沉淀分离法及应用居里夫妇发现镭时就采取了共沉淀分离法中的分级结晶技术。镭的发现镭的发现共沉淀法共沉淀法 cooprecipitation method应用最早，1898年Curie夫妇提取了Po、Ra；优点是简单、富集倍数高、可用于直接制源，其缺点是分离效率和回收率低、废液量大、难于连续自动化基本原理基本原理定义：利用微量物质随常量物质一起沉淀来进行分离富集和纯化微量物质的方法。分类：按沉淀剂的不同分无机共沉淀法和有机共沉淀法无机共沉淀法按作用机理的不同又分为：混晶共沉淀法：选择性高、分离效果好，可用于微量放射性核素的分离吸附共沉淀法：清扫共沉淀，可用于水的净化，但由于选择性差，不适合于多种放射性核素特别是化学性质相似的元素分离有机共沉淀法有机共沉淀法富集倍数高，选择性好，已应用于放射化学的分离形成过程：无机离子 疏水性离子或化合物 选择适当的有机化合物作载体 共沉淀生成难溶的离子缔合物，如137Cs+ + 四苯硼酸根 生成难溶的金属螯合物或缔合物，如U + -亚硝基-萘酚 利用有机胶体的吸附作用而生成共沉淀共沉淀分离法中所使用的常量沉淀物质叫做载体（也称共沉淀剂）p 良好的选择性；p 定量性，能定量沉淀微痕量物质；p 不干扰测定（或者至少易被除去或掩蔽）；p 便于与母液分离，易洗涤和过滤；p 共沉淀效率高。共沉淀剂特点共沉淀法的应用共沉淀法的应用是目前分离和富集微量放射性物质的常用方法之一特别用在环境和生物样品的放化分析，如60Co的分析净化放射性废水和沾污的饮用水药物促排，如亚铁氰化物共沉淀促排体内的137Cs盐析法分离1. 定义 在高浓度中性盐存在下，使目标产物的溶解度减低而产生沉淀的过程。 特点浓缩倍数高、操作简便、经济、纯化倍数低等2. 盐析沉淀机理p 减弱静电斥力p 去水化膜等电点（isoelectric point） 定义：两性离子所带电荷因溶液的pH值不同而改变，当两性离子正负电荷数值相等时，溶液的pH值即其等电点。此时分子溶解度最小，可用于分离不同分子此时分子溶解度最小，可用于分离不同分子酸性酸性aaaaaaCOO- NH3+-OOC 碱性碱性aaaaaaCOO- NH3+3HN 溶液的溶液的溶液的溶液的PHPHPHPH值值值值7 7 7 7须加入较多的酸才能使须加入较多的酸才能使须加入较多的酸才能使须加入较多的酸才能使aaaaaaaa正负离子量相等正负离子量相等正负离子量相等正负离子量相等等电点等电点等电点等电点 7 7 7 7须加入碱，才能使负离须加入碱，才能使负离子量增加。子量增加。等电点等电点7 7。等电点时电荷中性等电点时电荷中性分子表面缺乏亲水的离子层分子表面缺乏亲水的离子层aa：amino acid pH=pI 溶解度最小溶解度最小等电点沉淀与分离等电点沉淀与分离大部或全部沉淀下来大部或全部沉淀下来pHpI仍留在溶液中仍留在溶液中蛋白质的分离蛋白质的分离沉淀出来的蛋白质可保持天然构象，能再溶解沉淀出来的蛋白质可保持天然构象，能再溶解于水并具有生物活性。于水并具有生物活性。蛋白电泳蛋白电泳Protein ElectrophoresisProtein Electrophoresis分离蛋白质的一种方法。由于不同蛋白质的等分离蛋白质的一种方法。由于不同蛋白质的等电点不同，所以在一定的电点不同，所以在一定的pHpH值它们所带的电荷值它们所带的电荷量不同，分子量也不同，在电场下它们运动的量不同，分子量也不同，在电场下它们运动的速度也不相同，由此可达到分离蛋白质的目的。速度也不相同，由此可达到分离蛋白质的目的。这种方法已被广泛应用于临床检验，如蛋白电这种方法已被广泛应用于临床检验，如蛋白电泳、脂蛋白电泳等。泳、脂蛋白电泳等。阴阴 极极阳阳 极极pH=pIpHpI带正电荷带正电荷带负电荷带负电荷净电荷为零净电荷为零导电率导电率溶解度溶解度渗透压渗透压粘度粘度达到最低达到最低等电点时蛋白质的特殊性质等电点时蛋白质的特殊性质原因原因:在等电点时，蛋白质分子以双极离子存在，总净在等电点时，蛋白质分子以双极离子存在，总净电荷为零电荷为零,颗粒无电荷间的排斥作用颗粒无电荷间的排斥作用,易凝集成大颗粒，易凝集成大颗粒，因而最不稳定，溶解度最小，易沉淀析出。因而最不稳定，溶解度最小，易沉淀析出。 电泳分电泳分离离沉淀分离沉淀分离 式中式中 S：蛋白质的溶解度，g/L; I：盐浓度，mol/L ; ：与盐的种类无关，但与温度、pH和蛋白质种类有关; Ks：与温度和pH无关，但与蛋白质和盐的种类有关。