蛋白质的理化性质及分离纯化蛋白质的理化性质及分离纯化第一节第一节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质第二节第二节 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化第三节第三节 蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量测定第四节第四节 蛋白质的含量测定与纯度鉴定蛋白质的含量测定与纯度鉴定第一节第一节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的紫外吸收性质二、蛋白质的紫外吸收性质二、蛋白质的紫外吸收性质二、蛋白质的紫外吸收性质四、蛋白质的变性和复性四、蛋白质的变性和复性四、蛋白质的变性和复性四、蛋白质的变性和复性五、蛋白质的呈色反应五、蛋白质的呈色反应五、蛋白质的呈色反应五、蛋白质的呈色反应三、蛋白质的胶体性质和沉淀三、蛋白质的胶体性质和沉淀三、蛋白质的胶体性质和沉淀三、蛋白质的胶体性质和沉淀一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质在某在某pHpH时蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即蛋时蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即蛋白质的净电荷为零时的白质的净电荷为零时的pHpH称称等电点（等电点（pI）。）。没有其他盐类干扰时没有其他盐类干扰时, , 蛋白质质子供体基团解离出来蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pHpH称为称为等等离子点。离子点。u蛋白质等电点：蛋白质等电点：u蛋白质等离子点：蛋白质等离子点：二、蛋白质的紫外吸收性质二、蛋白质的紫外吸收性质u蛋蛋白白质质溶溶液液能能吸吸收收一一定定波波长长的的紫紫外外光光，主主要要是是由由带带芳芳香香环环的的氨氨基基酸酸决决定定的的。其其在在280nm280nm处处对对紫紫外外吸吸收收能能力力的强弱顺序为：的强弱顺序为：色（色（ Trp ） 酪（酪（ Tyr ） 苯丙（苯丙（ Phe ）三、蛋白质的胶体性质和沉淀三、蛋白质的胶体性质和沉淀u 蛋蛋白白质质的的分分子子大大小小属属于于胶胶体体质质点点的的范范围围。蛋蛋白白质质溶溶液液是一种稳定的亲水胶体是一种稳定的亲水胶体（具有水化层和双电子层）（具有水化层和双电子层）。u 蛋蛋白白质质溶溶液液具具有有胶胶体体的的一一般般性性质质：布布朗朗运运动动、丁丁达达尔尔效应以及效应以及不能通过半透膜。不能通过半透膜。u 半透膜：半透膜：多是由用赛咯吩多是由用赛咯吩（cellophane）制造，赛咯吩膜是制造，赛咯吩膜是半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，但小分子可以透过。半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，但小分子可以透过。（一）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的沉淀 蛋白质在溶液中的蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。稳定性是有条件的、相对的。如果条件发生改如果条件发生改变变, ,破坏了蛋白质的稳定性破坏了蛋白质的稳定性, ,蛋白质就会从溶液中沉淀出来蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关, ,那么任那么任何影响这些条件的因素都会影响蛋白质的稳定性。何影响这些条件的因素都会影响蛋白质的稳定性。 u沉淀蛋白质的方法有以下几种沉淀蛋白质的方法有以下几种: :中性盐沉淀法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物中性盐沉淀法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物碱试剂和某些酸类沉淀法、加热变性沉淀法碱试剂和某些酸类沉淀法、加热变性沉淀法. .u盐盐析析：向向蛋蛋白白质质溶溶液液中中加加入入大大量量的的中中性性盐盐( (如如：硫硫酸酸铵铵, ,硫硫酸酸钠钠或或氯氯化化钠钠等等),),使使蛋蛋白白质质表表面面的的电电荷荷被被中中和和，蛋蛋白白质质分分子子脱脱去去水水化化层而聚集沉淀。层而聚集沉淀。1.1.中性盐沉淀法（盐析法）中性盐沉淀法（盐析法）u注意：注意：盐析一般不引起蛋白质变性。当除去盐后盐析一般不引起蛋白质变性。当除去盐后, ,蛋白质又可溶解。蛋白质又可溶解。 2.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法u 向蛋白质溶液中加入一定量的向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂极性有机溶剂( (如甲醇如甲醇, ,乙醇或丙酮等乙醇或丙酮等) ) 引起蛋白质引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常脱去水化层以及降低介电常数数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。