目录目录 基因重组和基因工程基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering第第1414章章目录目录DNA克隆、测序与重组技术的历史克隆、测序与重组技术的历史1973年，年，Stanley Cohen等人首次等人首次获得体外得体外重重组DNA的分子克隆的分子克隆1977年，年，Allan Maxam和和Walter Gilbert的的化学裂解化学裂解DNA测序序问世世不久，不久，Sanger 等的双脱氧等的双脱氧测序法序法20世世纪90年代启年代启动人人类基因基因组计划划(human genome project，HGP)重重组DNA技技术学学(Recombinant DNA Technology)目录目录第一节第一节自然界自然界DNA重组和基因转移重组和基因转移是经常发生的是经常发生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature目录目录DNA重组重组接合作用接合作用 (conjugation)转化作用化作用 (transformation)转导作用作用 (transduction)转 座座 (transposition)同源重同源重组 (homologous recombination)位点特异的重位点特异的重组(site-specific recombination)目录目录发生生在在同同源源序序列列间的的重重组称称为同同源源重重组(homologous recombination)，又又称称基基本本重重组（general recombination）。是是最最基基本本的的DNA重重组方方式式，通通过链的的断断裂裂和和再再连接接，在在两两个个DNA分分子子同同源源序序列列间进行行单链或或双双链片段的交片段的交换。以以的的同同源源重重组为例例，了了解解同同源源重重组机机制制的的Holliday模型。模型。一、同源重组是最基本的一、同源重组是最基本的DNA重组方式重组方式目录目录nHolliday模型的模型的4个关键步骤：个关键步骤： 两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整排列整齐；片段重片段重组体体(patch recombinant)拼接重拼接重组体体(splice recombinant) 一个一个DNA的一条的一条链断裂、并与另一个断裂、并与另一个DNA对应的的链连接，形成接，形成Holliday中中间体；体；通通过分支移分支移动产生异源双生异源双链DNA；Holliday中中间体切开并修复，形成两个双体切开并修复，形成两个双链重重组体体DNA，分，分别为：目录目录片段重片段重组体体 （见模型模型图左左边产物）：物）： 切开的切开的链与原来断裂的是同一条与原来断裂的是同一条链，重，重组 体含有一段异源双体含有一段异源双链区，其两区，其两侧来自同一来自同一亲本本DNA。拼接重拼接重组体体（见模型模型图右右边产物）：物）： 切开的切开的链并非原来断裂的并非原来断裂的链，重，重组体异源双体异源双链区的两区的两侧来自不同来自不同亲本本DNA。 内切内切酶 (recBCD)DNA侵侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA) 内切内切酶(recBCD) DNA 连接接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中中间体体53535353Holiday中中间体体535353535535533335555333355553335555333355553333内切内切酶(ruvC)内切内切酶(ruvC) DNA连接接酶 DNA连接接酶片片段段重重组体体拼拼接接重重组体体目录目录二、细菌的基因转移与重组有四种方式二、细菌的基因转移与重组有四种方式（一）接合作用（一）接合作用当当细胞胞与与细胞胞、或或细菌菌通通过菌菌毛毛相相互互接接触触时，质粒粒DNA从从一一个个细胞胞（细菌菌）转移移至至另另一一细胞胞（细菌菌）的的DNA转移移称称为接接合作用合作用(conjugation)。目录目录可接合可接合质粒如粒如 F 因子因子(F factor) 细菌染色体外的小型菌染色体外的小型环状双状双链DNA分子。分子。质粒粒目录目录（二）转化作用（二）转化作用通通过自自动获取取或或人人为地地供供给外外源源DNA，使使细胞胞或或培培养养的的受受体体细胞胞获得得新新的的遗传表表型型，称称为转化化作作用用 (transformation)。目录目录例：例：溶菌溶菌时，裂解的，裂解的DNA片段被另一片段被另一细菌菌摄取。取。目录目录（三）转导作用（三）转导作用当当病病毒毒从从被被感感染染的的（供供体体）细胞胞释放放出出来来、再再次次感感染染另另一一（供供体体）细胞胞时，发生生在在供供体体细胞胞与与受受体体细胞胞之之间的的DNA转移移及基因重及基因重组即即为转导作用作用(transduction)。目录目录噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生溶菌生长途径途径 (lysis pathway)溶源菌生溶源菌生长途径途径 (lysogenic pathway)目录目录三、位点特异重组，即特异位点间三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合发生的整合位点特异重位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合是由整合酶催化，在两个催化，在两个DNA序列的特异位点序列的特异位点间发生的整合。生的整合。目录目录噬噬菌菌体体的的整整合合酶酶识识别别噬噬菌菌体体和和宿宿主主染染色色体体的的特特异异靶靶位位点点发发生生选选择择性性整整合合；反反转转录录病病毒毒整整合合酶酶可可特特异异地地识识别别、整整合合反反转转录录病病毒毒cDNA的的 长长 末末 端端 重重 复复 序序 列列 (long terminal repeat, LTR)。 （一）（一）噬菌体噬菌体DNA的整合的整合目录目录（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组沙沙门菌菌H片段倒位决定鞭毛相片段倒位决定鞭毛相转变。