1 流式细胞术流式细胞术CD34+CD34+细胞计数细胞计数 2概论 造血干细胞移植（HSCT）是治疗血液系统疾病、自身免疫性疾病、某些实体瘤和基因缺陷等疾病的重要手段之一。在造血干细胞移植过程中采集足够数量的造血干细胞是造血干细胞移植成功的关键。 3概论 但至今为止，尚无一个与体内重建造血全吻合的造血干细胞体外检测法。 早期通过有核细胞计数、集落形成单位来计算移植物中造血干/祖细胞数量，但前者与造血干细胞数量一致性差，后者实验变异性大、耗时长，其临床使用价值低。 4概论 20世纪80年代，发现CD34分子在造血干/祖细胞上表达，为临床HSCT提供了可评价造血干/祖细胞植入最低阈值的强有力的依据。 5概论 近年来尽管体外研究表明，人类CD34-脐血干细胞也有造血活性，但大量的临床研究证实用富含CD34+细胞移植可安全、持久地重建多系造血。因此，目前临床及实验室仍然是应用CD34+细胞进行造血干细胞移植、基因转染等。 6概论 而流式细胞仪具有CD34+细胞计数准确、方便、快捷等优势，已广泛地应用于造血干/祖细胞数量的检测及采集时机的确定。 7造血干细胞的数量是造血干细胞移植 成功的关键因素造血干细胞移植造血干细胞的数量恶性血液病某些实体瘤免疫性疾病免疫缺陷病心肌血管胰岛细胞成功的关键 8 如何准确地计数造血干细胞的数量，什么是有效的质量控制成了各大实验室探讨的焦点。 常用的方法： 集落培养法 流式细胞术CD34+细胞计数法造血干细胞的检测方法 9集落培养法：优点：干细胞计数结果与移植结果相吻合缺点：很难标准化，只代表晚期干/祖细 胞，培养时间长，不能当即判断采 集物的造血干细胞数量。 10流式细胞术CD34+细胞计数法：优点：干细胞计数结果与移植结果相吻合 快速，简单，方便。 目前已取代了集落培养法 11标本标识 造血干细胞采集完成后立即抽样，抽样前要将采集袋中的细胞与小辫中的采集物混合5次以上，再封闭小辫，剪取小辫中的采集物，在小辫上标记供者编号、姓名及标本名称，送实验室检测。 12 标本标识 所有检测标本应及时贴上标签，注明 患者姓名，标本类型，采集时间，申请单和标本粘贴在一起送检，申请单要详细填写患者的信息、标本类型及检测项目，进行双平台检测时还需提供白细胞计数和分类。 13 抗凝剂的选择 不同的抗凝剂抗凝、标本的稳定性不同。EDTA抗凝的标本，常温下可保存12-24h，肝素钠或枸橼酸钠抗凝的标本可保存48h。 如果标本需用血细胞分析仪同时进行白细胞计数和分类，则应选择EDTA抗凝。 14抗凝剂的选择 1、外周血标本常选用EDTA盐抗凝，2、采集物常用枸橼酸钠凝， 3、骨髓和脐血标本可选用EDTA、 肝素或ACD 抗凝。 15标本质量 标本处理的步骤越多，细胞丢失就越多。对于全血标本，溶血后不洗涤，可以使标本处理的步骤减到最少，细胞丢失少。 16 标本质量 （标本目测） 标本常见问题有两种类型： 1 、变性或损坏的标本，需立即弃之； 2、标本在处理过程中出现错误操作，则 需进一步评价。错误操作问题需要记录下来，这对标本的处理、分析以及结果地解释将很有帮助。 17标本质量 （溶血、凝血） 1、严重溶血的标本应该放弃检测。所 有可能破坏标本完整性的异常情况均应密切观察，并记录下来。 2、即使很小的凝块也会引起血液中某些成分的选择性丢失或改变，凝血的标本应尽可能弃用。 18标本质量（温度极限） 经过长距离或长时间运送的标本，应确认标本是否过热或过冷，即使其他所有的鉴定标准都正常，也应该记录下来以利于后续的处理、分析和结果解释。 19标本质量（错误标本） 如果标本没有标签或标签与病人信息不符，应拒绝接收标本，并及时与相关医护人员沟通 20标本质量（标本保存时间及条件） 可接受的标本最长保存时间取决于抗凝剂的种类、溶血剂、储存条件及细胞浓度。实验室应该根据使用的抗凝剂和溶血剂确定可接受的标本最长保存时间。 21标本质量（标本保存时间及条件） 原则上标本采集后应立即检测，但是实际操作中往往无法做到。不能立即检测的标本应该保存于2-6冰箱中。标本的处理和免疫染色应严格按照试剂说明书进行。 22标本运送 采集标本应该在2-6环境下尽快送检，注意避免标本冻结和过热。 内部送检可用具有防漏密封的塑料袋和带盖的塑料容器等运送标本。 23标本运送 外部运送标本，包装要求含有三层体系：防水内容器；防水并含有吸附材料的第二层内容器；坚固的外包装。