凝聚而沉淀。3.重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法u当当溶溶液液pH大大于于等等电电点点（pI）时时, ,蛋蛋白白质质颗颗粒粒带带负负电电荷荷，这这样样它它就就容容易易与与重重金金属属离离子子( (Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等等) )结结合合成不溶性盐而沉淀。成不溶性盐而沉淀。u应应用用 ：误误服服重重金金属属盐盐的的病病人人可可口口服服大大量量牛牛乳乳或或豆豆浆浆等蛋白质进行解救等蛋白质进行解救, ,然后再服用催吐剂排出体外。然后再服用催吐剂排出体外。4.生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法u生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂：生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂：如如：鞣鞣酸酸（单单宁宁酸酸, ,tannic acid) ) 钨钨酸酸( (tungstic acid，H2WO4) )、苦苦味味酸酸(picric acid) )即即2,4,6- -三硝基酚三硝基酚, , 碘化钾等。碘化钾等。u某些酸类某些酸类:三氯醋酸三氯醋酸, , 磺基水杨酸磺基水杨酸（sulfosalicylic acid）和硝酸等和硝酸等. .当当 pH pI，蛋白质带正电荷与蛋白质带正电荷与生物碱试剂生物碱试剂某些酸根负离子某些酸根负离子不溶性沉淀不溶性沉淀反应5.5.加热变性沉淀法加热变性沉淀法u几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。u当蛋白质处于等电点时当蛋白质处于等电点时, ,加热凝固最完全和最迅速。加热凝固最完全和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固的原因：加热变性引起蛋白质凝固的原因：可可能能是是由由于于热热变变性性使使蛋蛋白白质质天天然然结结构构解解体体，疏疏水水基基外外露露，因因而而破破坏坏了了水水化化层层，同同时时由由于于蛋蛋白白质质处处于于等等电电点点也也破破坏了带电状态。坏了带电状态。四、蛋白质的变性和复性四、蛋白质的变性和复性u蛋白质变性的定义：蛋白质变性的定义： 环境的变化或是化学处理都会引起蛋白质天然构象的破坏，环境的变化或是化学处理都会引起蛋白质天然构象的破坏，并伴随着生物活性的丧失、溶解度的降低以及其它理化常数的并伴随着生物活性的丧失、溶解度的降低以及其它理化常数的改变，这一过程称为蛋白质变性。改变，这一过程称为蛋白质变性。u蛋白质的复性：蛋白质的复性：蛋白质的复性当变性因素除去后，变性蛋白质又重新回复蛋白质的复性当变性因素除去后，变性蛋白质又重新回复到天然构象的现象成为蛋白质的复性。到天然构象的现象成为蛋白质的复性。u蛋白质变性后的特性：蛋白质变性后的特性： 生物活性丧失、侧链基团暴露、理化性质改变、生化性质改变生物活性丧失、侧链基团暴露、理化性质改变、生化性质改变五、蛋白质的呈色反应五、蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应反应名称反应名称试试 剂剂颜色颜色反应有关基团反应有关基团双缩脲反应双缩脲反应NaOH、CuSO2紫紫色色或或粉粉红色红色二个以上肽键二个以上肽键酚试剂反应酚试剂反应碱碱性性CuSO4及及磷钨酸磷钨酸-钼酸钼酸蓝色蓝色酚基、吲哚基酚基、吲哚基茚三酮反应茚三酮反应茚三酮茚三酮蓝色蓝色自由氨基及羧基自由氨基及羧基第二节第二节 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化 一、蛋白质分离纯化的一般步骤1.1.蛋白质样品的前处理蛋白质样品的前处理 2.2.蛋白质粗提液的粗分级分离蛋白质粗提液的粗分级分离3.3.浓缩蛋白质的细分级分离浓缩蛋白质的细分级分离4. 4. 蛋白质的结晶蛋白质的结晶二、蛋白质的分离纯化方法u主要是根据蛋白质主要是根据蛋白质在在溶液中的性质不同溶液中的性质不同对蛋白质进行分离。对蛋白质进行分离。分子大小分子大小溶解度溶解度电荷电荷吸附性质吸附性质对配体分子的生物学亲和力对配体分子的生物学亲和力（一）（一）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法根据蛋白质分子大小不同的纯化方法u主要方法：主要方法：1 1：透析透析（dialysis）和超过滤和超过滤（ultrafiltration）2：密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心3：凝胶过滤法凝胶过滤法1 1：透析和超过滤：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质）利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质）透析流程透析流程透析装置透析装置超过滤装置超过滤装置u 使用使用压力或者离心力压力或者离心力使蛋白质溶液使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜（半透透过有一定截留分子量的超滤膜（半透膜），达到浓缩蛋白质溶液的目的。