HRMHRM应用实验设计及结应用实验设计及结果分析果分析内内 容容一、背景介绍一、背景介绍二、实验设计二、实验设计三、反应体系三、反应体系四、结果分析四、结果分析一、背景介绍一、背景介绍HRM分析技术分析技术l高分辨率熔解（High Resolution Melting，HRM）分析技术是基于核酸的物理性质，通过饱和的插入染料监控DNA熔解曲线变化而进行分析的一种技术。lHRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，无需使用序列特异性探针，具有高灵敏度、操作简单、高通量、成本低等优点。lHRM是美国犹他大学保健科学中心病理学部Carl Wittwer实验室与美国Idaho Technology公司于2003年共同合作开发出来的建立在实时荧光基础上的分析技术，并于2006生产出世界上第一台HRM仪器HR-1。nHRM分析过程原始曲线随着DNA熔解，插入DNA双链中的染料被释放，荧光信号骤降导数图“速率”曲线的最高峰是分离速率最大的点，即等于熔解温度对PCR的扩增子进行加热，温度 从50逐渐上升到95。扩增子逐渐解链，到达熔解温度（Tm）时，DNA双链完全分开。初期，荧光强度很高，随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度下降。通过检测器，记录荧光变化的过程。对数据作图，就生成了熔解曲线 。HRM发明者CarlWittwer博士nHRM应用主要基于两种技术的进步：双链DNA嵌入型饱和荧光染料如LC Green具有精确控温装置和高密度数据采集的仪器n嵌入型染料-非饱和染料SYBRGreenInSYBRGreenI对PCR有抑制作用，必需使用低浓度；即使是高浓度，也不能饱和插入DNA双螺旋结构中的小沟n非饱和态结合使染料在熔解过程中发生重排，染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，特异性下降n嵌入型染料-饱和染料LCGreenn饱和染料在饱和浓度（荧光最大）下，也不会抑制PCR；高浓度的染料饱和插入DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发生重排，熔解曲线有更高的分辨率n饱和染料主要有LCGreen、LCGreenPlus、CYTO9等n目前市场上HRM分析仪器的供应商，有专用于HRM的仪器，还有附带HRM功能的Real Time PCR仪，包括：Idaho TechnologyQIAGENRocheHRM对检测仪器的要求n扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。只要一个碱基发生了突变，就会改变DNA链的解链温度。n解链温度差异极小，零点几摄氏度，使用高分辨率的仪器才可以检测。 孔间温度差异（温度均一性：Tm的标准偏差为0.020-0.264），孔间温度均一性要达到0.264 以内才能保证HRM分析结果的准确性。大多数Real Time PCR仪的孔间温度差在0.3-0.5，决定了无法胜任HRM 熔解速率（最低要求：0.1/秒） 数据密度（最低要求：10个数据点/）n可以区分单碱基差异nHRM基因分型不需要设计特异性的TaqMan探针，只是通过溶解曲线的分析来区分等位基因，从而大大降低了检测成本。n使用两种不同的等位基因特异性正向引物，正向引物3 端的最后一个碱基对应于SNP位点的二等位基因，反向引物都一样，并使用荧光染料（SYBR Green I）来检测PCR产物。纯合子基因组DNA只能被与其完全匹配的正向引物扩增，而杂合子基因组DNA能同时和两种正向引物结合扩增出两种PCR产物。HRM应用nHRM区分单碱基差异n同源双链（Homoduplex）n纯合子通过Tm值（CT）容易区分HRM应用T ACGT ACGnHRM区分单碱基差异n同源双链（Homoduplex）n杂合子形成异源双链（heteroduplexes），杂合子的熔解曲线是由4种配对方式混合而成+T ACG+T GCAHRM应用n1.突变发现/筛查/扫描n2.SNP基因分型/等位基因区分n3.物种鉴定n4.表观遗传学/DNA甲基化n5.微卫星分析HRM应用HRM的本质二、实验设计二、实验设计成功的HRM分析的先决条件分析小片段DNA分析纯度单一的产物使用足够的PCR的模板检查扩增曲线是否异常保持扩增产物浓度接近确保样品间的均一性保证在熔解前相和熔解后相都有足够的数据采集时间实验方法的验证镁离子浓度缓冲液盐浓度Taq储存液中的添加剂内掺染料种类及浓度反应体积熔解升温速率 (=温度变化速度)反应容器熔解曲线异常可能由以下因素引起：熔解曲线异常可能由以下因素引起：样品准备防止核酸降解避免过量的抑制剂,如乙醇为使结果更佳，尽可能保证起始样品浓度一致建议用分光光度计检测核酸的浓度和纯度注意注意:260nm时1OD等于50g/mL的双链DNA纯的其260nm/280nm应为2试验设计准则对目标序列进行充分了解 确定目标序列内的各种变化形式 检查种属同源性 内含子外显子边界 剪切位点 已知SNP等将引物的退火温度设计在60度左右，片段长度100-250bp可以使用长片段，但长片段检测的灵敏度会受影响确定产物和引物在退火温度时的折叠特征 (使用如DINAMelt，并确定特异性 (BLAST搜索)扩增子的设计方法第一步：确定正确的周边序列在数据库中寻找含有多态性位点的序列，NCBISNP在线搜索引擎(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)第二步：鉴定其它序列特性 将你的序列与全基因组序列进行BLAST，以确定目标序列内是否存在其它多态性位点（这些位点会以蓝色标出，而目标位点以黄色标出）第三步：拷贝含有目标位点的序列，避免那此蓝色位点第四步：将目标序列粘贴到扩增子设计软件（这里用Primer3软件 http:/frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi）第五步：建立引物设计参数。如片段长度6090bp(最多达 250bp)，引物长度18-27bp，TM值 57-63，GC含量 20-80%第六步：选择引物。分别选择两三条上下游引物第七步：检查二级结构。用二级结构解释软件检查引物和扩增子的折叠特性。这里使用了DINAMeltServers(http:/www.bioinfo.rpi.edu/applications/hybrid/twostate-fold.php)第八步：将引物序列与该物种基因组序列相BLAST，以确定其特异性第一步：确定正确的周边序列例（FactorVLeiden）：第二步：鉴定其它序列特性第三步：拷贝含有目标位点的序列，避免那些蓝色位点第四步：将目标序列粘贴到扩增子设计软件第五步：建立引物设计参数第六步：选择引物第七步：检查二级结构第八步：将引物序列与该物种基因组序列相BLAST，以确定其特异性三、反应体系三、反应体系ComponentConcentrationDiluent(Mol.Biol.Gradewater)-PCRBuffer1XMgCl21.5mMdNTPs0.2mMForwardprimer300nMReverseprimer300nMSYTO91.5MEvaGreen1-2XTaqDNApolymerase1.25UDNATemplate3x109copies/L所需的试剂与耗材试剂耗材热启动TaqPlatinumTaqDNApolymerase(Invitrogen)HotstartTaq(Qiagen)10XPCR缓冲液随Taq酶50mMMgCl2随Taq酶100mMdNTP溶液Invitrogene,NEB等饱和内掺染料SYTO9(Invitrogen)EvaGreen(Biotium)LCGreen(IdahoTechnology)EcoplatesEcoAdhesiveSeals试剂的处理与保存条件ReagentStorage Temp.Storage StateTaqDNApolymerase20oCNotCritical10XPCRBuffer20oCNotCritical50mMMgCl21824oCNotCritical100mMdATPSolution20oCNotCritical内掺染料20oCDark软件设置软件设置演示四、结果分析四、结果分析标准视图：差异视图：谢谢谢谢！专才服务专家结束结束