致病原血液标本应严格按照有关规定运送。 24CD34+细胞绝对计数方法 25CD34+细胞绝对计数方法 CD34+细胞绝对计数分为单平台方法和双平台方法。单平台方法是首选方法，它避免了室间变异和多台仪器间的系统误差。 26单平台计数单平台：在抗体染色的细胞中,等容量加入确定浓度的荧光微球，直接用FCM检测出采集物中的CD34+浓度，然后计算出采集物中的CD34+细胞总数 27 通过计数板计数或使用血细胞分析仪预先计算标本中的白细胞浓度，并严格按照操作说明书调整标本和抗体的最佳比例。白细胞浓度和抗体用量 28 白细胞过少的标本应减少单抗用量；白细胞过多的标本应使用含1%白蛋白或其他蛋白的PBS稀释到适当浓度。白细胞浓度和抗体用量 29 标本和荧光微球的移液量应精确，确保准确计数加入的定量微球的浓度和标本体积，推荐采用反向抽吸法加样。移液量 30 裂解时间和方法按照所用溶血素说明书进行操作。采用含7-AAD方案时应选择不含固定剂的溶血素，如氯化铵-Tris缓冲液。裂解红细胞 31 为避免荧光微球的丢失，单平台计数在裂解红细胞后不用离心洗涤。离心 32双平台方法双平台：分别用FCM检测出CD34+细胞在有核细胞中的比例，用血液细胞计数仪检测出有核细胞浓度，在光镜下进行白细胞分类，然后再计算出采集物中CD34+细胞总数。 33双平台方法 白细胞浓度与抗体用量同单平台方法，不需要采用已知数量的荧光微球管或加入荧光微球悬液。裂解红细胞的时间和方法按照所用溶血素说明书进行，裂解红细胞后进行离心洗涤2次。 34免疫荧光染色 可采用商品化CD34+细胞计数试剂盒或实验室自己组合的单抗。 35免疫荧光染色 自己组合的抗体中,每一种抗体都需分别滴定,以明确其噪音与阳性信号的最佳分离滴度，并检测作为组合抗体使用和作为组合抗体成分之一单独使用的平均荧光强度和阳性率，其可比性需要在均值2标准差之内。 36抗体及荧光微球的选择CD34抗体：选择PE直标的抗类抗体；CD45抗体：选择广谱的抗CD45抗体；CD34抗体同型对照：采用与CD34匹配的同一 厂家生产的同型对照；定量荧光微球：推荐使用绝对计数的商品化荧光微球。 37抗体组合方案含7-氨基放线菌素D（AAD）的三色方案：抗体组合为CD45，CD34，7-AAD；不含7-AAD的双色方案：抗体组合为CD45，CD34。 38免疫荧光染色按照试剂说明书和注意事项进行操作，一般流程如下： 39 取含1106白细胞的全血或稀释的标本50L-200L加入适量直标抗体10L-20L，室温孵育20min-30min。标本与抗体孵育 40 裂解时间和方法按照所用溶血素说明书进行操作。采用含7-AAD方案时应选择不含固定剂的溶血素，如氯化铵-Tris缓冲液。裂解红细胞 41 离心洗涤方法与溶血素有关，按照所用溶血素说明书进行操作。单平台绝对值计数法在裂解红细胞后，不要离心洗涤离心 42 采用包被有已知数量的荧光微球或按说明书加入一定数量的荧光微球。绝对计数的商品化荧光微球 43 制备好的标本在上机分析前放在4-10下避光保存，应在1h内上机检测，检测前混匀细胞。染色后标本保存 44对照通常采用同型对照和阳性对照标本同型对照：采用ISHAGE设门方法时可不需同型对照，多重逻辑设门后可去除非特异性抗体结合；对照标本 45 阳性对照：检测新批号和当前批号试剂的染色效率是否有问题时需要做阳性对照，或怀疑试剂出现问题时，采用该试剂与已知可接受性能批号的试剂同时操作进行验证。 对照标本 46阳性对照的种类：主要有全血标本，冻干淋巴细胞；使用频率：更换试剂时对照标本 47流式细胞仪的质控 包括光学系统的调整、荧光分辨率的调整、荧光补偿的调整、性能评估及比例、仪器保养及记录等。仪器的调整很多方面要遵从制造商的建议。 48数据的获取和分析 49细胞的获取 设定阈值和分辨率：根据仪器操 作说明书和试剂盒使用说明书进 行设定。 调整细胞群分布：在CD45/SSC散 点图中，调整SSC，使所有的白细 胞群均可见。 50 作CD45/SSC散点图定位白细胞群，排除标本中细胞碎片等对计数的干扰； CD45从强阳性到弱阳性，包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、原始细胞、嗜碱性粒细胞和有核红细胞。