膜），达到浓缩蛋白质溶液的目的。装好具备密度装好具备密度梯度的介质溶液梯度的介质溶液离心离心收集分离后的各组分收集分离后的各组分加入：混和加入：混和蛋白质样品蛋白质样品离心装置离心装置2：密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心3：凝胶过滤法凝胶过滤法u 凝胶过滤是按照凝胶过滤是按照蛋白质分子大小蛋白质分子大小进行分离的技术，又进行分离的技术，又称凝胶层析、分子筛层析或排阻层析。称凝胶层析、分子筛层析或排阻层析。u 凝胶过滤法是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效凝胶过滤法是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。的方法之一。（1）凝胶过滤的介质）凝胶过滤的介质u 凝凝胶胶过过滤滤所所用用的的介介质质是是装装在在凝凝胶胶柱柱里里的的凝胶珠凝胶珠（或称凝胶颗粒、凝胶球）。（或称凝胶颗粒、凝胶球）。u其其内内部部是是多多孔孔的的网网状状结结构构，单单个个凝凝胶胶珠珠本本身身象象个个“筛筛子子”。不不同同类类型型凝凝胶胶的的筛筛孔孔的的大小不同大小不同 。凝胶柱凝胶柱凝胶过滤分离蛋白质的流程凝胶过滤分离蛋白质的流程开始洗脱后，大分子由于受到的阻力小而先被洗脱出来开始洗脱后，大分子由于受到的阻力小而先被洗脱出来洗脱收集洗脱收集上样上样样品上柱后，样品中的小样品上柱后，样品中的小分子可以进入凝胶微孔，分子可以进入凝胶微孔，但是大分子不能进入。但是大分子不能进入。u这样大小不同的蛋白这样大小不同的蛋白质就被分离开来了。质就被分离开来了。u 依次洗脱收集后，依次洗脱收集后，通过紫外吸收法测定吸通过紫外吸收法测定吸收峰。收峰。（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法（蛋白质的胶体和沉淀性质）（蛋白质的胶体和沉淀性质）u 主要方法：主要方法：1 1：等电点沉淀和等电点沉淀和PHPH值控制值控制2 2：蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析3 3：有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法4 4：改变温度改变温度1. .等电点沉淀和等电点沉淀和PH值控制值控制u即在不改变其它条件的情况下，即在不改变其它条件的情况下，PH处于等电点时的蛋白质处于等电点时的蛋白质溶解度达到最低点。溶解度达到最低点。而位于等电点两侧的而位于等电点两侧的PH条件下蛋白质的溶条件下蛋白质的溶解度迅速上升。解度迅速上升。u 由于由于不同的蛋白质等电点不同不同的蛋白质等电点不同，因此可以通过控制溶液的，因此可以通过控制溶液的PHPH值值来沉淀混合物中的某种蛋白成分。来沉淀混合物中的某种蛋白成分。u 通过这种办法沉淀出来的蛋白质可以保持天然构象，能重新溶通过这种办法沉淀出来的蛋白质可以保持天然构象，能重新溶解于一定浓度的溶液中。解于一定浓度的溶液中。2. .蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析u盐溶盐溶（salting-in） ：低浓度的中性盐可以增加蛋：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为蛋白质的盐溶现象。白质的溶解度，这种现象称为蛋白质的盐溶现象。u同浓度二价中性盐对蛋白质溶解度的影响比单价中性盐大的多。同浓度二价中性盐对蛋白质溶解度的影响比单价中性盐大的多。u盐析盐析（salting-out） ：当溶液中的离子强度达到一定的数当溶液中的离子强度达到一定的数值时（盐浓度高达一定数值时），蛋白质的溶解度开始下降，很多值时（盐浓度高达一定数值时），蛋白质的溶解度开始下降，很多蛋白质可以从水溶液中析出，这种现象称为盐析。蛋白质可以从水溶液中析出，这种现象称为盐析。3. .有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法u 与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等）与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等） 能使能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，在室温下，这些有机溶蛋白质在水中的溶解度显著降低，在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。