第五章第五章 基因基因扩增增PCR技术简史 PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖基因扩增基因扩增-PCR-PCRDNADNA聚合酶聚合酶引物引物引物引物引物引物引物引物M13M13噬菌体噬菌体Sanger的测序技术引物引物DNADNA聚合酶聚合酶基因扩增基因扩增-PCR-PCR引物引物引物引物Mullis的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNADNADNA片段片段片段片段基因扩增基因扩增-PCR-PCR基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA获取特定获取特定获取特定获取特定DNADNADNADNA片段片段片段片段扩扩扩扩增增增增特特特特定定定定D D D DN N N NA A A A片片片片段段段段基因扩增基因扩增-PCR-PCRKary B. Mullis 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。基因扩增基因扩增-PCR-PCR生物样品生物样品生物样品生物样品DNADNA片段片段基基基基因因因因诊诊诊诊断断断断基基基基因因因因治治治治疗疗疗疗基基基基因因因因工工工工程程程程产产产产品品品品法法法法医医医医学学学学检检检检测测测测人人人人类类类类学学学学研研研研究究究究基因扩增基因扩增-PCR-PCR1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理高温变性低温退火适温延伸适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍基因扩增基因扩增-PCR-PCR94949494变性变性变性变性50-6550-65退火退火退火退火72延伸延伸延伸延伸基因扩增基因扩增-PCR-PCR9494949455557272基因扩增基因扩增-PCR-PCRTaq DNA聚合酶（Thermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性( ( ( (% % % %) ) ) )温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20基因扩增基因扩增-PCR-PCR7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束第2轮开始基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95TaqTaqTaqTaq基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR的基本原理 PCR的特点灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个PFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速1.一次性加好反应液，24 小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR的反应体系和方法PCR反应体系PCR反应引物PCR反应条件标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/L基因扩增基因扩增-PCR-PCR引物设计：（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。基因扩增基因扩增-PCR-PCR3 3 5 5 35 5 限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变定点突变定点突变探针标记探针标记探针标记探针标记基因扩增基因扩增-PCR-PCR1）PCR反应成分（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。基因扩增基因扩增-PCR-PCR（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。基因扩增基因扩增-PCR-PCR（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。基因扩增基因扩增-PCR-PCR2）循环参数(1)变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。基因扩增基因扩增-PCR-PCR（3）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR的类型Asymmatric PCRReverse PCRMultiplex PCRLabelled primer PCRAnchored PCRSolid phase PCRIn stiu PCRReal-time PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究1 1）不对称）不对称PCRPCR（asymmetric PCR asymmetric PCR ） 高浓度引物低浓度引物2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶3）多重PCR（multiplex PCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。电电电电泳泳泳泳引物引物4）LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分病毒病毒1 1 病毒病毒2 2 病毒病毒 3 3 病毒病毒4 4标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物cDNAcDNA末端核酸转移酶末端核酸转移酶3GGGG3GGGG5 5 CCCCCCCC 锚定引物锚定引物3GGGG3GGGG5 5 CCCCCCCC3GGGG3GGGGCCCCCCCC5）锚式PCR（anchored PCR）6 6）PCRPCR固相分析法固相分析法模模模模板板板板生物素化生物素化生物素化生物素化引物引物引物引物PCRPCR扩扩扩扩增增增增探探探探针针针针亲和固亲和固亲和固亲和固相介质相介质相介质相介质检测探针检测探针检测探针检测探针信号信号信号信号7）原位（In stiu PCR） 原位聚合酶链式反应（In stiu PCR，IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列 原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。操作步骤 细胞或组织的固定 PCR扩增细胞内目的片段 原位杂交检测扩增产物基因扩增基因扩增-PCR-PCR人类染色体端粒人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片的荧光原位杂交照片 基因扩增基因扩增-PCR-PCR8 8）逆转录酶聚合酶mRNAmRNAcDNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增9 9）实时）实时PCRPCR技术（技术（real-time PCRreal-time PCR）Real-time PCR两种标记技术染料染色SYBR Green探针标记TaqManSYBR Green染料染料法的优缺点成本低广谱性适合初筛无模板特异性灵敏度低条件优化探针定量原理阈值CT值荧光信号穿过阈值线时的循环次数基线的调整基线 阈值 CT值CT值15，自动分析CT值15，手动分析PCR的应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他PCRPCR技术的应用技术的应用1) 1) 基因克隆基因克隆重组重组DNADNA质粒质粒DNADNA基因片段基因片段55BamBam H I H IBamBam H I H IBamBam H I H IBamBam H I H I基因扩增基因扩增-PCR-PCRGGA AT TC CGGA AT TC CC CT TA AGGC CT TA AGGGGA AT TC CGGA AT TC CC CT TA AGGC CT TA AGGCTAGCTAGGATCGATCGATCGATCCTAGCTAG质粒质粒DNADNA目的基因目的基因Bam HIBam HI限制性内切酶限制性内切酶基因克隆2)基因检测A内源性病变基因内源性病变基因正常人A病 人病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)遗传病的诊断遗传病的诊断 基因缺失、插入或置换等基因缺失、插入或置换等地中海贫血地中海贫血珠蛋白链合成不平衡珠蛋白链合成不平衡A正常人正常人正常人正常人病病病病 人人人人正常正常正常正常病病病病人人人人ASOASO探针法探针法A A A AC C C CT T T TG G G GASOASOASOASO探针探针探针探针正常正常正常正常病人病人病人病人探针杂交NC膜探针正常人突变纯合突变纯合子子突变杂合子突变杂合子基因扩增基因扩增-PCR-PCRPCR-RFLP法： 限制性内切酶限制性内切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）rasras 基因突变限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶基因扩增基因扩增-PCR-PCR正常正常正常正常突变突变突变突变电电泳泳基因扩增基因扩增-PCR-PCR HLA系统基因分型 PCR-RFLP法PCR-SSO法PCR-SSCPPCR-PCR-SSPSSP3)基因配型 PCR-SSP1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8PCRPCR1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8引物特异性4）基因鉴定女女性性男男性性Y Y引物引物PCR男性男性 女性女性 5 5）法医学分析 个体识别、亲缘鉴定方法：PCR-RFLP DNA指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性 PCR-SSCP 线粒体DNA测序PCR-VNTR多态性检测PCRPCR；电泳检测；电泳检测父父父父 父父父父 子子子子 母母母母基因扩增基因扩增-PCR-PCR 现 嫌1 嫌2 嫌3基因扩增基因扩增-PCR-PCR