根据CD45划定白细胞区域 51 在非设门荧光散点图中，至少收集50000个白细胞及100个CD34+细胞。采集细胞数 52CD34+细胞计数 53双参数荧光散点图的设置 双平台双色CD34+细胞计数设置： CD45/SSC、CD34/SSC、 CD45/SSC、 FSC/SSC、CD45/CD34、FSC/SSC 6个散点图。 54双参数荧光散点图的设置 单平台三色CD34+细胞计数设置：CD45/SSC、CD34/SSC、 CD45/SSC、FSC/SSC，CD45/CD34、FSC/SSC、7-AAD/SSC、7-AAD/SSC 8个散点图。 55设门方法 56双平台ISHAGE设门 白细胞计数需要与CD34+细胞计数使用同一标本检测，并在6h内完成。当白细胞计数不能准确获得时，不能用双平台方法，只能用单平台方法。 57基本的ISHAGE：双平台法试剂：CD45-FITC,CD34-PE全血，直接荧光标记，溶血、洗涤、双平台设门CD45/SSC,CD34/SSC, FSC/SSC，CD45/CD34 58 59标记定义G1R1G2R1 and R2G3R1 and R2 and R3CD34+细胞 R1 and R2 and R3 and R4淋巴细胞R5双平台ISHAGE设门 60(1)CD45/SS R1包括所有CD45+及dimCD45。R5为淋巴细胞(2)CD34/SS。显示R1门内细胞。R2包括所有CD34+细胞，从低SS到中等SS强度。双平台ISHAGE设门 61(3)CD45/SS。显示R1+R2门内细胞。R3确认CD34+细胞位于低CD45与低SS区域，为真正CD34+细胞。双平台ISHAGE设门 62(4)FS/SS，取R1+R2+R3门内细胞。R4选取SS大于淋巴细胞下限的细胞，用于去除细胞碎片、聚集血小板的影响。双平台ISHAGE设门 63(5)CD45/CD34。显示R1门内细胞，设定CD45和CD34阳性十字界线，确定R1的左边界CD45下限。(6)FS/SS。显示R5门内细胞，用于确定R4的FS下限。双平台ISHAGE设门 64单平台ISHAGE设门法 商业化的CD34+细胞绝对计数试剂盒,其CD34+细胞绝对数由专门软件直接计算生成，操作依据是试剂操作说明书。实验室自己配制的抗体组合需要加入商业化荧光微球。 65 66 同双平台相比，单平台多设了R6（荧光微球）、R7（细胞碎片）及R8（活的CD34+细胞）。单平台ISHAGE设门 67单平台ISHAGE设门法 需手动设门，对操作者要求高；无需同型对照，亦不受抗体浓度及荧光素与蛋白比率的限制，经济廉价，抗体的选择范围也宽；7-AAD活细胞染料，可计数活细胞，需逻辑手动设门。 68结果报告和审核 69报告内容双平台ISHAGE法报告CD34+细胞百分比及绝对值；单平台ISHAGE法报告CD45+细胞绝对值、CD34+细胞百分比及绝对值、活CD45+细胞和CD34+细胞绝对数。 70审核内容 包括数据采集阈值的设置、采集细胞数和微粒数、散射光模式、抗体组合方案、与实验结果相关的所有设门等。这些数据均由实验室专业人员在解释数据时进行审核。 71参考范围 每个实验室都应确定本实验室CD34+细胞在外周血、动员后的外周血、采集物、骨髓和脐带血中的参考范围。 72数据储存 数据储存和检测数据的方法都应详细记录，以便于检测者或医师对数据进行复核。保留报告原始数据至少2年。 73室内质控 实验室应开展室内控制工作，建议每月至少进行室内质控一次。进行室内质控品检测前，首先采用健康志愿者的新鲜外周血标本作为质控物上机测定，一般需要做重复测定。 74室间质控 实验室应参加国内或国外质评机构组织的室间质量评价和能力验证，用于能力验证的样本需与病人标本同等对待，要求检验人员和检验流程完全一致。 75人员培训 流式细胞分析室应具有监督人员和操作人员岗位，并制定用于培训的标准化操作规程。实验室监督人员对每一位操作人员的培训效果、流式细胞术检测能力进行考核并决定是否授权上岗。 76小结 应用流式细胞CD34+细胞计数是一个已被普遍接受的快速、简便的方法； 77小结 不同流式细胞术CD34+计数各有优缺点，所得结果有一定的差别； 单平台ISHAGE法重复性好，室间差异小，但技术要求高。 78