http:/www.ppkao.com资料分享平台 第一章 绪 论 一、细胞生物学概况 二、细胞生物学简史 三、细胞生物学研究内容 四、细胞生物学学习方法 一、细胞生物学概况(P1) 1、什么是细胞生物学？ 细胞生物学（cell biology）是研究细胞基本生命活动规律的科学，是现代生命科学的重要基础学科之一；它从显微、亚显微和分子三个层次以动态的观点来研究细胞和细胞器结构与功能，探讨细胞的各种生命活动规律。 2、细胞是所有生物体（不包括病毒）一切生命活动的基本单位 具有自我复制、自我装配和自我调控的能力，通过与外界物质和信息交流，保持自身动态平衡。 病毒、生物大分子和细胞的关系 “一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找” “一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找” 3、细胞生物学分支 细胞形态学 细胞遗传学 细胞化学 细胞生理学 细胞分类学 细胞免疫学 二、细胞生物学发展简史（P8） 五个阶段 1、细胞的发现 1665 年 Robert Hooke（英）(30)“cellar”cell 1677 年 Leeuwen Hoek（荷兰）（ 300）活细胞观察，第一次观察到原生动物、人类和 动物的精子。 2、细胞学说的建立 1838 1839 Schleiden 和 Schwann（德）分别提出了细胞学说（cell theory）； 基本内容:所有生物都是由一个或者多个细胞构成的；细胞是生命的基本单位。 1858 年 Rodulf Virchow（德）对细胞学说进行了重要补充：细胞只能来自细胞。 意义：19 世纪自然科学三大发现之一； 现代生物学三大基石之一。 3、细胞学经典时期19 世纪的后25 年 (P9) 原生质理论的提出：protoplasm 1861 年，Max Schultze： 有机体的单位是一小团原生质，这种物质在一般有机体是相似的。 细胞分裂的研究：有丝、减数分裂； 重要细胞器的发现。 4、实验细胞学及发展（1900 1953） (P10) experimental cytology用实验的手段研究细胞学的问题,即从形态结构的观察深入到生理功能、生物化学及遗传发育机理的研究。 细胞遗传学 细胞生理学 细胞化学 5、细胞生物学学科形成、发展 （ 20 世纪50 年代）(P12) http:/www.ppkao.com资料分享平台 1953 年 DNA 结构的发现分子生物学诞生； 1965 年，D P Derobetis 将普通细胞学改为细胞生物学，标志着细胞生物学的诞生。 新研究技术手段的促进：电子显微镜、超薄切片、扫描隧道显微镜、细胞化学、分子生物学 80 年代：分子细胞生物学（Molecular Cell Biology） 细胞生物学发展历史(总结) 1、细胞的发现、细胞学说的创立（1665 1874）； 2、细胞学的经典时期（1875 1900）； 3、实验细胞学时期（1900 1953）； 4、细胞生物学的诞生和发展（1953） 三、细胞生物学的研究内容(P2) 1、膜学和细胞器学 生物膜细胞质膜和细胞内膜的总称，细胞物质交换、能量转换、信息交流的关键功能部位。 细胞器学探讨细胞器的结构和功能 2、核学和染色体学 细胞生物学、分子遗传学、发育生物学共同关注的焦点之一，研究染色体结构动态变化与基因表达及其调控的关系。 3、细胞骨架体系 4、细胞分裂和细胞分化 5、细胞凋亡 6、细胞工程学 四、细胞生物学学习方法 1、细胞是生命结构和功能的基本单位，细胞生物学在生命科学研究领域具有重要地位； 2、明确细胞的结构和功能的一致性； 3、从显微、亚微和分子三个层次来认识细胞的结构与功能； 4、和多学科知识相结合，同分子生物学、生物化学、遗传学、生理学等课程紧密联系； 5、注意细胞生物学各章节之间内容的相互关联； 6、关注学科前沿；关注新技术方法进展；学习一点科技史。 