目录目录hix为反反向向重重复复序序列列，它它们之之间的的H片片段段可可在在Hin控控制制下下进行行特特异异位位点点重重组(倒倒位位)。H片片段段上上有有两两个个启启动子子P，其其一一驱动hin基基因因表表达达，另另一一正正向向时驱动H2和和rH1基基因因表表达达，反反向向(倒倒位位)时H2和和rH1不不表表达达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。目录目录 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重重组酶转位片段位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA启启动序列序列H1启启动序列序列沙沙门菌菌H H片段倒位决定鞭毛相片段倒位决定鞭毛相转变目录目录（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排免免疫疫球球蛋蛋白白(Ig)，由由两两条条轻链(L链)和和两两条条重重链(H链)组成成，分分别由由三三个个独独立立的的基基因因族族编码，其中两个其中两个编码轻链( 和和 )，一个，一个编码重重链。 轻链的基因片段：的基因片段：重重链的基因片段：的基因片段：L V J C L V D J C 重重链(IgH)基基因因的的V-D-J重重排排和和轻链(IgL)基基因因的的V-J重重排排均均发生生在在特特异异位位点点上上。在在V片片段段的的下下游游，J片片段段的的上上游游以以及及D片片段段的的两两侧均均 存存 在在 保保 守守 的的 重重 组 信信 号号 序序 列列(recombination signal sequence, RSS)。此此重重 排排 的的 重重 组 酶 基基 因因 rag (recombination activating gene)共共有有两两个个，分分别产生生蛋蛋白白质RAG1和和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段V片段片段J片段片段RSSRSS间插插DNAOHOHVJ单链切开切开RAG1RAG2分子内分子内转酯反反应单链切开切开转移核苷酸移核苷酸修复、修复、连接接免免疫疫球球蛋蛋白白基基因因重重排排过程程目录目录四、转座重组四、转座重组由由插插入入序序列列和和转座座子子介介导的的基基因因移移位位或或重重排称排称为转座座(transposition)。大多数基因在基因大多数基因在基因组内的位置是固定的，内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移但有些基因可以从一个位置移动到另一位到另一位置。置。这些可移些可移动的的DNA序列包括插入序序列包括插入序列和列和转座子。座子。 目录目录 插入序列插入序列(insertion sequences, IS)组成：成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列转座（一）插入序列转座二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列序列特有的正向重复序列特有的正向重复序列一个一个转座座酶（transposase)编码基因基因目录目录插入序列插入序列发生生转座的形式：座的形式：保守性保守性转座座(conservative transposition) 复制性复制性转座座(duplicative transposition)插插入入序序列列的的复复制制性性转座座目录目录转座子座子(transposons) 可从一个染色体可从一个染色体位点位点转移到另一位点的分散重复序列。移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposase Gene有用基因有用基因（二）转座子转座（二）转座子转座转座子座子组成：成：反向重复序列反向重复序列转座座酶编码基因基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因目录目录 细菌的可流菌的可流动性元件性元件A插入序列：插入序列：转座座酶编码基因两基因两侧连接反向末端重复序列接反向末端重复序列(箭箭头所示所示)B转座子座子Tn3：含有：含有转座座酶、-内内酰胺胺酶及阻遏蛋白及阻遏蛋白编码基因基因C转座子座子Tn10：含四：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L目录目录由由转座子介座子介导的的转座座目录目录第二节第二节 重组重组DNA技术技术又称又称DNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 目录目录重重组DNA技技术的的发展史展史1865年年 的豌豆的豌豆杂交交试验。1944年年 的肺炎球菌的肺炎球菌转化化实验。1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。分子。1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，工程公司，专门应用重用重组DNA技技术制造医学上重要的制造医学上重要的药物。物。1980年年 开始建造第一家开始建造第一家应用重用重组DNA技技术生生产胰胰岛素的工厂。素的工厂。1997年年 英国英国罗林研究所成功的克隆了多莉。林研究所成功的克隆了多莉。目录目录相关概念相关概念n DNA克隆克隆n 工具工具酶n 目的基因目的基因n 基因基因载体体基本原理基本原理 重重组DNA技技术与医学的关系与医学的关系本本节主要内容：主要内容：目录目录一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或来自同一始祖的相同副本或拷拷贝的集合。的集合。获取同一拷取同一拷贝的的过程称程称为克隆化克隆化(cloning)，即无性繁殖。