这种沉淀的主要原因是有机溶剂的加入改变了介质的这种沉淀的主要原因是有机溶剂的加入改变了介质的介电常数。介电常数。4. .改变温度分离蛋白质改变温度分离蛋白质040oC之间之间：大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加， 例外例外：025oC，人的血红蛋白溶解度随温度上升而降低。人的血红蛋白溶解度随温度上升而降低。4050oC以上，以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性。大部分蛋白质变得不稳定并开始变性。u一般蛋白质的分级分离操作一般都在一般蛋白质的分级分离操作一般都在04oC温度下进行。温度下进行。（三）根据蛋白质电荷不同的纯化方法主要方法：主要方法：u 电泳电泳u 离子交换层析离子交换层析电泳概述电泳概述u由于由于蛋白质蛋白质在指定的在指定的PH溶液中所带电荷和分子量不同，形状不溶液中所带电荷和分子量不同，形状不同，在同，在电场中泳动速度不同电场中泳动速度不同。u因此根据这一原理就可以从蛋白质混合液中将各种蛋白质分离因此根据这一原理就可以从蛋白质混合液中将各种蛋白质分离开来，所以开来，所以电泳技术已成为分析、分离蛋白质的重要手段之一。电泳技术已成为分析、分离蛋白质的重要手段之一。1 1. .聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylaminde gel electrophoresis) PAGE电泳电泳u 它以它以聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶凝胶为支持物，一般为支持物，一般制成凝胶柱或制成凝胶柱或凝胶板凝胶板（不连续体系）。（不连续体系）。凝胶的浓度（孔径大小）、凝胶的浓度（孔径大小）、缓冲液组分和离子强度、缓冲液组分和离子强度、pHpH以及电场强度都是不同的以及电场强度都是不同的浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶样品浓缩成很薄的起始区带（样品浓缩成很薄的起始区带（0.1mm0.1mm）分离成单区带分离成单区带SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)u SDS-PAGE:SDS-PAGE:是用是用SDSSDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂（通常为巯基（十二烷基硫酸钠）和还原剂（通常为巯基乙醇）先对待分离的蛋白质样品进行预处理（加热煮沸乙醇）先对待分离的蛋白质样品进行预处理（加热煮沸3 35 5分钟）。分钟）。u 通过加热和通过加热和SDSSDS可以使蛋白质变性：可以使蛋白质变性：多亚基的蛋白质解离为单多亚基的蛋白质解离为单亚基。二硫键被切断。亚基。二硫键被切断。u SDSSDS是带有负电荷的分子，是带有负电荷的分子，所有结合所有结合SDSSDS的蛋白质的形状近似于的蛋白质的形状近似于长的椭圆棒，全部带上了大量的负电荷。长的椭圆棒，全部带上了大量的负电荷。u 电泳时电泳时SDS-SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响（全部由负极向正极移动），而主要取决于蛋白电荷和形状的影响（全部由负极向正极移动），而主要取决于蛋白质分子量。质分子量。 浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶样品样品SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置聚丙烯酰胺凝胶电泳装置点样点样浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶样品样品SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置聚丙烯酰胺凝胶电泳装置2 2. .毛细管电泳毛细管电泳 泛泛指指高高效效毛毛细细管管电电泳泳、毛毛细细管管区区带带电电泳泳、自自由由溶溶液液毛毛细细管管电电泳泳和毛细管电泳。和毛细管电泳。 用用途途：分分离离多多种种生生物物分分子子，包包括括氨氨基基酸酸、肽肽、蛋蛋白白质质、DNADNA片片段段（例例如如合合成成的的寡寡核核苷苷酸酸）和和核核酸酸以以及及多多种种小小分分子子，如如药药物物、甚至金属离子。用样量甚至金属离子。用样量5 530l 1mg/ml30l 1mg/ml溶液。溶液。3 3. .等电聚焦电泳等电聚焦电泳u等等电电聚聚焦焦或或称称电电聚聚焦焦，是是一一种种高高分分辨辨率率的的蛋蛋白白质质分分离离技技术术，它它也可用于也可用于蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定。u蛋蛋白白质质混混合合物物是是在在具具有有pH梯梯度度的的介介质质（如如浓浓蔗蔗糖糖溶溶液液）中中进进行行电电泳泳的的。