3 盐析沉淀平衡式（Cohn经验式）值随pH值变化 卵清蛋白（Ovalbumin）和碳氧血红蛋白进行盐析时，随pH的变化随pH 变化（1）对数关系（2） 等电点附近有极小值随温度变化随温度升高减小，热促失水膜用盐析法分离蛋白质的二种方法沉淀法沉淀法n 在一定的在一定的 pH值及温度条件下，改变盐的浓度（即离值及温度条件下，改变盐的浓度（即离子强度）达到沉淀的目的，称为子强度）达到沉淀的目的，称为“s”分级盐析法。分级盐析法。 （Ks盐析盐析：固定：固定pH, 温度，改变盐浓度）温度，改变盐浓度）n 在在一一定定的的离离子子强强度度下下，改改变变溶溶液液的的pH值值及及温温度度，达达到到 沉淀的目的，称为沉淀的目的，称为“”分级盐析法。分级盐析法。 （盐析盐析：固定离子强度，改变：固定离子强度，改变pH及温度。）及温度。）盐析剂的选择1 1）盐析剂的条件）盐析剂的条件l 盐析作用强；盐析作用强；l 盐析能力盐析能力阴离子阳离子；高价阴离子低价阴离子阴离子阳离子；高价阴离子低价阴离子l 较大溶解度；较大溶解度；l 较好生物相容性；较好生物相容性；l 来源丰富、经济；来源丰富、经济；2 2）常用盐析剂）常用盐析剂硫酸铵、硫酸钠硫酸铵、硫酸钠5 盐析过程的影响因素p 蛋白质种类和浓度蛋白质种类和浓度p 盐析剂的量盐析剂的量p pH pH值值p 温度温度7 盐析沉淀法的特点 沉淀条件温和，不会引起生物物质变性失活；沉淀条件温和，不会引起生物物质变性失活； 非蛋白的杂质夹带沉淀很少；非蛋白的杂质夹带沉淀很少； 适用范围广；适用范围广； 盐份含量高。盐份含量高。v 阴离子盐析效果阴离子盐析效果 柠檬酸柠檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-SCN-v 阳离子盐析效果阳离子盐析效果 NH4+ K+Na+ 高价阳离子高价阳离子v 硫酸铵硫酸铵 优点：溶解度大（优点：溶解度大（769g/L,769g/L,25) 缺点缺点 缓冲能力差缓冲能力差 对温度不敏感（对温度不敏感（679g/L,0 ） 需要脱盐需要脱盐 分级效果好分级效果好 稳定蛋白质结构的作用稳定蛋白质结构的作用 性格低廉性格低廉阴阳离子盐析效果 稳定稳定pH pH 用磷酸缓冲液用磷酸缓冲液 硫酸铵加入后体积变大硫酸铵加入后体积变大 选择饱和度选择饱和度 分步盐析分步盐析 初始蛋白浓度初始蛋白浓度盐析注意事项：盐析操作盐析溶液u硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂u硫酸铵的溶解度在硫酸铵的溶解度在030范围内变化很小范围内变化很小u20时的饱和浓度约为时的饱和浓度约为4.05mol/dm3（543g/dm3 ），饱和溶），饱和溶液密度为液密度为1.235kg/dm3 。u用用1.0dm3水制备硫酸铵的饱和溶液，需加入水制备硫酸铵的饱和溶液，需加入761g硫酸铵，硫酸铵，饱和溶液体积为饱和溶液体积为1.425dm3 。淮南王 刘安一人得道，鸡犬升天 盐析法影响因素影响因素A、无机盐种类感胶离子序(Hofmeister序列): In 1888，Hofmeister对一系列盐沉淀蛋白质的能力进行了测定研究。阴离子排序为：柠檬酸根3- 酒石酸根3- F- IO-3 H2PO-4 SO-4 CH3COO- Cl- ClO-3 Br- NO-3 ClO-4 I- CNS-; 对阳离子排序为： Th4+ Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+ NH4+ K+ Na+ Li+ 盐析法结论：结论：a不同种类的盐主要影响Ks；b 离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好。无机盐的挑选原则：无机盐的挑选原则： a 较高的盐析效能；b高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液；c溶解度受温度的影响小；d盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离；e不易引起蛋白质的变性；f价格低廉；最最常常用用(NH4)2SO4。优点：符合上述要求；缺点：水解后溶液pH降低，在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。次常用次常用Na2SO4。缺点：在400C以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。