即无性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆目录目录技技术水平：水平：分子克隆分子克隆(molecular clone) （即（即DNA 克隆）克隆） 细胞克隆胞克隆 个体克隆（个体克隆（动物或植物）物或植物）目录目录应用用酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗传物物质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或或人人工工的的DNA）与与载体体DNA接接合合成成一一具具有有 自自 我我 复复 制制 能能 力力 的的 DNA分分 子子 复复 制制 子子(replicon)，继而而通通过转化化或或转染染宿宿主主细胞胞，筛选出出含含有有目目的的基基因因的的转化化子子细胞胞，再再进行行扩增增提提取取获得得大大量量同同一一DNA分分子子，也也称称基基因因克克隆隆或重或重组DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆克隆目录目录生物技生物技术工程工程: 基因工程、蛋白基因工程、蛋白质工程、工程、酶工程、工程、细胞工程等胞工程等 目的：目的： 分离分离获得某一感得某一感兴趣的基因或趣的基因或DNA 获得感得感兴趣基因的表达趣基因的表达产物（蛋白物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering) 实现基因基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重又称重组DNA工工艺学。学。目录目录（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸内切限制性核酸内切酶 DNA聚合聚合酶 逆逆转录酶 T4DNA连接接酶 碱性磷酸碱性磷酸酶 末端末端转移移酶 Taq DNA聚合聚合酶重重组DNA技技术中常用的工具中常用的工具酶目录目录限制性核酸内切限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶 (restriction endonuclease, RE)是是识别DNA的的特特异异序序列列, 并并在在识别位位点点或或其其周周围切切割割双双链DNA的的一一类内内切切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H定义：定义：目录目录与与甲甲基基化化酶共共同同构构成成细菌菌的的限限制制修修饰系系统，限制外源，限制外源DNA，保，保护自身自身DNA。、（基因工程技（基因工程技术中常用中常用型）型）分类：分类：作用：作用：目录目录第一个字母取自第一个字母取自产生生该酶的的细菌属名，用大写；菌属名，用大写；第二、第三个字母是第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用用罗马数字表示数字表示发现的先后次序。的先后次序。命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种株的第三种酶目录目录类酶识别序列特点序列特点回文回文结构构(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG目录目录Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口目录目录来来源源不不同同的的限限制制酶，但但能能识别和和切切割割同一位点，同一位点，这些些酶称称同功异源同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst同功异源酶：同功异源酶：目录目录有有些些限限制制性性内内切切酶虽然然识别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为同同尾尾酶。这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为配配伍未端伍未端(compatible end)。Bam Bam HHBg Bg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶 限制性内切核酸限制性内切核酸酶目录目录（三）目的基因（三）目的基因(target gene) cDNA (complementary DNA) 指指经反反转录合成的、与合成的、与RNA (通常指通常指mRNA或病毒或病毒RNA)互互补的的单链DNA。以。以单链cDNA为模板、模板、经聚合反聚合反应可合成双可合成双链cDNA。 基因基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个指代表一个细胞或生物体整套胞或生物体整套遗传信息信息(染色体及染色体及线粒体粒体)的所有的所有DNA序列。序列。 目录目录（四）基因载体（四）基因载体 定定义为携携带目的基因，目的基因，实现其无性繁其无性繁殖或表达有意殖或表达有意义的蛋白的蛋白质所采用的所采用的一些一些DNA分子。分子。 常用常用载体体质粒粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA目录目录克隆克隆载体体(cloning vector)为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩增增而而特特意意设计的的载体称体称为克隆克隆载体体。表达表达载体体(expression vector) 为使插入的外源使插入的外源DNA序列可序列可转录翻翻译成成 多多肽链而特意而特意设计的的载体称体称为表达表达载体体。目录目录n载体的选择标准：载体的选择标准：能自主复制；能自主复制；具有两个以上的具有两个以上的遗传标记物，便于重物，便于重组体体的的筛选和和鉴定；定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有插入点），常具有多个多个单一一酶切位点，称切位点，称为多克隆位点；多克隆位点；分子量小，以容分子量小，以容纳较大的外源大的外源DNA。目录目录1.1.质粒质粒 (plasmid)特特点点:能能在在宿宿主主细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带有有某某些些遗传信息信息,会会赋予宿主予宿主细胞一些胞一些遗传性状。性状。 