本 章 完 一、细胞生物学概况 二、细胞生物学简史 三、细胞生物学研究内容 四、细胞生物学学习方法 一、光学显微技术(P49) 1、普通复式光学显微镜技术 组成：光学放大系统、照明系统、机械系统； 性能参数：放大倍数、分辨力、清晰度、焦点深度、镜像亮度等，其中最重要的是分辨力。 分辨力（分辨率、分辨本领）：能分辨两个物点之间最短距离的能力。该距离越小，则分辨力越高。 显微镜的分辨力计算公式： 普通光镜分辨极限 最大值140； 最小波长450nm； N 最大值1.5； 因此普通光镜的分辨力极限为0.2 微米，此数值亦为显微水平和亚微水平的分界点。 普通光镜有效放大倍数（经验值）物镜最大镜口率1000 http:/www.ppkao.com资料分享平台 提高光学显微镜分辨力的手段 a、缩短照明光线波长； b、应用特殊光学效应，增强反差。 显微镜技术和计算机技术结合 倒置显微镜 2、荧光显微镜技术(P49)（ fluorescence microscopy） 原理：以紫外光为光源，激发标本中的荧光物质产生荧光，从而对某些物质进行定性和定位分析。 荧光种类： 自发荧光：细胞内某些天然物质被UV 激发产生的荧光，如叶绿素产生血红色荧光。 诱发荧光：细胞中加入荧光染料，与特定成分结 合，经过UV 照射发出荧光。 荧光显微镜的工作原理Olympus BX 51 荧光显微镜 3、激光共聚焦扫描显微镜(P50)（ laser scanning confocal microscope， LSCM） 4、相差和微分干涉显微镜技术(P50) 相差显微镜：phase contrast microscope, Ph ） 1935 年荷兰物理学家Frits Zernicke 发明了相差显微镜，它利用光的衍射和干涉原理， 将人眼无法感受到的光的相位差转换成为人眼可以感受到的振幅差，从而将无色透明物体中的细节表现为明与暗的对比，适合观察活细胞和未染色的样品 。 普通光学显微镜 相差显微镜 微分干涉显微镜(P51)（ differential interference microscope ， DIM） DIM 获得的反差取决于光线穿过样品折射率变化的速率。样品边缘结构反差增大（相对小的距离内折射率发生明显变化）。 Nomarski microscope 二、电子显微镜技术(P51) 1、透射电子显微镜（transmission electron microscope， TEM） 电子显微镜是模仿光学显微镜的工作原理，用电子束来代替可见光束，用电磁线圈代替玻璃透镜汇聚电子束，通过荧光屏或者胶片捕获图像的观察工具，理论分辨率可达0.2nm 。 HITACHI H-8100 透射电子显微镜 电子显微镜基本构造(P52) 电子显微镜基本构造 电子显微镜基本构造 电子显微镜基本构造 超薄切片制备 2、透射电镜特点 “照明”光源电子束 放大倍数调节方式改变磁透镜电流强度 高电压工作几万十几万伏 内部高真空10 4 托 样品厚度90nm电子穿透力有限，产热 标本染色技术不同重金属盐（正染，负染） 冰冻蚀刻（冰冻断裂）技术 freeze etching（ freeze fracture） 样品于-190快速冰冻在真空中用冷却刀切割撕裂真空中冰升华暴露出的断裂面喷碳膜或者碳-铂膜（表面复型膜）用有机溶剂或酶去除样品将膜金属喷镀后在电镜下观察 2、扫描电子显微镜（P58）（ scanning electron microscope， SEM） SEM 发明于1965 年，它是利用电子束扫描样品表面，再通过检测样品表面逐点散发的二次电子，将样品表面的形貌逐点成像并合成为放大的图像。 PHILIPS XL20 扫描电子显微镜 http:/www.ppkao.com资料分享平台 扫描电镜的特点： 可观察较大较厚的样品； 景深大，获得的是清晰逼真的三维立体图像； 放大倍数在20 20 万倍间连续变换，无需多次聚焦； 样品可在样品室内多方位移动和转动； 分辨力不太高：3 10nm 只能观察标本表面，不能观察内部。 3、扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope， STM）（ P59） 1981 年发明的用于探测微观世界物质表面形貌的仪器。 