盐析法C、温度T主要考虑不能影响主要产物的活力,即在其稳定的温度下盐析,可通过实验决定,一般来说,温度越低,形成沉淀越不易,但也有相反的情况.实际上,盐析的温度范围较大,所有一般都在常温下盐析. 等电点沉淀法 等电点沉淀法中的pH值作用于值而隐含在Cohnx公式中，pI值通常在pH46范围内变化，一般用无机酸（如盐酸、磷酸和硫酸）作沉淀剂。在蛋白质疏水性比较大和结合水比较小时这种类型的沉淀更有效。为了提高等电点法的沉淀能力，常将其与盐析法、有机溶剂法或其他沉淀法一起使用。最大缺点：无机酸会引起较大的蛋白质不可逆变性的危险。 有机溶剂沉淀法 同盐析一样，随着沉淀剂有机溶机浓度的上升，蛋白质溶解度也呈指数规律下降。 式中, So为当（K/e2） 0时S的外推值；e为水-有机溶剂混合物的介电常数；K为常数(水的介电常数的吸收系数)。 有机溶剂沉淀法 有机溶剂的种类：有机溶剂的种类：丙酮(首选)、乙醇、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀pro。机理：机理：A、有机溶剂沉淀法的机理是加入溶剂后，会使水溶液的介电常数降低，而使pro分子间的静电引力（库仑力）增大，导致凝集和沉淀。B、有机溶剂使pro溶剂化，使原来与pro结合的水被溶剂所取代，从而降低了pro溶解度。这种理论不能说明为什么乙醇比丙酮的亲水性强，丙酮却比乙醇沉淀pro的能力强，也解释不了丙酮、乙醇之类溶剂在所谓脱去pro水膜的过程中容易造成pro变性，而盐析脱水时不造成pro变性。C、丙酮、乙醇等不仅是pro的沉淀淀剂，而且还是一种变性剂，可见作用有机溶剂使pro在沉淀和变性之间既有区别又相关联。 有机溶剂沉淀法 影响因素及控制影响因素及控制A、T：当乙醇与水混合时，会放出大量的稀释热，使溶液T显著升高，对不耐热的pro影响较大。解决办法：搅拌、少量多次加入，以避免温度骤然升高损失pro活力。另一方面温度还会影响有机溶剂对pro的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全，所以在乙醇沉淀人血浆蛋白时，温度控制在-10C下进行。B、乙醇：通常随乙醇上升，pro溶解度下降。如血纤维蛋白原的最大溶解度在乙醇浓度为8%时达到最大，而当乙醇浓度为40%时达到最小。C、pH值：在确定了乙醇以后，pro最低溶解度出现在蛋白.的pI处，因此可以通过调节pH值来选择性分离蛋白质。D、pro：避免使用很稀的浓度，因pro在高浓度下才较稳定。 有机溶剂沉淀法优点：优点：A、某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽，所得产品的纯度较高，B、从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂；缺点：缺点：A、耗用大量溶剂，而溶剂来源、贮存都比较困难麻烦；B、且沉淀操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性；C、收率也比盐析法低；D、试剂易燃，有毒。非离子型聚合物沉淀非离子型聚合物沉淀定义 许多水溶性非离子型聚合物，特别是许多水溶性非离子型聚合物，特别是PEGPEG可用来进可用来进行选择性沉淀以纯化蛋白质。行选择性沉淀以纯化蛋白质。原理 聚合物的作用认为与有机溶剂相似，能降低水化聚合物的作用认为与有机溶剂相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。度，使蛋白质沉淀。 使低分子量的蛋白质沉淀，需加入大量使低分子量的蛋白质沉淀，需加入大量PEGPEG：而：而使高分子量的蛋白质沉淀，加入的量较小使高分子量的蛋白质沉淀，加入的量较小。 非离子型聚合物沉淀法 某些聚合物，如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等，具有沉淀蛋白质的作用。其中最常用的是PEG，相对分子质量从200D到20KD的不同聚合程度的产品都是有效的，通常在蛋白质沉淀中使用PEG-6000或PEG-4000。计算公式：计算公式：式中，S-溶解度；c-PEG浓度；-常数，受溶液条件的影响(如pH值和离子强度)；K-常数，由pro大小和PEG的类型决定。 适适应应条条件件：上式适用性广，但在低浓度蛋白质，如1.5g/L和高浓度蛋白质，如75g/L和150g/L时，实验结果会偏离线性。