在在外外电电场场作作用用下下各各种种蛋蛋白白质质将将移移向向并并聚聚焦焦（停停留留）在在等等于于其等电点的其等电点的pHpH梯度处，并形成一个很窄的区带。梯度处，并形成一个很窄的区带。u等等电电聚聚焦焦可可以以把把人人的的血血清清分分成成4040多多个个条条带带。此此技技术术特特别别适适用用于于同同功功酶酶的的鉴鉴定定。只只要要它它们们的的pI有有0.02（甚甚至至0.02）pH单单位位的的差差别别就就能分开。能分开。u 实际上是利用缓冲液在实际上是利用缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个方向制造一个pH梯度梯度。所。所用的缓冲液是低分子量的有用的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该混合机酸和碱的混合物，该混合物称之两性电解质。物称之两性电解质。等电聚焦电泳装置等电聚焦电泳装置u 当蛋白质样品在这样的当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的都将迁移至与它的pI 相一相一致的致的pH处，处，具有不同具有不同pI的的各种蛋白质最后都迁移至凝各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的胶中相应的pH处，处，达到分达到分离的目的。离的目的。4 4. .蛋白质的双向电泳蛋白质的双向电泳（two-dimensional electrophoresis）u 将将等电聚焦电泳等电聚焦电泳与与SDS-PAGESDS-PAGE结合起来的电泳技术。结合起来的电泳技术。电电泳泳方方向向电电泳泳方方向向等电聚焦电泳等电聚焦电泳SDS-PAGEu 双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映水平方向反映出蛋白在出蛋白在pIpI上的差异上的差异，而，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别垂直方向反映出它们在分子量上的差别。u 所以所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。电点相同而分子量不同的蛋白质分开。u是根据蛋白质的是根据蛋白质的等电点差异分离等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。蛋白质混合物的柱层析方法。特特种种多多缓缓冲冲交交换换剂剂PH降低降低混和蛋白质样品混和蛋白质样品特种多缓冲液特种多缓冲液特种多特种多缓冲液缓冲液收集收集特种多特种多缓冲液缓冲液收集收集特种多特种多缓冲液缓冲液依依次次收收集集不不同同的的蛋蛋白白组组分分5 5. .层析聚焦层析聚焦(P(P310310) )u 填充到层析柱中的树脂有阳离子交换型和阴离子交换型。填充到层析柱中的树脂有阳离子交换型和阴离子交换型。支持介质：支持介质： 对蛋白质交换容量大对蛋白质交换容量大阳离子交换剂阳离子交换剂阴离子交换剂阴离子交换剂CM纤维素纤维素(弱酸型弱酸型)P-纤维素纤维素(中强酸型中强酸型)SE- 纤维素纤维素(强酸型强酸型)SP-Sephadex(强酸型强酸型)AM纤维素纤维素(弱碱型弱碱型)PAB-纤维素纤维素(弱碱型弱碱型)DEAE-纤维素纤维素(中强碱型中强碱型)DEAE-Sephadex(中强碱型中强碱型)TEAE-纤维素纤维素(强碱型强碱型)QAE-Sephadex(强碱型强碱型)6 6. .离子交换层析离子交换层析(P310)以阳离子交换型树脂为例以阳离子交换型树脂为例u将带有耐酸性非常强的磺酸根将带有耐酸性非常强的磺酸根SOSO3 3-Na-Na（以盐的形式出现）（以盐的形式出现）的的强阳离子交换树脂（强阳离子交换树脂（固定相固定相）填充到层析柱）填充到层析柱中。中。u将含有样品的将含有样品的流动相流动相加入层析柱中，加入层析柱中，样品中带有正电荷样品中带有正电荷的蛋白质的蛋白质X X，通过静电吸引，与树脂中的带电基团相互作用，通过静电吸引，与树脂中的带电基团相互作用，结果结果X X与与NaNa交换（阳离子交换），交换（阳离子交换），形成形成SOSO3 3-X-X，蛋白质就结合，蛋白质就结合到了层析柱上到了层析柱上。u在样品与树脂充分交换后，可通过在样品与树脂充分交换后，可通过提高流动相中的盐浓提高流动相中的盐浓度，或改变流动相的度，或改变流动相的pHpH，或是同时采用这两种方法，或是同时采用这两种方法，就可以，就可以将结合于树脂上的蛋白质将结合于树脂上的蛋白质X X成分，按照它们与树脂结合的强弱成分，按照它们与树脂结合的强弱程度不同逐一地程度不同逐一地洗脱洗脱下来。下来。结合到层析柱上的蛋白质的洗脱有不同的洗脱方式：结合到层析柱上的蛋白质的洗脱有不同的洗脱方式： 洗脱方式洗脱方式恒定浓度洗脱恒定浓度洗脱改变盐浓度或改变盐浓度或pH洗脱洗脱跳跃式分段洗脱跳跃式分段洗脱渐进式连续改变渐进式连续改变(梯度洗脱梯度洗脱)简单型混合器简单型混合器复合型混合器复合型混合器u 利利用用待待纯纯化化的的分分子子和和杂杂质质分分子子与与吸吸附附剂剂之之间间的的吸吸附附能能力和解吸性质不同而达到分离目的。力和解吸性质不同而达到分离目的。