利用量子力学中的隧道效应。 扫描隧道电镜下的DNA 双螺旋 STM 的特点： 具有原子尺度的高分辨本领； 真空、大气、液体环境中都能工作，不接触样品，保持样品原貌。 原子力显微镜（atomic force microscope， AFM） 第二节 细胞组分的分析方法 一、超速离心技术（P60） 离心技术原理 由于不同的细胞器具有不同的密度和体积，因此，可以利用离心方法加以分离和纯化。 1、差速离心（differential centrifugation） 利用不同的离心速度产生的不同的离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分离开来。适合分离沉降速率差别较大的亚微结构颗粒。 多次离心达到纯化的目的 2、密度梯度离心（P61） 蔗糖密度梯度离心 氯化铯密度梯度离心 将介质形成一函盖所有组分密度的密度梯度，不同的样品由于其密度差异，在离心过程中进入到等密度介质区域即不再移动，从而实现分离的目的。 蔗糖密度梯度离心和氯化铯密度梯度离心的比较 二、组织化学和细胞化学（P61） 利用一些显色剂与被测物质中的某些基团特异性结合，来判断核酸、蛋白质（酶）、糖类、脂类在细胞中的分布和含量。 福尔根（Feulgen）反应显示DNA 格莫瑞（Gomori）反应显示碱性磷酸酶 三、免疫细胞化学（P62）（ Immunocytochemistry， ICC） 根据抗体能与对应的抗原自行识别结合的免疫学原理，来检测特定蛋白质在细胞内的分布状况和含量。 人成纤维细胞中肌动蛋白束（800） BHK 细胞中的微管蛋白（500） 四、细胞内特异核酸序列的定位和定性 研究对象：细胞内特异核酸（DNA 或 RNA） 目的：进行定位、定量分析 方法：原位杂交（in situ hybridization， ISH）以目标核酸的互补序列为探针，对细胞或者组织标本进行杂交处理，使目标核酸可视呈现的技术。是细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学相互交融的研究手段。 构建DNA 分子物理图谱 光谱核型分析（spectral karyotype， SKY） SKY of Human 五、定量细胞化学分析技术P65 细胞分选（cell sorting） http:/www.ppkao.com资料分享平台 是细胞生物学中较新技术，是利用流式细胞仪（flow cytometery， FCM）对细胞或者其他生物微粒（如染色体）进行分选，并对其进行定量分析（大小、形状、核酸含量和蛋白质含量等）的技术。 1、流式细胞仪（FCM） 是集合了流体喷射、激光、伽马射线能谱、电子计算机、显微荧光光度计量等技术于一体的设备; 可以定性和定量分析生物颗粒（包括细胞）的物理化学特性并将之分离纯化; 目前的FCM 已经运用于细胞生物学、肿瘤学、免疫学、血清学、药物学等研究领域，可以用来分析免疫复合物、病毒、脂质体、细胞器、原核细胞、真核细胞、简单多细胞生物等等。 流式细胞仪结构和工作原理 2、标记细胞： 免疫荧光染色 荧光素标记抗体：异硫氰酸荧光素（FITC）、 藻红素（PE）、 Texas 红（Texas Red） 荧光染色分为：直接染色和间接染色 荧光染料直接染色 使用碘化丙啶（propidium iodide， PI）或者DAPI，对固定处理过的细胞或者细胞核直接进行染色，利用这些荧光染料嵌合入双螺旋结构堆积的碱基之间，使得所有双链区域均被染色。再利用FCM 根据细胞激发的荧光的差异对细胞加以分离。 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一、细胞培养P66 1、什么是细胞培养 是指从机体内取出某种组织或者细胞，模拟机体内的生理条件使其在体外生存、生长和繁殖的过程。 细胞培养示意图 2、细胞培养分类： 按照培养过程中培养物是否经过了分割，分类为： 原代培养（primary culture） 继代培养（secondary culture）或者再培养（subculture） 原代培养（primary culture） 直接从机体取出组织或者细胞后所进行的首次培养。 