2024/8/14综合化学实验综合化学实验综合化学实验综合化学实验- -化学生物学专题实验化学生物学专题实验化学生物学专题实验化学生物学专题实验 指指导教教师：马林，蔡小玲林，蔡小玲 化化学与学与化化学学工程工程学学院院抗菌药物筛选抗菌药物筛选的实验方法与的实验方法与技术技术 2024/8/14v一个新的化合物或分离提取有效成分是否有抗菌作用，需一个新的化合物或分离提取有效成分是否有抗菌作用，需要药理实验来证实，首先采用体外实验方法，观察试验物要药理实验来证实，首先采用体外实验方法，观察试验物对细菌有无杀灭作用或抑制作用，体外实验的重要性在于对细菌有无杀灭作用或抑制作用，体外实验的重要性在于方法简便，用药量少，短时间内能判断药物抗菌的广度和方法简便，用药量少，短时间内能判断药物抗菌的广度和强度，为深入体外实验和体内药效研究提供数据。强度，为深入体外实验和体内药效研究提供数据。v体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。药物对细菌代谢的影响、可以使细胞呼吸量减低，或酶系药物对细菌代谢的影响、可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌不生长或部分抑制，可借以统受到抑制等，因而出现细菌不生长或部分抑制，可借以判断药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。体外实验是判断药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。体外实验是细菌与药物直接接触，没有机体诸因素参与，故体外和体细菌与药物直接接触，没有机体诸因素参与，故体外和体内实验的结果不一定完全一致，需两方面综合分析进行评内实验的结果不一定完全一致，需两方面综合分析进行评价。价。2024/8/14一、实验目的一、实验目的一、实验目的一、实验目的1，掌握培养基的制备、，掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌、菌种培养高压蒸气灭菌、菌种培养、接种等微生物培养技术；、接种等微生物培养技术；2，掌握化合物抗菌、抑，掌握化合物抗菌、抑菌活性筛选技术；菌活性筛选技术；3，掌握微孔板法、抑菌，掌握微孔板法、抑菌圈法抗菌最小浓度测试等圈法抗菌最小浓度测试等基本操作技术。基本操作技术。4，学会使用各种仪器设学会使用各种仪器设备备 。实验中使用的仪器设备：实验中使用的仪器设备：1，手提式高压蒸汽灭菌锅；，手提式高压蒸汽灭菌锅；2，超净工作台；，超净工作台；3，各种移液器；，各种移液器；4，细菌恒温培养箱；，细菌恒温培养箱；5，微生物培养摇床；，微生物培养摇床；6，酶标仪；，酶标仪；2024/8/14二、微生物培养基的配制、灭菌与培养二、微生物培养基的配制、灭菌与培养二、微生物培养基的配制、灭菌与培养二、微生物培养基的配制、灭菌与培养培养基是指利用人工方法将适培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖成积累代谢合微生物生长繁殖成积累代谢产物的各种营养物质混合配制产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质。主要用于微而成的营养基质。主要用于微生物的分离、培养、鉴定以及生物的分离、培养、鉴定以及菌种保藏等方面。菌种保藏等方面。培养基一般应含有微生物生长培养基一般应含有微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能繁殖所需要的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等源、无机盐、生长因子和水等营养成分。营养成分。此外，为了满有微生物生长繁此外，为了满有微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基的必须控制培养基的pHpH。培养基可分为天然培养基、合成培培养基可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。养基和半合成培养基。按培养基的物理状态，可将培养基按培养基的物理状态，可将培养基分为固体培养基、半固体培养基和分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。