿素生物合成的调控24转基因青蒿植株的石竹烯含量变化转基因青蒿植株的石竹烯含量变化转基因植株中青蒿素前体含量的变化转基因植株中青蒿素前体含量的变化转基因植株中其它代谢产物的变化转基因植株中其它代谢产物的变化反义石竹烯合酶基因对青蒿素及相关代谢产物的影响反义石竹烯合酶基因对青蒿素及相关代谢产物的影响转基因青蒿中的青蒿素含量变化转基因青蒿中的青蒿素含量变化54.9%17.4%40.4%49%25青蒿青蒿AaWRKY1的核定位的核定位顺式元件顺式元件W-box 与与AaWRKY1的酵母单杂实验的酵母单杂实验 AaWRKY1转录因子对青蒿素生物合成的调控转录因子对青蒿素生物合成的调控26SYBR Green EMSA stain染料染DNA SYPRO Ruby EMSA stain染料染蛋白 ab顺式元件顺式元件W-box 与与AaWRKY1的凝胶阻滞实验的凝胶阻滞实验27ADS、AaWRKY1受受0.3 mmol/L茉莉酸甲酯诱导茉莉酸甲酯诱导ADS、AaWRKY1受受150 mg/L壳聚糖诱导壳聚糖诱导根根茎茎叶叶花花分泌腺毛分泌腺毛ADS、AaWRKY1在青蒿在青蒿不同部位的表达情况不同部位的表达情况28AaWRKY1激活青蒿素生物合成相关的基因激活青蒿素生物合成相关的基因29Thank you！30