目录目录 噬菌体噬菌体DNA改造系改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆） EMBL系列（置系列（置换型，适用基因型，适用基因组克隆）克隆）2.2.噬菌体噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系改造系统（含（含lacZ基因）基因） M13mp系列系列 pUC系列系列目录目录粘性质粒粘性质粒(cosmid)目录目录 酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒物病毒DNA改造的改造的载体体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）病毒）4.其他其他目录目录二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理基本原理基本原理目的基因的目的基因的获取取DNA导入受体入受体细胞胞外源基因与外源基因与载体的体的连接接克隆克隆载体的体的选择和构建和构建重重组体的体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质 粒粒 为 载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过 程程目录目录（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列物的氨基酸序列 。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) (见第第22章章) 目录目录化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推由已知氨基酸序列推测可能的可能的DNA序列。序列。组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因基因组DNA文文库存在于存在于转化化细胞内胞内由克隆由克隆载体所携体所携带的所的所有基因有基因组DNA的集合的集合从基因从基因组DNA文文库获取目的基因取目的基因限制限制酶切位点切位点限制限制酶消化消化 除去中除去中间片段片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制限制酶部分消化部分消化 外源外源DNA与与载体体DNA混合混合 连接反接反应 体外包装体外包装 用重用重组噬菌体噬菌体感染大感染大肠杆菌杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文基因文库用随机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制 从从cDNA文文库获取目的基因取目的基因 逆逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸核酸酶 DNA聚合聚合酶碱水解碱水解 T T T T目录目录（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建目的不同，操作基因的性目的不同，操作基因的性质不同，不同，载体的体的选择和改建方法也不同。和改建方法也不同。 目录目录（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接方式：方式：(1)同一限制同一限制酶切位点切位点连接接 (2)不同限制不同限制酶切位点切位点连接接配伍末端配伍末端连接接非配伍末端非配伍末端连接接1.粘性末端连接粘性末端连接Bam H切割反切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体体DNA用用Bam H切割切割重重组体体载体自体自连目的基因自目的基因自连同同一一限限制制酶切切位位点点连接接不同限制不同限制酶切位点（非配伍末端）的切位点（非配伍末端）的连接接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+ +EcoR+ Bg l双双酶酶切切Eco R+ Bg l双双酶酶切切T4 DNA连接接酶15C重重组体体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一接情况和同一限制限制酶切位点切位点连接相似。接相似。目录目录2.平端连接平端连接 限制性内切限制性内切酶切割切割产生的平端生的平端粘端粘端补齐或切平形成的平端或切平形成的平端适用于：适用于：目的基因目的基因载体体限制性内切限制性内切酶限制性内切限制性内切酶T4 DNA连接接酶15C重重组体体载体自体自连目的基因目的基因 自自连目录目录在在末末端端转移移酶(terminal transferase) 的的作作用用下下，在在DNA片片段段末末端端加加上上同同聚聚物物序序列列、制造出粘性末端，再制造出粘性末端，再进行粘端行粘端连接。接。3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接5335载体体DNA5335目的基因目的基因限制限制酶或机械剪切或机械剪切限制限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 353 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端末端转移移酶+ dATP末端末端转移移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接接酶15C重重组体体5目录目录由平端加上新的由平端加上新的酶切位点，再用限制切位点，再用限制酶切除切除产生粘性末端，而生粘性末端，而进行粘端行粘端连接接。 4.人工接头人工接头(linker)连接连接人人工工接接头及及其其应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目录目录受体菌条件：受体菌条件：安全宿主菌安全宿主菌 限制限制酶和重和重组酶缺陷缺陷处于感受于感受态(competent) 导入方式：入方式：转化化 (transformation)转染染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌目录目录1. 