液体培养基。固体培养基是指在液体培养基中加固体培养基是指在液体培养基中加入一定量的凝固剂入一定量的凝固剂( (常加常加1.5%-2%1.5%-2%的的琼脂琼脂) )经融化冷凝而成。经融化冷凝而成。半固体培养这是指在液体培养基中半固体培养这是指在液体培养基中加入加入0.80.8-1-1左右的琼脂，经融化左右的琼脂，经融化冷凝而成。冷凝而成。液体培养基是指培养基中不加凝固液体培养基是指培养基中不加凝固剂琼脂，培养基呈液体状态。剂琼脂，培养基呈液体状态。 2024/8/14（一）基本原理（一）基本原理（一）基本原理（一）基本原理v正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。多，它们的配方及配制方法虽各有差异。v但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及接菌等基本养基的灭菌，斜面与平板的制作以及接菌等基本环节大致相同。环节大致相同。 2024/8/14（二）实验过程（二）实验过程（二）实验过程（二）实验过程1 1，液体及固体培养基的配制过，液体及固体培养基的配制过程程 一般培养基的组成一般培养基的组成 牛肉膏牛肉膏 0.5g0.5g蛋白胨蛋白胨 1g1g NaClNaCl 0.5g 0.5g 琼脂琼脂 1.5-2g1.5-2g水水 100ml100mlpH 7.2 pH 7.2 液体培养基不加琼脂即可。液体培养基不加琼脂即可。(1)(1)称量及溶化称量及溶化 分别称取蛋白胨、分别称取蛋白胨、NaClNaCl、牛肉膏置于另一小烧杯中，进、牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化。杯中，加热融化。(2)(2)调调pH pH 待溶液冷至室温时，用待溶液冷至室温时，用0.1mol/L 0.1mol/L NaOHNaOH溶液调溶液调pHpH至至7.27.2。(3)(3)定容定容 将溶液倒入量筒中，补充将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。水量至所需体积。(4)(4)固体培养基加入所需量的琼脂，固体培养基加入所需量的琼脂，加热融化，补充失水。加热融化，补充失水。(5)(5)分装、加塞、包扎。分装、加塞、包扎。(6)(6)高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌100 Pa100 Pa灭菌灭菌20 min20 min2024/8/142 2，培养基的分装，培养基的分装液体培养基装入试管培养液体培养基装入试管培养基的量视试管大小及需要基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为而定，若所用试管大小为1515150 mm150 mm时，液体培养时，液体培养基可分装至试管高度基可分装至试管高度1/41/4左右为宜（约左右为宜（约5ml5ml）；）；分装团体培养基时，在琼分装团体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分脂完全融化后，应趁热分装于试管中分装量为管高装于试管中分装量为管高1/5(1/5(约约4-5ml)4-5ml)。2024/8/143 3，棉塞的制作及试管、锥形瓶，棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎的包扎 （1 1）试管棉塞的制作）试管棉塞的制作 制棉塞时，应选用大小、制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一快，铺厚薄适中的普通棉花一快，铺展于左手拇指和食指如成的圆展于左手拇指和食指如成的圆孔上，用右手食指将棉花从中孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞，然后央压入团孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。直接压入试管或锥形瓶口。 将装好培养基并塞好棉塞或盖将装好培养基并塞好棉塞或盖好管帽的试管捆成好管帽的试管捆成捆，外面捆，外面包上一层牛皮纸。用铅笔注明包上一层牛皮纸。用铅笔注明培养基名称及配制日期。灭菌培养基名称及配制日期。灭菌待用。待用。