继代培养（secondary culture） / 传代培养（subculture） 当原代培养的细胞增殖到一定的密度后，将其从原培养容器中取出，按照一定的比例向另外一个或者多个容器中所进行的再培养，简称传代。传代的累计次数就是细胞的代数。 两个概念 细胞系（cell line）：通过原代培养并且经过传代后所形成的细胞群体，由于来源于原代培养物，故一个细胞系往往由多个生物学性状不同的细胞群体组成。如HeLa、 CHO 等。 细胞株（cell strain）：利用单细胞分离培养法或者克隆形成法从原代培养物或者细胞系中选择出来的细胞群体，一个细胞株往往具有特殊的生物学性状或者标记，并且可以持续存在。 二、细胞工程（cell engineering） 细胞水平的生物工程。 （一）细胞融合 1、细胞融合（cell fusion）两个或者多个细胞融合成双核或者多核细胞的现象。产生的细胞称为融合细胞。 2、细胞融合的应用： 动物和植物的不同种、属之间的细胞可以融合，并且动植物之间的细胞可以融合，从而培养成各种性状的杂种细胞。 细胞融合被广泛应用于研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、研究肿瘤发生机制等领域。 3、人工诱导细胞融合： http:/www.ppkao.com资料分享平台 病毒诱导融合：灭活的仙台病毒等。 化学诱导融合：PEG 电激诱导融合： （二）单克隆抗体技术（三）细胞显微操作技术 第四章 细胞膜和细胞表面Plasma Membrane & its Surface Structures 第一节 主要内容 一、细胞膜的研究历史和结构模型（model） 二、细胞膜的化学组成（膜脂、膜蛋白） 三、细胞膜的性质（膜的流动性、不对称性） 四、细胞膜的功能 五、膜骨架与细胞表面特化结构 一、 细胞膜的研究历史和结构模型P73 1、 Ernest Overton （ 1895） 发现： 溶于脂肪的物质很容易透过植物的细胞膜； 不溶于脂肪的物质不易透过细胞膜。 推测细胞膜由连续的脂类物质组成。 2、 E. Gorter 和 F. Grendel（ 1925）发现： 红细胞质膜的脂类成分在水面展开的面积是红细胞表面积的2 倍 推测细胞膜由双层脂分子组成。 3、三明治式质膜结构模型P74 J. Danielli 和 H. Davson（ 1935） 发现：质膜的表面张力比油水界面的张力低得多，推测膜中含有蛋白质。 1959 年提出了“蛋白质脂质蛋白质”的三明治式的质膜结构模型 4、单位膜模型（unit membrane model） J. D. Robertson 1959 用超薄切片技术获得了清晰的细胞膜照片，显示暗-明 -暗三层结构 5、流动镶嵌模型（fluid mosaic model） S. J. Singer 和 G. Nicolson 1972 根据免疫荧光技术、冰冻蚀刻技术的研究结果，提出了“流动镶嵌模型”。 6、晶格镶嵌模型 Wallach（ 1975） 生物膜含有的”流动性脂质“进行可逆地无序(流动性)到有序(晶态)的相变。 在大多数动物细胞的膜系统中,这种 “流动性脂质”呈小片的点状分布,面积小于100 nm2。 7、板块镶嵌模型 1977 年 ,Jain 和 White 提出了板块镶嵌模型。 在流动的类脂双分子层中存在许多大小不同,刚度较大的彼此独立移动的类脂板块(有序结构板块)。 8、脂筏（lipid rafts）和质膜微囊（caveolae）（补充） 1997 年。脂筏富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域 ， 约 70nm 左右，是一种动态结构，位于质膜的外小页；介于无序液体与液晶之间，称为有序液体（Lo）；如同一个蛋白质停泊的平台，与膜的信号转导、蛋白质分选均有密切的关系。 1995 年。质膜微囊细胞表面内陷小孔结构，以鞘脂和胆固醇为主，以微囊素/内陷素（ caveolin）为标志蛋白。 脂筏和质膜微囊的功能： 信号转导中心？ 