1.1DNA1.1DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具专题专题1 1 基因工程基因工程福建顺昌金桥学校福建顺昌金桥学校吴程凯吴程凯DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具 “分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子缝合针分子缝合针”“分子运输车分子运输车”CTTCATGAATTCCGTATGGATCCTAA GAAGTACTTAAGGCATACCTAGGATT EcoR限制酶酶切位点GGCATCCTAG AATTCCGTAGCTTCATG GAAGTACTTAABamH限制酶酶切位点 GATCCTAA GATT“分子手术刀”-限制酶 DNADNA连接酶连接的是两个脱氧核苷酸分子的什么部连接酶连接的是两个脱氧核苷酸分子的什么部位？位？“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶CTTAAGAATTCG磷酸二酯键磷酸二酯键基因的载体质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等。“分子运输车”载体必须具备的条件：3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；4、对受体细胞无害。载体的作用：1、将外源基因转移到受体细胞中去。2、利用载体在受体细胞内对外源基因进行大量复制。常用的载体有：模拟DNA重组技术，探究载体的特点探究一：如果条件充分，此时我们得到的目的基因和载体是否能够成功连接？探究二：将多个EcoRI酶切后的载体与目的基因混合后，加入DNA连接酶，其连接产物可能有哪些种？请大家尝试操作。 2、载体与载体之间的连接1、目的基因与目的基因之间的连接4、载体自身环化 3、目的基因自身环化5、载体与目的基因之间的连接同向插入反向插入目的基因插入方向不同，将导致出现不同的基因产物探究活动：模拟重组DNA探究一：如果条件充分，此时我们得到的目的基因和载体是否能够成功连接？探究二：将多个EcoRI酶切后的载体与目的基因混合后，加入DNA连接酶，其连接产物可能有哪些种？请大家尝试操作。探究三：我们如何解决目的基因定向插入这个问题呢？ 两种限制酶切割产生的黏性末端不同载体与载体间，目的基因与目的基因间仍可连接载体及目的基因无法自身环化得出结论：载体上含有多个酶切位点，利用双酶切的方法，可以保证目的基因的定向插入，同时还避免了载体及目的基因的自身环化，提高DNA重组率，实现目的基因的正确转录和表达。探究四：前面操作中，载体与载体重组得到的DNA，载体与目的基因重组得到的DNA上都有标记基因（如氨苄青霉素抗性基因），如何筛选出含目的基因的重组DNA呢？如果将一个标记基因（四环素抗性基因）放在目的基因的插入位置，当目的基因插入时，这个标记基因将被破坏而无法表达，从而达到筛选的目的。得出结论：仅在青霉素培养基上生长的是含目的基因的受体细胞，在青霉素培养基和四环素培养基上都能生长的是载体自接的受体细胞。综上所述：多个酶切位点，多个标记基因，插综上所述：多个酶切位点，多个标记基因，插入失活的筛选方法是基因工程中的重要设计思入失活的筛选方法是基因工程中的重要设计思路，因此基因工程中使用的载体往往是人工合路，因此基因工程中使用的载体往往是人工合成的成的1下表为几种限制性核酸内切酶识别的序列和切割的位点。如图，已知某DNA在目的基因的两端1、2、3、4四处有BamH或EcoR或Pst的酶切位点。现用BamH和EcoR两种酶同时切割该DNA片段（假设所用的酶均可将识别位点完全切开），下列各种酶切位点情况中，可以防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状的是（ ） A1 为BamH，2为EcoR，3为BamH，4为Pst B1 为EcoR，2为BamH，3为BamH，4为PstC1 为Pst，2为EcoR，3为EcoR，4为BamH D1 为BamH，2为EcoR，3为Pst，4为EcoR 2某质粒上有Sal、Hind、BamH I三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图所示，请回答下列问题： 将含有目的基因的DNA与质粒分别用Sal I酶切，酶切产物用_ 催化连接后，两个DNA片段的连接结果有_种。 构建重组质粒时，应选用_两种酶对_进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性。