2024/8/144 4，培养基的灭菌培养基的灭菌 高压蒸汽灭菌是微生物学实验、发酵工业高压蒸汽灭菌是微生物学实验、发酵工业生产、以及外科手术器械等方面最常用的生产、以及外科手术器械等方面最常用的一种灭菌方法。一种灭菌方法。 （1 1）打开灭菌锅盖，加适量水；）打开灭菌锅盖，加适量水；（2 2）将待灭菌物品放入灭菌桶内。（）将待灭菌物品放入灭菌桶内。（3 3）将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，加盖，将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，加盖，上下螺栓口对齐，均匀旋紧螺栓，使锅密上下螺栓口对齐，均匀旋紧螺栓，使锅密闭。闭。（4 4）打开放汽阀，加热，自锅内开始产）打开放汽阀，加热，自锅内开始产生蒸汽后再关紧放汽阀，待压力逐渐上升生蒸汽后再关紧放汽阀，待压力逐渐上升至所需温度时，控制热源，维持所需压力至所需温度时，控制热源，维持所需压力和温度，并开始计时和温度，并开始计时20 min20 min后停止加热。后停止加热。（5 5）待压力降至接近）待压力降至接近0 0时，慢慢打开放汽时，慢慢打开放汽阀阀( (排汽口排汽口) )，开盖，立即取出灭菌物品。，开盖，立即取出灭菌物品。2024/8/145 5，斜面和平板的制作，斜面和平板的制作 将巳灭菌装有琼脂培养基将巳灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒上，的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即使成适当斜度，凝固后即成斜面成斜面( (图图1-3)1-3)斜面长度斜面长度不超过试管长度不超过试管长度1/21/2为宜。为宜。2024/8/14平板的制作平板的制作平板的制作平板的制作 2024/8/146 6，斜面培养基接种，斜面培养基接种 斜面培养基接种法斜面培养基接种法一般不用作分离培一般不用作分离培养，仅使细菌繁殖养，仅使细菌繁殖为菌种传代或观察为菌种传代或观察其某些生化特性之其某些生化特性之用。用。 (1)(1)接种灭菌接种灭菌 (2)(2)开开启棉塞启棉塞 (3)(3)管口灭管口灭菌菌 (4)(4)挑起菌苔挑起菌苔 (5)(5)接种接种 (6)(6)塞好棉塞好棉塞。塞。2024/8/147 7，液液体体培培养养基基接接种种法法2024/8/14三、微量稀释法体外抗菌实验三、微量稀释法体外抗菌实验三、微量稀释法体外抗菌实验三、微量稀释法体外抗菌实验v连续稀释法（试管稀释法）通常用于测定微生物连续稀释法（试管稀释法）通常用于测定微生物的最小抑菌浓度（的最小抑菌浓度（MICMIC），即将微生物的浓度按），即将微生物的浓度按几何级数或数学级数进行递减稀释，然后将不同几何级数或数学级数进行递减稀释，然后将不同浓度的微生物混入含试验菌的液体培养基或固体浓度的微生物混入含试验菌的液体培养基或固体培养基中，经培养后，能抑制试验菌生长的最低培养基中，经培养后，能抑制试验菌生长的最低浓度，即为该微生物的最小抑菌浓度。浓度，即为该微生物的最小抑菌浓度。v微量稀释法微量稀释法 此种方法常用于测定细菌对药物敏此种方法常用于测定细菌对药物敏感性或新药对细菌的抗菌活性试验。一般应用感性或新药对细菌的抗菌活性试验。一般应用9696孔微量稀释板，孔底呈孔微量稀释板，孔底呈U U型，每孔容量为型，每孔容量为0.20-0.20-0.30ml0.30ml。本法操作较便，用培养基量少，可作大。本法操作较便，用培养基量少，可作大批量药敏试验。批量药敏试验。2024/8/14( ( ( (一）实验过程一）实验过程一）实验过程一）实验过程（1 1）实验菌的准备。）实验菌的准备。选选取取大大肠肠杆杆菌菌(Escherichia coli)、 金金 黄黄 色色 葡葡 萄萄 球球 菌菌( (Staphylicoccus aureus) )、白白色色葡葡萄萄球球菌菌( (Staphylococcus albus) )、蜡蜡状状芽芽孢孢杆杆菌菌菌菌种种在在营营养养琼琼脂脂斜斜面面培培养养基基上上传传代代培培养养一一次次后后，再再将将其其接接种种至至营营养养肉肉汤汤培培养养基基中中3737培培养养6-12 6-12 h h，冰箱备用。冰箱备用。