膜的运送内吞、外排 疾病关联癌、动脉粥样硬化、糖尿病、老年性痴呆 质膜应该视为脂质、蛋白质和糖组成的一个不均匀的超分子体系，膜脂以甘油酯为主体，大小不一的、以鞘脂和胆固醇为主要成分的微区分散在主体中。主体和微区都含有数量不等的膜蛋白。 1、微区的功能机制？ http:/www.ppkao.com资料分享平台 2、微区小，难以分离 3、信号分子与微区的关系？ 4、微区在医药的应用？ 二、细胞膜的化学组成 p76 综述： 质膜主要由膜脂和膜蛋白组成，另外还有少量的糖。 膜脂是膜的基本骨架，膜蛋白是膜功能的主要体现者。 （一）膜脂（membrane lipid） 分类：膜脂是生物膜的基本成分，主要包括磷酸甘油酯、神经鞘酯和胆固醇三种类型。 1、磷酸甘油酯： 是构成膜脂的基本成分，约占整个膜脂的50以上。 磷酸甘油酯 phosphoglycerides O O CH2 O C R1 R2 C O CH O CH2 O P O X O- 主要类型有： 磷脂酰胆碱(PC)， 旧称卵磷脂 磷脂酰丝氨酸(PS) 磷脂酰乙醇胺(PE), 旧称脑磷脂 磷脂酰肌醇(PI) 双磷脂酰甘油( DPG) , 旧称心磷脂 磷脂的分子结构特征 1）头尾： “一头二尾”（心磷脂4 尾） ； 2）碳链：碳原子多为1620，偶数。 3） 饱和性：饱和、单不饱和、多不饱和。 2、神经鞘酯（sphingolipids） 是一类含量较少的膜脂，是鞘胺醇的衍生物。 鞘磷脂（sphingomyelin） 鞘胺醇的衍生物以鞘胺醇为骨架，与一条脂肪酸链组成疏水尾部，与含胆碱的磷酸基团组成亲水头部；在神经系统中含量特别丰富。 原核细胞、植物中无鞘磷脂。 糖脂（glycolipid） 鞘胺醇的衍生物以鞘胺醇为骨架，与一条脂肪酸链组成疏水尾部，与一个或多个糖残基组成亲水头部，在神经细胞膜上糖脂含量较高；最简单的糖脂是半乳糖脑苷脂，在髓鞘的多层膜中含量丰富；变化最多、最复杂的糖脂是神经节苷脂。 3、胆固醇（cholesterol） 动物中含量最丰富的固醇类化合物； 植物和细菌中少； 在脑、神经组织及肾上腺中含量丰富，其次是在肝、肾、脾、皮肤和脂肪组织中。 胆固醇对细胞膜流动性的影响 在相变温度以上,它可使磷脂分子的脂酰链末端的运动减小,即限制膜的流动性。 在相变温度以下,可增加脂类分子脂酰链的运动,这样可以增强膜的流动性。 膜脂的特性：厚度约6nm；连续广泛的网络；可变形；自组装（self assemble）。 膜脂的运动方式（P76 77） 1、沿膜平面的侧向运动；*2、脂分子围绕轴心的自旋运动；3、脂分子尾部的摆动； 4、双层脂分子之间的翻转运动。 脂质体（liposome） p77 本质：利用了脂双分子层的自组装性，是一种人工膜。 在水中，搅动磷脂形成的双层脂分子球形体，直径251000nm 不等。 http:/www.ppkao.com资料分享平台 人工脂质体的用途： 1.研究生物膜的特性 2. 药物和DNA 的载体 隐形脂质体（stealth liposomes） （二）膜糖 共价连接在膜脂和膜蛋白上的糖类（2 8） 。 90以共价键与蛋白质糖蛋白；10连接到脂类糖脂。 膜糖的功能： 细胞与环境的相互作用 接触抑制 信号转导蛋白质分选 保护作用等。 （三）膜蛋白 P78 种类繁多, 是膜功能的主要体现者。据估计核基因组编码的蛋白质中约30%为膜蛋白。 1、分类：根据膜蛋白与脂分子的结合方式，分为三类： 外周蛋白（peripheral protein） 膜内在蛋白（integral protein ）或整合蛋白 脂锚定蛋白（lipid anchored protein） 外周蛋白 是水溶性蛋白，暴露在脂双层的外侧或内侧；与质膜以非共价键形式连接； 改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来。 膜内在蛋白 p78 整合蛋白多数为跨膜蛋白（tansmembrane proteins），是两性分子； 与膜的结合非常紧密，只有用去垢剂才能从膜上洗涤下来，如SDS（离子型）， TritonX-100（非离子型）。 