直接直接选择法法(1) 抗抗药性性标记选择(2) 标志志补救救(marker rescue)(3) 分子分子杂交法交法原位原位杂交交Southern印迹印迹2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及如免疫化学方法及酶免免检测分析等分析等（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选( (插插入入失失活活法法) ) 抗抗药性性标记选择 互互补补利用利用互互补原理原理筛选重重组体体pUC18 原原位位杂交交 Southern印迹印迹鸡的的肌球蛋白的克隆和肌球蛋白的克隆和检出出免疫学方法免疫学方法 目录目录重重组DNADNA技技术操作操作过程可形象程可形象归纳为： 小小结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制限制酶切目的基因与切目的基因与载体体接接拼接重拼接重组体体转转入受体入受体细胞胞筛筛选重重组体体 目录目录重重组DNA技技术操作的主要步操作的主要步骤载体体质粒粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物物限制限制酶消化消化开开环载体体DNA目的基因目的基因连接接酶重重组体体转化化体外包装，体外包装，转染染带重重组体的宿主体的宿主筛选表型表型筛选酶切切电泳泳鉴定定菌落原位菌落原位杂交交目录目录表达体系的建立：表达体系的建立： 表达表达载体的构建体的构建 受体受体细胞的建立胞的建立 表达表达产物的分离物的分离纯化化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达目录目录 标准：准：选择标志志 强启启动子子 翻翻译调控序列控序列多接多接头克隆位点克隆位点 表达体系的不足表达体系的不足：不宜表达真核基因不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白表达的蛋白质常形成不溶性包涵体常形成不溶性包涵体(inclusion body) ；很很难表达大量可溶性蛋白。表达大量可溶性蛋白。1. 原核表达体系原核表达体系 (表达体系最为常用表达体系最为常用)大鼠胰大鼠胰岛素原素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌目录目录 优点：点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因及真核基因组DNA 可适当修可适当修饰表达的蛋白表达的蛋白质 表达表达产物分区域物分区域积累累 缺点：缺点：操作技操作技术难、费时、经济 转染染 将表达将表达载体体导入真核入真核细胞的胞的过程程方法：方法：磷酸磷酸钙转染染 DEAE葡聚糖介葡聚糖介导转染染 电穿孔穿孔 脂脂质体体转染染 显微注射微注射 2.2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）表达表达载体体pFASTBACI 的物理的物理图谱表达表达载体体YEpI PT的物理的物理图谱目录目录第三节第三节 重组重组DNA技术与医学技术与医学的关系非常密切并前景远大的关系非常密切并前景远大DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective目录目录一、疾病基因的发现与克隆一、疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性根据基因定位克隆之并研究其性质，而而认识疾病的分子机制。疾病的分子机制。 疾病基因疾病基因发现的两个典型例子的两个典型例子: 脆性脆性X综合征合征Kallmann综合征合征目录目录二、生物制药二、生物制药利用基因工程生利用基因工程生产有有药用价用价值的蛋白的蛋白质、多、多肽产品已成品已成为当今世界一当今世界一项重大重大产业，并将，并将有望成有望成为2121世世纪的支柱的支柱产业。 美国美国Eli Lilly公司于公司于19821982年首先利用重年首先利用重组DNADNA技技术合成人胰合成人胰岛素并投放市素并投放市场，标志着生物志着生物工程工程药物物时代的开始。迄今代的开始。迄今为止，已有止，已有5050多多种基因工程种基因工程药物上市，近千种物上市，近千种处于研于研发状状态，形成一个巨大的高新技形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可生了不可估量的社会效益和估量的社会效益和经济效益。效益。目录目录 重重组DNA医医药产品品目录目录基基因因诊断断(genetic diagnosis)是利利用用分分子子生生物物学学及及分分子子遗传的的技技术和和原原理理，在在DNA水水平平分分析析、鉴定定遗传疾疾病病所所涉涉及及基基因因的的置置换、缺缺失失或或插插入入等等突突变。又又称称DNA诊断诊断 。三、基因诊断与治疗三、基因诊断与治疗（一）基因诊断的概念（一）基因诊断的概念目录目录基本过程：基本过程： 区分或区分或鉴定定DNA的异常的异常分离、分离、扩增待增待测的的DNA片断片断目录目录能正确能正确扩增靶基因；增靶基因；能准确区分能准确区分单个碱基的差个碱基的差别；本底或噪声低，不干本底或噪声低，不干扰DNA的的鉴定定;便于完全自便于完全自动化操作，适合大面化操作，适合大面积、大人群普大人群普查。标准：标准：目录目录（二）基因治疗的概念（二）基因治疗的概念定义定义基因治基因治疗(gene therapy)是向有功能缺是向有功能缺陷的陷的细胞胞补充相充相应功能的基因，以功能的基因，以纠正或正或补偿其基因的缺陷，从而达到治其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。的目的。方式方式体体细胞基因治胞基因治疗 (somatic cell gene therapy)性性细胞基因治胞基因治疗 (germ line gene therapy)目录目录1. 产前诊断产前诊断2. 携带者测试携带者测试3. 症候前诊断症候前诊断4. 遗传病易感性遗传病易感性四、遗传疾病的预防四、遗传疾病的预防