（2 2）抗抗菌菌化化合合物物的的初初步步筛筛选选，按按下下表表取取9696孔孔培培养养板板一一块块，进进行行编编号号，将将4444种种化化合合物物（由由有有机机化化学学研研究究所所其其他他教教师师和和研研究究生生提提供供）用用 DMSODMSO或或 蒸蒸 馏馏 水水 配配 制制 成成5050 mol/mlmol/ml，（也也可可用用无无菌菌过过滤滤器器过过滤滤后后）放放置置在在灭菌的小离心管中。灭菌的小离心管中。2024/8/14筛选实验过程筛选实验过程筛选实验过程筛选实验过程（3 3）在在超超净净工工作作台台内内，酒酒精精灯灯下下，将将液液体体培培养养的的细细菌菌菌菌种种用用培培养养液液进进行行稀稀释释，稀稀释释度度为为1 1：10001000或或1:5001:500。用用无无菌菌的的移移液液器器（吸吸咀咀经经过过灭灭菌菌处处理理）将将稀稀释释的的液液体体菌菌种种198198 l l加加入入到到除除了了A1,B1A1,B1以以外外的的孔孔内内，2 2 l l各各种种化化合合物物溶溶液液（DMSODMSO配配置置），A1,B1,C1,D1A1,B1,C1,D1加加200 200 l l培培养养液液，震震荡荡混混合合后后3737培培养养12h-18h, 12h-18h, 用用酶酶标标仪仪630nm630nm侧侧吸吸光光度度。DMSODMSO的的最最终终浓浓度度保保持持在在1%1%。每每个个样样品品设设两两个个平平行孔。行孔。2024/8/149696孔细胞培养板加样安排孔细胞培养板加样安排孔细胞培养板加样安排孔细胞培养板加样安排1 12 23 34 45 56 67 78 89 9101011111212A A培养液培养液200200 l l样品样品1 12 23 34 45 56 67 78 89 910101111B B培养液培养液200200 l l样品样品1 12 23 34 45 56 67 78 89 910101111C C培养液培养液200200 l l样品样品12121313141415151616171718181919202021212222D D培养液培养液200200 l l样品样品12121313141415151616171718181919202021212222E E菌对照菌对照(2(2 l l DMSO)DMSO)样品样品23232424252526262727282829293030313132323333F F菌对照菌对照(2(2 l l DMSO)DMSO)样品样品23232424252526262727282829293030313132323333G G菌对照菌对照(2(2 l l DMSO)DMSO)样品样品34343535363637373838393940404141424243434444H H菌对照菌对照(2(2 l l DMSO)DMSO)样品样品34343535363637373838393940404141424243434444样品浓度样品浓度0.02mmol/ml 0.02mmol/ml 样品分子量样品分子量/100.mg /100.mg 用用DMSODMSO配成配成0.5ml0.5ml即可，每即可，每次实验用次实验用2 2 l l，9696孔板的孔体积孔板的孔体积200200 l l，样品的最终浓度为，样品的最终浓度为200200 mol/Lmol/L，大于该浓度则无价值。大于该浓度则无价值。2024/8/14试验用样品试验用样品试验用样品试验用样品1.1.环丙沙星环丙沙星 2.2.2 2 ,4,4 ,3-,3-三羟基二苯甲酮三羟基二苯甲酮 3.3.2,4,42,4,4 - -三羟基二苯甲酮三羟基二苯甲酮 4.4.2,4,22,4,2 - -三羟基二苯甲酮三羟基二苯甲酮 5.5.2,3,4,22,3,4,2 - -四羟基二苯甲酮四羟基二苯甲酮 6.6.2,3,4,32,3,4,3 - -四羟基二苯甲酮四羟基二苯甲酮 7.7.2,3,4,42,3,4,4 - -四羟基二苯甲酮四羟基二苯甲酮 8.8.2,4,22,4,2 ,4,4 - -四羟基二苯甲酮四羟基二苯甲酮 9.9.2,3,4,22,3,4,2 ,4,4 - -五羟基二苯甲酮五羟基二苯甲酮 10.10.丹皮酚丹皮酚 11.11.丹皮酚丹皮酚- -镍（镍（IIII）配合物）配合物 12.12.丹皮酚丹皮酚- -氧钒（氧钒（V V）配合物）配合物 13.13.丹皮酚丹皮酚- -铜（铜（IIII）配合物）配合物 14.14.丹皮酚丹皮酚- -钴（钴（IIII）配合物）配合物 15.15.丹皮酚丹皮酚- -锰（锰（IIII）配合物）配合物 16.16.丹皮酚丹皮酚- -锌（锌（IIII）配合物）配合物 17.17.