u 典型的吸附剂：典型的吸附剂：硅胶硅胶, ,氧化铝和活性炭等氧化铝和活性炭等. . 主要用来分离非离子、水不溶性化合物主要用来分离非离子、水不溶性化合物（四）利用选择性吸附的纯化方法(P312) 亲和层析亲和层析(affinity chromatography)：是利用蛋白质是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力分子对其配体分子特有的识别能力, , 即生物学亲和力，建立起来的即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。一种有效的纯化方法。 经常只需一步处理即可将某种所需蛋白质从复杂混合经常只需一步处理即可将某种所需蛋白质从复杂混合物中分离出来，纯度相当高。物中分离出来，纯度相当高。( (五五) )利用与配体的特异生物学亲和力的纯化方法利用与配体的特异生物学亲和力的纯化方法(P313)亲和层析u把某一待纯化把某一待纯化蛋白质的特异配体蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价通过适当的化学反应共价地地连接到连接到像琼脂糖凝胶这一类的像琼脂糖凝胶这一类的载体表面载体表面。u向含有载体的层析柱中加入样品，样品中待纯化的向含有载体的层析柱中加入样品，样品中待纯化的蛋白质蛋白质由于与载体上的配体结合而被吸附由于与载体上的配体结合而被吸附，而其它蛋白质和杂质成分通，而其它蛋白质和杂质成分通过平衡液的洗涤可以被除去。过平衡液的洗涤可以被除去。u被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液（高浓度被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液（高浓度洗脱液）洗脱洗脱液）洗脱( (亲合洗脱亲合洗脱) )并进行收集。并进行收集。样品样品层析柱层析柱凝胶上的配体凝胶上的配体样品中待分离的的蛋白成分样品中待分离的的蛋白成分u 蛋白与凝胶上的配体特异结合在凝胶球上，其余未结合的蛋白与凝胶上的配体特异结合在凝胶球上，其余未结合的样品成分被平衡液洗脱下来。样品成分被平衡液洗脱下来。样品样品凝胶上的配体凝胶上的配体样品中能与配体特异结合的蛋白成分样品中能与配体特异结合的蛋白成分高浓度的蛋白配体或者是类似物高浓度的蛋白配体或者是类似物高浓度的蛋白配体或者是类似物高浓度的蛋白配体或者是类似物蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法分子大小：分子大小：溶解度：溶解度：电荷：电荷：吸附性质：吸附性质：对配体分子的对配体分子的亲和力：亲和力：透析和超过滤透析和超过滤、密度梯度（区带）离心、凝胶过滤法密度梯度（区带）离心、凝胶过滤法等电点和等电点和PHPH值控制、盐溶盐析、有机溶剂分级分离、变温度值控制、盐溶盐析、有机溶剂分级分离、变温度电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析亲和层析亲和层析第三节第三节 蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定(P(P291-299) )一、一、根据化学组成测定最低相对分子质量根据化学组成测定最低相对分子质量u 用用化化学学分分析析方方法法测测定定出出蛋蛋白白质质中中某某一一微微量量元元素素的的含含量量, ,可以计算出可以计算出蛋白质的最低相对分子质量蛋白质的最低相对分子质量。u如如Fe，并并假假设设每每个个蛋蛋白白质质分分子子中中只只有有1个个Fe原原子子，则则由此可算出蛋白质的由此可算出蛋白质的最低相对分子质量。最低相对分子质量。例例如如: :某某种种蛋蛋白白含含铁铁量量为为0.335%, 0.335%, 其其最最低低相相对对分分子子质质量量( (假假设设此此蛋白只含有一个铁原子如肌红蛋白蛋白只含有一个铁原子如肌红蛋白) )可按下式计算出可按下式计算出: : 若此蛋白含若此蛋白含4 4个铁原子（如血红蛋白）个铁原子（如血红蛋白） ，则：，则：Mr = 16 700486 600最低相对分子质量最低相对分子质量Mr铁的原子质量铁的原子质量铁的百分含量铁的百分含量=55.80.335 100 =100 = 16 700即某蛋白的真实即某蛋白的真实 Mr = 16 700n （n n为含有的铁原子的数目）为含有的铁原子的数目）渗渗透透现现象象：溶溶剂剂分分子子由由纯纯溶溶剂剂（或或稀稀溶溶液液）向向溶溶液液（或或浓浓溶溶液液）单方向的净移动现象。单方向的净移动现象。二、二、根据渗透压法测定相对分子质量根据渗透压法测定相对分子质量半透膜半透膜溶剂溶剂蛋白质溶液蛋白质溶液渗透压渗透压h渗透压测定的装置渗透压测定的装置小分子可以通过，但蛋白小分子可以通过，但蛋白质等大分子不能通过。质等大分子不能通过。Mr = RTlim ( /c)c 0R: 气体常数；气体常数； T：绝对温度；绝对温度； ：渗透压；：渗透压； c: 溶质的浓度。溶质的浓度。注注意意事事项项：尽尽量量采采用用等等电电点点或或者者接接近近等等电电点点的的缓缓冲冲溶溶液液做做为为半半透透膜内外的溶剂，以避免膜内外的溶剂，以避免PHPH值对渗透压的影响。