这时方程需校正PEGPEG是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用。对大多数蛋白质有保护作用。PEGPEG沉淀法能在室温下进沉淀法能在室温下进行，得到的沉淀颗粒较大，收集容易。行，得到的沉淀颗粒较大，收集容易。PEGPEG的分子量需大于的分子量需大于40004000，最常用的是，最常用的是60006000和和20 00020 000。所用的所用的PEGPEG浓度通常为浓度通常为2020，浓度再高，会使粘度增大，浓度再高，会使粘度增大，造成沉淀的回收比较困难。造成沉淀的回收比较困难。PEGPEG对后续分离步骤，影响对后续分离步骤，影响较少，因此可以不必除去。但它的存在会干扰较少，因此可以不必除去。但它的存在会干扰A A280280和和LowryLowry法测定蛋白质。法测定蛋白质。非离子型聚合物沉淀法优点：优点：A、体系的温度只需控制在室温条件下；B、沉淀的颗粒往往比较大，产物比较容易收集；C、PEG非但不会使pro变性,而且可以提高它的稳定性；D、PEG无毒，优先使用在临床产品的加工过程中被。缺点：缺点：A、PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去为此需用超滤和液-液萃取来解决；B、价格较昂贵。热沉淀热沉淀定义 在较高温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变在较高温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变性沉淀，利用这一现象，可根据蛋白质间的热稳定性沉淀，利用这一现象，可根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，分离纯化热稳定性性的差别进行蛋白质的热沉淀，分离纯化热稳定性高的目标产物。高的目标产物。适用对象：热稳定性高的蛋白质热稳定性高的蛋白质 沉淀动力学 溶解度是一个平衡特性，但是溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚集作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：A、热运动（Brownian运动）；B、对流运动，由机械搅拌产生；C、差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。第A、B两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用，第种机理在沉降过程中起主导作用(如在废水处理中)。异向聚集：由Brownian运动所造成的碰撞导致。同向聚集：而由对流运动所造成的碰撞导致。 沉淀动力学 沉淀过程步骤：沉淀过程步骤：A、初始混合，蛋白质溶液与沉淀剂在强烈搅拌下混合；B、晶核生成，新相形成，产生极小的初始固体微粒；C、扩散限制生长，晶核在Brownian扩散作用下生长，生成亚微米大小的核，这一步速度很快；D、流动引起的生长，这些核通过对流传递（搅拌）引起的碰撞进一步生长，产生絮体或较大的聚集体，这一步是在较低的速度下进行的。E、絮体的破碎，破碎取决于它们的大小、密度和机械阻力。F、聚集体的陈化，在陈化过程中，絮体聚得大小和阻力平衡。 Applications早在50年前，Edwin Cohnx及其合作者就是用乙醇来完成蛋白质沉淀经典实验的。他们应用低温乙醇分级沉淀人血浆的办法制备了白蛋白溶液，并通过冷冻干燥将乙醇从成品中去除，所得产品成功地救治了1941年珍珠港空袭后的幸存者。除此以外，免疫球蛋白、血纤维蛋白原等其他许多蛋白质都是利用上述方法进行沉淀的。水的净化如何对一杯混浊的天然水进行处理？方法一、方法一、将烧杯中的水静置一段时间，使水中的一些 不溶性固体杂质沉降下来，然后再采 用某种 方法将固体与水分开。方法二、方法二、向水中加入某些净水剂如明矾，利用明矾溶 于水后生成的胶状物对杂质进行吸附，使杂 质沉降来达到净水的目的，再采用某种方法 使沉淀物与水分离。 方法三、方法三、通过加热使水沸腾成水蒸气，然后使水蒸气 冷凝成蒸馏水，从而除去水中的杂质。自来水厂净水过程示意图酪蛋白的制备酪蛋白的制备牛奶中提取酪蛋白牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白