苯甲基苯甲基-N-N-苯基亚胺苯基亚胺 18.18.3-3-羟基苯甲基羟基苯甲基-N-N-苯基亚胺苯基亚胺 19.19.4-4-羟基苯甲基羟基苯甲基-N-2,4-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺二甲氧基苯基亚胺 20.20.2-2-羟基苯甲基羟基苯甲基-N-3,5-N-3,5-二苯基亚胺二苯基亚胺 21.21.3,4-3,4-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-N-N-苯基亚胺苯基亚胺 22.22.4-4-羟基苯甲基羟基苯甲基-N-3,4-N-3,4-二甲氧基苯基亚胺二甲氧基苯基亚胺 23. 4-23. 4-羟基羟基-3-3-甲氧基甲氧基-N-2,4-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺二甲氧基苯基亚胺24. 24. 苯甲基苯甲基-N-4-N-4-羟基苯基亚胺羟基苯基亚胺 1.1.3,4-3,4-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-N-2,4-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺二甲氧基苯基亚胺2.2.4-4-羟基苯甲基羟基苯甲基-N-4-N-4-羟基苯基亚胺羟基苯基亚胺3.3.3,5-3,5-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-N-3,4-N-3,4-二甲氧基苯基亚胺二甲氧基苯基亚胺4.4.2,5-2,5-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-N-4-N-4-羟基苯基亚胺羟基苯基亚胺 5.5.2,4-2,4-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-N-4-N-4-羟基苯基亚胺羟基苯基亚胺 6.6.2,4-2,4-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-N-2,4-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺二甲氧基苯基亚胺7.7.4-4-羟基苯甲基羟基苯甲基-N-3-N-3-羟基苯基亚胺羟基苯基亚胺8.8.3,5-3,5-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-N-2,4-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺二甲氧基苯基亚胺 9.9.4-4-羟基羟基-3-3-甲氧基甲氧基-N-3,4-N-3,4-二甲氧基苯基亚胺二甲氧基苯基亚胺 10.10.4-4-羟基苯甲基羟基苯甲基-N-4-N-4-甲基苯基亚胺甲基苯基亚胺 11.11.4-4-羟基羟基-3-3-甲氧基苯甲基甲氧基苯甲基-N-4-N-4-甲基苯基亚胺甲基苯基亚胺 12.12.3,5-3,5-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-N-4-N-4-甲基苯基亚胺甲基苯基亚胺 13.13.2,4-2,4-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-N-4-N-4-甲基苯基亚胺甲基苯基亚胺 14.14.4-4-磺酸基磺酸基-3-3 ,4,4 - -二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯15.15.4-4-磺酸基磺酸基-2-2 ,4,4 - -二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯16.16.4-4-硝基硝基-3-3 ,4,4 - -二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯17.17.4-4-硝基硝基-2-2 ,4,4 - -二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯18.18.4-4-硝基硝基-2-2 ,5,5 - -二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯19.19.4-4-溴溴-3-3 ,4,4 - -二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯 20.20.