值对渗透压的影响。渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点：渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点：优点：优点：装置简单，准确度相对高。装置简单，准确度相对高。缺缺点点：不不能能区区别别所所测测蛋蛋白白质质溶溶液液中中的的蛋蛋白白质质样样品品是是否否均均一一。如如果果溶溶液液含含多多种种蛋白质成分，那么测出的是几种蛋白质的平均分子量。蛋白质成分，那么测出的是几种蛋白质的平均分子量。（三）蛋白质的扩散和扩散系数（三）蛋白质的扩散和扩散系数u扩散（平移扩散）：扩散（平移扩散）：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。u扩散系数扩散系数D D：在数值上等于当浓度梯度为一个单位时，在一秒在数值上等于当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过钟内通过1cm2面积所扩散的溶质量。面积所扩散的溶质量。u扩散系数扩散系数D D的特点：的特点：(2)(2)扩散系数一般不单独用来决定扩散系数一般不单独用来决定M Mr r , ,但如后面所说的与沉降系但如后面所说的与沉降系数结合起来数结合起来, ,可以给出蛋白质的精确相对分子质量。可以给出蛋白质的精确相对分子质量。(1)(1)随随 M Mr r的增加而降低的增加而降低, ,但扩散系数对但扩散系数对M Mr r 的变化并不敏感。的变化并不敏感。 （四）沉降分析法（四）沉降分析法测定相对分子质量测定相对分子质量需需转速为转速为60,00080,000rpm的超速离心机的超速离心机 测测Mr常用两种方法常用两种方法：沉降速度法沉降速度法沉降平衡法沉降平衡法u沉降：沉降：蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会发生沉降，沉降的蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会发生沉降，沉降的速度与蛋白质的分子大小、形状、密度以及溶液的性质有关。速度与蛋白质的分子大小、形状、密度以及溶液的性质有关。1. 沉降速度法沉降速度法测定相对分子质量测定相对分子质量u 沉降系数沉降系数( (s):):单位离心场的沉降速度。单位离心场的沉降速度。液面液面界面界面溶剂溶剂坪区坪区池底池底 界界面面移移动动的的速速度度即即沉沉降降速速度度，溶溶质质的的相相对对分分子子量量越越大大，则则界界面面移移动动越越快快，若若溶溶液液中中有有几几种种溶溶质质，则则离离心心之之后后就就会会出出现现几几个个界界面面。界面移动的速度可以借助适当的光学系统来观察。界面移动的速度可以借助适当的光学系统来观察。如如人血红蛋白沉降系数人血红蛋白沉降系数s=4.46Ss=4.46S，即即4.464.4610101313秒。秒。 为为了了比比较较起起见见，在在不不同同温温度度和和溶溶剂剂中中测测得得的的沉沉降降系系数数需需要要换换算算成成标标准准条条件件下下的的s s值值。沉沉降降系系数数的的标标准准条条件件定定为为2020 C,C,溶溶剂剂为为水水。校校正后的沉降系数用正后的沉降系数用s s2020，w w表示。表示。大大部部分分生生物物大大分分子子的的沉沉降降系系数数介介于于1 11010-13-13到到2002001010- -1313秒秒的的范范围围。因因此此：把把1010-13-13秒秒作作为为一一个个单单位位，称称为为斯斯维维得得贝格单位或称贝格单位或称沉降系数单位沉降系数单位，用，用S(S(大写大写) )来表示。来表示。 即：即：1S1S1010-13-13秒秒Mr =RTsD（1V）R : 气体常数气体常数（8.314107ergsmol -1 度度-1）T : 绝对温度绝对温度D : 扩散常数扩散常数（可用试验求得）（可用试验求得）V : 蛋白质的偏微比容蛋白质的偏微比容（m3g-1）: 溶剂密度溶剂密度（20，gml-1） s : 沉降系数（可以根据沉降速度和离心力求得）沉降系数（可以根据沉降速度和离心力求得）蛋白质分子量与沉降系数的关系蛋白质分子量与沉降系数的关系2. 沉降平衡法沉降平衡法测定相对分子质量测定相对分子质量u利用较低转速利用较低转速（800020000 r/min）进行。由于分子颗进行。由于分子颗粒沉降造成浓度梯度，因而产生了扩散作用。粒沉降造成浓度梯度，因而产生了扩散作用。x2x1离心力离心力离心池离心池轴心轴心液面液面扩散力扩散力蛋白质的沉降平衡蛋白质的沉降平衡2RTdln(c2/c1) (1-) 2(x22-x12)Mr=R : 气体常数气体常数（8.314107ergsmol -1 度度-1）T : 绝对温度绝对温度V : 蛋白质的偏微比容蛋白质的偏微比容（m3g-1）: 溶剂密度溶剂密度（20，gml-1）w: 转子的角速度。转子的角速度。c1、c2:距离旋转中心距离旋转中心x1和和x2处的蛋白质浓度。处的蛋白质浓度。