水质水质粪大肠菌群的测定粪大肠菌群的测定（多管发酵法）（多管发酵法）HJ/T347-2007四川省城镇供排水协会四川省城镇供排水协会曾蓉宁2 水中微生物简介 自然界的水可分为地下水和地面水，除了地下深层水外，如湖泊，河流，海洋等各种地面水中都存在着各种各样的微生物。但它们所含的微生物种类，数量和分布都不相同。其中有些是“土生土长”的。另一些水生细菌是外来的，它们来自土壤，空气，垃圾，工厂废物或城市下水道污水。而来自下水道的微生物中，很可能含有人体肠道致病菌，例如霍乱，伤寒，副伤寒和痢疾等病原菌。 4污水的细菌学检验污水的细菌学检验 水质的细菌学检验主要包括两个常规项目：细菌总数和总大肠菌群。 5 总大肠菌群测定的两种方法 多管发酵法多管发酵法滤膜法滤膜法6粪大肠菌群的定义粪大肠菌群的定义粪大肠菌群粪大肠菌群是总大肠菌群的一部分，主要来自粪便。在44.5温度下能生长并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。用提高培养温度的方法，造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件，使培养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群，从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。7适用范围适用范围本标准适用于地表水，地下水及废水中粪大肠菌群的测定。8原理原理 多管发酵法多管发酵法是以最可能数（most probable number），简称MPN 来表示试验结果的。实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。9培养基及试剂培养基及试剂 本标准所用试剂除另有说明，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。10 单倍乳糖蛋白胨培养液单倍乳糖蛋白胨培养液：将10g 蛋白胨、3g 牛肉寖膏、5g 乳糖和5g 氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调节溶液pH 为7.27.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于115高压灭菌器中灭菌20min，贮存于冷暗处备用。11 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组分用量增加至三倍。（即按上述配方比例三倍（除蒸馏水外），配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液）12 EC培养液：培养液：成分： 胰胨 20克， 乳糖 5克， 胆盐三号 1.5克，磷酸氢二钾（K2HPO4）4克，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5克，氯化钠5克，蒸馏水1000毫升。制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含有 玻璃倒管的试管中。置高压蒸气灭菌器中，115高压灭菌器中灭菌20min，灭菌后pH应为6.9。13培养基的存放培养基的存放 在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低，温度低于30摄氏度的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌倾入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时应废弃不用。14测定步骤测定步骤 1. 水样接种量的选择水样接种量的选择将水样充分混匀后，根据水样污染的程度将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。管。相对未受污染的水样接种量为相对未受污染的水样接种量为10ml、1ml、0.1ml。受污染水样接种量根据污染程度接。受污染水样接种量根据污染程度接种种1ml、0.1ml、0.01ml、或、或0.1ml、0.01ml、0.001ml等。等。15培养液的浓度和量的选择：培养液的浓度和量的选择：如接种体积为10 ml，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为1mL或少于1mL，则可接种普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中。162.初发酵试验初发酵试验 将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在370.5下培养24h2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。入在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。17 注意：注意：加入水样时，先将培养管管口用酒精灯消毒一次，加入水样后再用酒精灯消毒一次，封口。18阳性的判别阳性的判别：既产酸又产气：观察观察：24h小时后取出观察培养 管，颜色由紫色变为黄色和有 气泡产生两个方面才能判为阳性193. 复发酵试验复发酵试验轻微震荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒将培养物转移到EC培养液中。在44.50.5下培养24h2h（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。接种后所有发酵管必须在30分钟内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。20 结果的计算 根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从表2或表3中查得每升水样中的粪大肠菌群。接种水样为100ml 2份，10ml 10份，总量300ml 时，查表2可得每升水样中粪大肠菌群；接种5份10ml 水样，5份1ml水样，5份0.1ml水样时，查表3求得MPN指数，MPN值再乘10，即为1升水样中的粪大肠菌群；21举例举例：某水样接种10mL 的5 管均为阳性；接种1mL 的5 管中有2 管为阳性；接种1：10 的水样1mL 的5 管均为阴性。从最可能数（MPN）表中查检验结果5-2-0，得知100mL 水样中的总大肠菌群数为49 个，故1L 水样中的总大肠菌群数为4910=490 个。22如果接种的水样量不是10mL、1mL 和0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN 指数，再经下面公式换算成每100mL 的MPN 值。表表2大肠菌群检数表大肠菌群检数表接种水样总量接种水样总量300mL(100mL2300mL(100mL2份，份，10mL1010mL10份份) )183825 注意事项灭菌初发酵后以有阴、有阳稀释效果最好。水样一定要摇均。每个稀释倍数要求做5管。接种环要求用酒精灯灼烧消毒，复发酵接种时每一管都要在酒精灯上灼烧消毒。26 思考题配制好的培养基保存多少时间？存放时应注意哪些事项？27答：配制好的培养基不宜保存过久，以少量勤配为宜。已灭菌的培养基可在4100C存放一个月。存放时应避免阳光直射，并且避免杂菌侵入和液体蒸发。28 填空题填空题 1. 细菌采样玻璃瓶洗涤干燥后，要在 0C干热灭菌 或高压蒸汽 0C灭菌 min。2. 对受污染严重的水体，可选择 方法测定其总大肠菌群数。3. 总大肠菌群测定过程的复发酵试验中，接种完菌落后，应将发酵管置于 0C温度下培养 h。4. 复发酵试验使用 培养基。29计算题：计算题：某水样接种10mL 的5 管中有4管为阳性；接种1mL 的5 管中有3 管为阳性；接种1：10 的水样1mL 的5 管中有1管为阳性。求1L 水样中的总大肠菌群数为多少？