对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸甲酯 2024/8/14筛选数据分析筛选数据分析筛选数据分析筛选数据分析 测测试试的的样样品品中中，1 1号号样样为为市市场场上上临临床床使使用用的的环环丙丙沙沙星星，浓浓度度为为0.005mmol/L0.005mmol/L。 其其 他他 样样 品品 浓浓 度度 为为0.02mmol/L0.02mmol/L。 实实验验中中，以以培培养养基基为为空空白白0%0%，以以带带菌菌培培养养液液为为对对照照100%100%。如如果果酶酶标标仪仪630nm630nm测测试试的的结结果果中中，空空白白为为-0.2-0.2，空空内内液液体体呈呈透透明明清清澈，对照孔的值为澈，对照孔的值为+0.1-0+0.1-0.2 2。如如果果测测试试样样品品的的值值也也同同样样达达到到- -0.20.2，表表明明样样品品在在200200 mol/Lmol/L具具有有较好的抗菌活性。较好的抗菌活性。如如果果测测试试样样品品的的值值在在对对照照孔孔和和空空白白之之间间，表表明明样样品品在在高高浓浓度度有有抗抗菌菌作作用用，请请选选取取1111个个抗抗菌菌效效果果较较好好的的样样品品做做下下面面的的最最小小抑抑菌菌浓浓度度实验。实验。2024/8/14筛选数据分析筛选数据分析筛选数据分析筛选数据分析 测测试试的的样样品品中中，1 1号号样样为为市市场场上上临临床床使使用用的的环环丙丙沙沙星星，浓浓度度为为0.005mmol/L0.005mmol/L。 其其 他他 样样 品品 浓浓 度度 为为0.02mmol/L0.02mmol/L。 实实验验中中，以以培培养养基基为为空空白白0%0%，以以带带菌菌培培养养液液为为对对照照100%100%。如如果果酶酶标标仪仪630nm630nm测测试试的的结结果果中中，空空白白为为-0.2-0.2，空空内内液液体体呈呈透透明明清清澈，对照孔的值为澈，对照孔的值为+0.1-0+0.1-0.2 2。如如果果测测试试样样品品的的值值也也同同样样达达到到- -0.20.2，表表明明样样品品在在200200 mol/Lmol/L具具有有较好的抗菌活性。较好的抗菌活性。如如果果测测试试样样品品的的值值在在对对照照孔孔和和空空白白之之间间，表表明明样样品品在在高高浓浓度度有有抗抗菌菌作作用用，请请选选取取1111个个抗抗菌菌效效果果较较好好的的样样品品做做下下面面的的最最小小抑抑菌菌浓浓度度实验。实验。2024/8/14（4 4 4 4）最小抑菌浓度或）最小抑菌浓度或）最小抑菌浓度或）最小抑菌浓度或EC50EC50EC50EC50的测试的测试的测试的测试 v操作步骤与试管稀释法相似，一般常用操作步骤与试管稀释法相似，一般常用MHMH培养基，培养基，根据上面筛选试验选取出来的样品，在微孔板孔根据上面筛选试验选取出来的样品，在微孔板孔内用微量移液器直接在微孔板孔内作二倍稀释，内用微量移液器直接在微孔板孔内作二倍稀释，然后接种稀释菌液，其中留一列孔作为药液对照，然后接种稀释菌液，其中留一列孔作为药液对照，另一孔仅加培养基和菌液作为菌对照，试验完毕另一孔仅加培养基和菌液作为菌对照，试验完毕后，用微量搅拌器震荡混匀后，置后，用微量搅拌器震荡混匀后，置3737温孵温孵12-12-18h18h，用酶标仪，用酶标仪630nm630nm侧吸光度。侧吸光度。2024/8/14样品稀释后的浓度表样品稀释后的浓度表样品稀释后的浓度表样品稀释后的浓度表A 培养液培养液200 l样品样品1，200 M234567891011B 培养液培养液200 l样品样品1，100 MC 培养液培养液200 l样品样品1，50 MD 培养液培养液200 l样品样品1，25 ME 菌对照菌对照(2 l DMSO)样品样品1，12.5 MF 菌对照菌对照(2 l DMSO)样品样品1，6.25 MG 菌对照菌对照(2 l DMSO)样品样品1，3.13 MH 菌对照菌对照(2 l DMSO)样品样品1，1.56 M2024/8/14（二）数据处理与分析（二）数据处理与分析（二）数据处理与分析（二）数据处理与分析抗抗菌菌药药物物的的最最小小抗抗菌菌浓浓度度测测试结果可能出现两种形式：试结果可能出现两种形式：1 1，在在某某一一个个稀稀释释的的样样品品浓浓度度，结结果果表表现现出出细细菌菌没没有有生生长长，菌菌液液较较清清（可可与与空空白白培培养养基基比比），而而下下一一个个稀稀释释的的样样品品浓浓度度，菌菌液液中中细细菌菌生生长长比比较较旺旺盛盛（可可与与含含菌菌对对照照比比），那那么么，这这个个稀稀释释的的样样品品浓浓度度就就为为该该样样品品抗抗菌菌的的最最小小浓浓度度。