x2x1离心力离心力轴心轴心液面液面扩散力扩散力u利用凝胶过滤可以把蛋白质混合物按利用凝胶过滤可以把蛋白质混合物按分子的大小分子的大小分离开来分离开来（五）凝胶过滤法（五）凝胶过滤法测定相对分子质量测定相对分子质量洗脱过程洗脱过程凝胶球凝胶球u如果某种蛋白质与一如果某种蛋白质与一理想的非水化球体理想的非水化球体具有相同的过柱速度即具有相同的过柱速度即相同的洗脱体积相同的洗脱体积（elution volume）,则认为这种蛋白质具有与此球则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径体相同的半径, ,称蛋白质分子的称蛋白质分子的斯托克半径斯托克半径。 u因此因此, ,标准蛋白质标准蛋白质( (已知已知MrMr和斯托克半径和斯托克半径) )和待测蛋白质必须具有和待测蛋白质必须具有相同的相同的分子形状分子形状( (接近球体接近球体),),否则不能得到比较准确的否则不能得到比较准确的MrMr。注意：注意：分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质的蛋白质, ,则不能用此方法测定则不能用此方法测定MrMr。Gel filtration column1966年年Andrews提出了一个经验公式提出了一个经验公式 VeVo= a - blgMr其中：其中：Ve为洗脱体积；为洗脱体积；Vo为外水体积为外水体积 Mr为相对分子质量；为相对分子质量；a和和b为常数为常数方法简便，仪器简单。方法简便，仪器简单。不纯样品亦可，只要找出活性不纯样品亦可，只要找出活性峰位置（峰位置（VeVe）即可。即可。lgMrVea 1 Veb b Vo lgMr=_做直线图做直线图(六六) SDS PAGE法测定相对分子质量法测定相对分子质量 u SDSSDS处理蛋白质之后，所有的处理蛋白质之后，所有的SDS-SDS-蛋白质复合物都带有了大量的蛋白质复合物都带有了大量的负电荷，而且分子都呈现统一的长椭圆形。负电荷，而且分子都呈现统一的长椭圆形。uSDS-PAGESDS-PAGE电泳时电泳时SDS-SDS-蛋白质复合物在凝胶中的蛋白质复合物在凝胶中的迁移率迁移率不再受蛋不再受蛋白质原有电荷和形状的影响（全部由负极向正极移动），而白质原有电荷和形状的影响（全部由负极向正极移动），而主要取主要取决于蛋白质分子量决于蛋白质分子量。 在聚丙烯酰胺凝胶中由于引入凝胶分子筛效应在聚丙烯酰胺凝胶中由于引入凝胶分子筛效应, ,电泳迁电泳迁移率与蛋白质分子量的对数有下列关系：移率与蛋白质分子量的对数有下列关系： Mr为相对分子质量为相对分子质量K1,K2都是常数都是常数 R是相对迁移率是相对迁移率样品迁移距离样品迁移距离前沿（染料）迁移距离前沿（染料）迁移距离 R=lgMr = K1- K2 R前沿迁移距离前沿迁移距离样品迁移距离样品迁移距离lgMr = K1- K2 R第四节第四节 蛋白质含量的测定与纯度鉴定蛋白质含量的测定与纯度鉴定一、一、 蛋白质含量测定蛋白质含量测定1.1.凯氏定氮法：凯氏定氮法：是经典的标准方法是经典的标准方法, ,但现在在生物学上但现在在生物学上已不多用。已不多用。2.2.双缩脲法：双缩脲法：纯化步骤检测纯化步骤检测。3.Folin-酚试剂法酚试剂法( (Lowry法法) ) ：蛋白质标准测定方法。蛋白质标准测定方法。4.4.紫外吸收法：紫外吸收法：虽然精确度不高虽然精确度不高, ,但操作简便。但操作简便。5.Bradford法法( (考马斯亮蓝结合法考马斯亮蓝结合法) )：灵敏度高灵敏度高, ,能检测能检测gg级的蛋白级的蛋白。二、二、 蛋白质纯度鉴定蛋白质纯度鉴定1.电泳分析法：电泳分析法：纯的蛋白质电泳只呈现单一区带。纯的蛋白质电泳只呈现单一区带。2.沉降分析法：沉降分析法：纯的蛋白质在离心场中以单一的沉降速度移动。纯的蛋白质在离心场中以单一的沉降速度移动。3.HPLC鉴定：鉴定：纯的纯的多肽、蛋白质呈现出单一的对称峰。多肽、蛋白质呈现出单一的对称峰。4.溶解度分析：溶解度分析：纯的蛋白质制品，溶解度曲线呈现一个折点。纯的蛋白质制品，溶解度曲线呈现一个折点。5.N-末端分析：末端分析：N N末端残基只可能有一种氨基酸。末端残基只可能有一种氨基酸。 蛋白质等电点蛋白质等电点 等离子点等离子点 盐析盐析 盐溶盐溶 蛋白质的变性蛋白质的变性 复性复性 茚三酮反应茚三酮反应 双缩脲反应双缩脲反应 层析层析 离子交换层析离子交换层析 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 亲和层析亲和层析 透析透析 电泳电泳 SDS-PAGE SDS-PAGE 等电聚焦等电聚焦 双向电泳双向电泳 渗透现象渗透现象 扩散扩散 扩散系数扩散系数 蛋白质的沉降蛋白质的沉降 沉降系数沉降系数 蛋白质的斯托克半径蛋白质的斯托克半径名词解释名词解释知识点知识点u 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 u 蛋白质的沉淀方法蛋白质的沉淀方法u 蛋白质变性后的主要特征蛋白质变性后的主要特征u 蛋白质分离纯化的一般步骤蛋白质分离纯化的一般步骤u 蛋白质分离纯化的标准和主要方法蛋白质分离纯化的标准和主要方法u 蛋白质分子量测定的主要方法蛋白质分子量测定的主要方法u 蛋白质含量测定与纯度测定的主要方法蛋白质含量测定与纯度测定的主要方法