这这种种化化合合物物的的抗抗菌菌作作用用可以称为杀菌作用。可以称为杀菌作用。如如右右表表中中红红色色值值中中的的样样品品浓浓度就是最小抗菌浓度。度就是最小抗菌浓度。培养液值培养液值-0.2013-0.2013样品样品1 1值值-0.2094-0.2094样品样品2 2值值-0.2066-0.2066培养液值培养液值-0.2027-0.2027样品样品1 1值值-0.2102-0.2102样品样品2 2值值-0.2103-0.2103培养液值培养液值-0.2005-0.2005样品样品1 1值值-0.2068-0.2068样品样品2 2值值-0.2112-0.2112培养液值培养液值-0.2106-0.2106样品样品1 1值值-0.2054-0.2054样品样品2 2值值-0.2022-0.2022菌对照值菌对照值 0.21820.2182样品样品1 1值值-0.2028-0.2028样品样品2 2值值 0.20870.2087菌对照值菌对照值 0.20680.2068样品样品1 1值值-0.2008-0.2008样品样品2 2值值 0.21120.2112菌对照值菌对照值 0.21460.2146样品样品1 1值值 0.20230.2023样品样品2 2值值 0.20880.2088菌对照值菌对照值 0.20330.2033样品样品1 1值值 0.20360.2036样品样品2 2值值 0.20330.20332024/8/142 2，实实验验中中，不不同同稀稀释释的的样样品品浓浓度度的的测测试试结结果果没没有有上上面面的的现现象象，而而是是出出现现规规律律性性的的上上升升。即即，这这种种样样品品测测出出的的数数据据是是随随着着样样品品浓浓度度的的下下降降而而上上升升，可可以以根根据据其其数数据据画画出出一一条条细细菌菌的的生生长长曲曲线线，如如果果对对照照样样的的值值定定为为100%100%，可可以以从从曲曲线线上上求求出出抑抑制制50%50%时时样样品品的的浓浓度度，所所以以，我我们们称称这这种种 抗抗菌菌为为抑抑菌菌作作用用，表表明明该该化化合合物物不不能能杀杀死死细细菌菌，但可以抑制其生长。但可以抑制其生长。培养液值培养液值-0.2013-0.2013样品样品1 1值值-0.2194-0.2194样品样品2 2值值-0.2166-0.2166培养液值培养液值-0.2027-0.2027样品样品1 1值值-0.2082-0.2082样品样品2 2值值-0.1893-0.1893培养液值培养液值-0.2005-0.2005样品样品1 1值值-0.1694-0.1694样品样品2 2值值-0.1002-0.1002培养液值培养液值-0.2106-0.2106样品样品1 1值值-0.1268-0.1268样品样品2 2值值 0.00220.0022菌对照值菌对照值 0.21820.2182样品样品1 1值值-0.0428-0.0428样品样品2 2值值 0.05870.0587菌对照值菌对照值 0.20680.2068样品样品1 1值值-0.0023-0.0023样品样品2 2值值 0.16120.1612菌对照值菌对照值 0.21460.2146样品样品1 1值值 0.68040.6804样品样品2 2值值 0.20880.2088菌对照值菌对照值 0.20330.2033样品样品1 1值值 0.13890.1389样品样品2 2值值 0.21330.21332024/8/14四、琼脂扩散法四、琼脂扩散法四、琼脂扩散法四、琼脂扩散法v此种方法包括纸片法，杯碟法挖洞法等，它们的共同点此种方法包括纸片法，杯碟法挖洞法等，它们的共同点均在平皿琼脂内加入适量测试细菌，按上述方法放置适量均在平皿琼脂内加入适量测试细菌，按上述方法放置适量药液在菌层上，药物在琼脂四周扩散，经孵育后，细菌生药液在菌层上，药物在琼脂四周扩散，经孵育后，细菌生长受抑制，出现抑菌圈，测定抑菌圈直径，能了解细菌对长受抑制，出现抑菌圈，测定抑菌圈直径，能了解细菌对药物的敏感程度。药物的敏感程度。 v琼脂扩散法可定性或初步判断该化合物的抗菌能力，一般琼脂扩散法可定性或初步判断该化合物的抗菌能力，一般是将化合物稀释后，加如含试验菌的混菌平板中，由于化是将化合物稀释后，加如含试验菌的混菌平板中，由于化合物在琼脂培养基中的扩散作用，使化合物周围的试验菌合物在琼脂培养基中的扩散作用，使化合物周围的试验菌不能生长，从而产生抑菌圈或抑菌带。根据抑菌圈或抑菌不能生长，从而产生抑菌圈或抑菌带。根据抑菌圈或抑菌带的大小来评价化合物抗菌作用的强弱。带的大小来评价化合物抗菌作用的强弱。2024/8/14图图: :标准曲线法标准曲线法 图图 ：链霉素标准曲线：链霉素标准曲线 双碟、钢管与抑菌圈位置图双碟、钢管与抑菌圈位置图S S：标准品：标准品T T：供试品：供试品 抑菌圈直径抑菌圈直径(mm)(mm)2024/8/14（一）滤纸片法实验过程（一）滤纸片法实验过程（一）滤纸片法实验过程（一）滤纸片法实验过程 （1 1）试验菌的准备。在营养培养基接种）试验菌的准备。在营养培养基接种金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌种培养传代金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌种培养传代依次后，再移种至营养肉汤培养基中，在依次后，再移种至营养肉汤培养基中，在3737培养培养10-18h10-18h，取出备用。，取出备用。（2 2）混菌平板的植被。用无菌吸管分别）混菌平板的植被。用无菌吸管分别取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的肉汤培养取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的肉汤培养物，在无菌平皿中各滴加物，在无菌平皿中各滴加4-54-5滴，再将已滴，再将已溶化并冷却至溶化并冷却至4545的琼脂培养基倒入平皿的琼脂培养基倒入平皿中，每皿中，每皿20mL20mL，立即晃动平皿混匀，平放，立即晃动平皿混匀，平放台上，凝固后备用。台上，凝固后备用。（3 3）用记号笔在无菌平皿底部划十字线，）用记号笔在无菌平皿底部划十字线，将平板分为四将平板分为四- -六个区，每一个区上标注六个区，每一个区上标注加入药品名称。加入药品名称。（4 4）用无菌镊子取无菌滤）用无菌镊子取无菌滤纸片（直径纸片（直径6-8mm6-8mm），浸入），浸入待测药液（可以稀释成待测药液（可以稀释成4-64-6不同浓度），然后轻轻放不同浓度），然后轻轻放入混菌平板对应的区域中入混菌平板对应的区域中央，贴紧（如图）。央，贴紧（如图）。（5 5）将平皿放入）将平皿放入3737恒温恒温箱中倒置培养箱中倒置培养20h20h，然后观，然后观察结果。察结果。（6 6）用卡尺测量抑菌圈的）用卡尺测量抑菌圈的直径，以判断微生物的抑直径，以判断微生物的抑菌能力。菌能力。2024/8/142024/8/14效果评价效果评价效果评价效果评价v抑菌圈直径抑菌圈直径15mm 15mm 高度敏感高度敏感v抑菌圈直径抑菌圈直径10-15mm 10-15mm 中度敏感中度敏感v抑菌圈直径抑菌圈直径10mm 10mm 低度敏感低度敏感v无抑菌圈无抑菌圈 不敏感或耐药不敏感或耐药2024/8/14四、实验安排四、实验安排四、实验安排四、实验安排每周四上午，先进行抗菌药物的筛选，然后进行培养基每周四上午，先进行抗菌药物的筛选，然后进行培养基的配制、灭菌，斜面和液体试管培养的制作及接菌，为的配制、灭菌，斜面和液体试管培养的制作及接菌，为第二天的实验做准备。第二天的实验做准备。每周五上午，用酶标仪进行抗菌药物的测定，然后进行每周五上午，用酶标仪进行抗菌药物的测定，然后进行最小浓度测试和琼脂扩散法测试实验。每周六上午最小浓度测试和琼脂扩散法测试实验。每周六上午9 9时，时，用酶标仪检测最小抑菌浓度和抑菌圈测试。用酶标仪检测最小抑菌浓度和抑菌圈测试。 由指导教师预先进行细菌试管液体培养由指导教师预先进行细菌试管液体培养18-2018-20小时，为后小时，为后续实验做准备。续实验做准备。1232024/8/14五、实验注意事项五、实验注意事项五、实验注意事项五、实验注意事项实验中，需要细心，要正确使用移液器实验中，需要细心，要正确使用移液器1.注意观察，留意操作细节注意观察，留意操作细节2.实验结果分析、讨论须有自己的论点实验结果分析、讨论须有自己的论点3.