膜内在蛋白与膜脂的结合方式 p78 三、细胞膜的性质 （一）细胞膜的流动性（P81） 1、 膜脂的流动：“刚柔并济” 影响膜脂流动性的因素 胆固醇含量：含量增加，降低膜的流动性； 脂肪酸链的饱和度：脂肪酸链所含双键越多，越不饱和，膜流动性越强。 脂肪酸链的长度：长链，相变温度高，膜流动性低； 卵磷脂/鞘磷脂比例：该比例高则膜流动性增加，是因为鞘磷脂粘度高于卵磷脂； 其他因素：温度、酸碱度、离子强度等。 2、 膜蛋白的流动性 （ P82） 膜蛋白在脂双层二维溶液中的运动是自发的热运动（主要为侧向流动），不需要代谢产物的参加和能量的提供。 膜蛋白的流动性是相对的。表现为某些膜蛋白在细胞膜表面的分布有一定的区域性，甚至有的蛋白是不流动的，原因是某些蛋白与细胞膜下的细胞骨架相结合，流动受到限制。 整合膜蛋白的运动方式 影响膜蛋白移动的因素 整合蛋白相互间的影响膜骨架的影响细胞外基质的影响相邻细胞的影响 细胞外配体、抗体、及药物大分子的影响 研究膜蛋白流动的实验技术1 P82 荧光抗体免疫标记细胞融合 研究膜流动性的实验技术2P83 光脱色荧光恢复技术 FRAPfluorescence recovery after photobleaching 膜蛋白或者膜脂被荧光素标记，再用激光照射某一区域，被照射区的荧光因为淬灭而变弱。由于膜的流动性，粹灭区域亮度会逐渐增加，最后与周围两度等同。荧光恢复的速度间接反映出膜蛋白或者膜脂扩散的速度。 3、 质膜流动性的意义 1） 膜的流动性有利于酶的侧向扩散和旋转运动； 2） 膜的流动性保证了物质的运输； 3）膜流动性与信号转导； 4）膜的流动性和能量转换； 5） 膜的流动性与细胞的发育和衰老。 http:/www.ppkao.com资料分享平台 （二）细胞膜的不对称性 P83 质膜内外两层的组分和功能的差异， 1、 细胞膜各部分的名称 ES EF PF PS 小鼠肝细胞膜冰冻蚀刻 2、膜的不对称性 p83 1）膜脂的不对称性： 2）复合糖的不对称性：糖脂和糖蛋白只分布于细胞膜的外表面。 3）膜蛋白的不对称性：每种膜蛋白分子在细胞膜上都具有特定的方向性和分布的区域性。如各种激素的受体具有极性，细胞色素C 位于线粒体内膜内侧。 四、细胞膜的功能 p84 1、区域化排除干扰，独立调节； 2、选择性通透屏障； 3、物质运输选择性的物质运输（输入与排出）； 4、应答信号感受外界刺激； 5、生化活动框架为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行； 6、连接细胞介导细胞/细胞、细胞/基质的连接； 7、能量转换光合作用； 8、特化结构 五 、膜骨架与细胞表面的特化结构 P85 （一）膜骨架（membrane associated cytoskeleton） 定义：膜骨架是质膜下与膜蛋白相连的纤维蛋白组成的网架结构。 作用：维持质膜的形状并协助质膜完成多种生理功能。 研究材料：成熟的哺乳动物血红细胞 红细胞研究质膜的良好材料 不贵，可大量获得； 游离，无需从复杂组织中分离； 无核膜和内膜，避免膜样品的污染； 简单处理溶血，就能获得血影。 红细胞血影 （二）红细胞质膜蛋白及膜骨架 红细胞膜骨架：在红细胞膜的内侧，由膜蛋白和纤维蛋白组成的网架。 人红细胞膜蛋白SDS PAGE 电泳分布 1、红细胞膜内存在的蛋白质 约 15 种蛋白，其中主要的有3 种 : 血影蛋白（spectrin）：又叫收缩蛋白，是膜骨架主要成分， 、 亚基构成，非膜蛋白； 血型糖蛋白A（ glycophorin A）： 红细胞膜蛋白，富含唾液酸，类似的还有血型糖蛋白B、 C、D，单次跨膜蛋白； 带 3 蛋白（band 3 protein）：膜蛋白， “阴离子通道”；多次跨膜（12 14 次） 肌动蛋白（actin）：又称带5 蛋白，是膜骨架的主要成分，肌动蛋白纤维上有多个与血影蛋白结合的位点。 锚定蛋白（ankyrin）：又称带2.1 蛋白，一方面连接血影蛋白，一方面连接带3 蛋白； 带 4.1 蛋白（band 4.1 protein）：膜骨架成分，促使血影蛋白和肌动蛋白结合； 2、红细胞膜骨架的组成： 血影蛋白在带4.1 蛋白的协助下与肌动蛋白结合成膜骨架基本网络； 锚定蛋白与血影蛋白、带3 蛋白相互作用。 （三）细胞表面特化结构 包括鞭毛、纤毛、微绒毛、细胞的变形足等； 与细胞运动、细胞的物质交换有关。 第二节 细胞连接 cell junction 本节内容 一、封闭连接；二、锚定连接；三、通讯连接；四、细胞表面的粘着因子； 细胞连接（cell junction） p87 http:/www.ppkao.com资料分享平台 定义：细胞连接是细胞与细胞间或细胞与细胞外基质间（97 页）的联结结构。 分类：分为三大类，即： 紧密连接（ tight junction）锚定连接（ anchoring junction） 通讯连接（ communicating junction） 一、紧密连接 （ tight junction， TJ） 分布：脊椎动物上皮细胞之间； 形态：网络状蛋白质焊接线嵴线； 成分：成串的跨膜蛋白； 特点：相邻质膜紧密结合。隔离、支持。 嵴线：相互交联，封闭细胞间空隙，甚至可阻止水分子的通过。 作用： 阻止溶液中的分子沿间隙进入体内； 同时具有隔离和支持的功能 血脑屏障 Tight Junction in Epithelia of Rabbit Tight junction 二、锚定连接（anchoring junction） P88 分布：在机体中广泛分布， 在上皮组织、心肌和子宫颈等组织中含量尤为丰富。 以细胞质骨架为锚定基础。 作用：将相邻细胞的骨架系统或者将细胞与基质相连，形成坚挺有序的细胞群体。 分类： 与中间纤维相连桥粒和半桥粒 与肌动蛋白纤维相连粘着带和粘着斑 （一）桥粒和半桥粒（P89）（ desmosome & hemidesmosome） 1、桥粒（desmosome） 桥粒是中间纤维连接相邻细胞的方式。细胞间形成的纽扣状结构，将相邻细胞膜铆接在一起（间隙约30nm）。 分布：承受强拉力的组织中，主要是上皮组织， 如皮肤、口腔、食管、心肌中。 桥粒模式图 30nm 间隙 desmosome2 中间纤维直接与质膜下的盘状致密斑 连接； 相邻两细胞之间的盘状致密斑由跨膜连接糖蛋白相互连接。 2、半桥粒（ hemidesmosome ） 是中间纤维连接细胞外基质的方式，形如半个桥粒。它将上皮细胞固着在基膜上。 半桥粒的功能和组成： 通过整联蛋白将上皮细胞固着在基膜上。 （二）粘着带与粘着斑 1、粘着带（adhesion belt） ： 是肌动蛋白纤维连接细胞的方式。呈连续带状环绕细胞，位于某些细胞紧密连接的下方。 细胞间隙为15 20nm，介于紧密连接和桥粒之间，也称为中间连接或者带状桥粒（belt desmosome）。 粘着带 与粘着带相连的微丝在细胞中形成平行于细胞膜的可收缩的纤维束。 2、粘着斑 是肌动蛋白纤维与细胞外基质之间的连接方式。 参与连接的是整联蛋白。粘着斑 锚定连接（小结） 三、通讯连接（P90）（ communicating junction） 分布：位于具有细胞间通讯作用的细胞。 双重功能：机械连接 电偶联或代谢偶联。 分类：包括 间隙连接（动物） http:/www.ppkao.com资料分享平台 化学突触（可兴奋细胞） 胞间连丝（植物） （一）间隙连接（P90） 1、结构与成分 分布：非常广泛，几乎存在于所有动物组织，连接处有23nm 的缝隙。 间隙连接（图） 连接结构的基本单位连接子（ connexon）， 由 6 个 connexin 环绕而成，中间是直径1.5nm的孔道。 可允许MW1000 的分子通过，但通透性受调节。 2、功能和调节机制 允许小分子（无机盐离子、糖、氨基酸、核苷酸、维生素）通过（MW1000），而蛋白质、核酸和多糖等大分子不能通过。 1）间隙连接在代谢偶联中的作用 合用和互喂营养物质； 代谢偶联允许小分子代谢物和信号分子（如cAMP、 Ca2、磷酸肌醇）通过，一处细胞接受信号分子，就可以使整个组织产生反应。 2）间隙连接在神经冲动传递过程中的作用 突触 电突触（electronic junction） 构成细胞之间的低电阻通路，神经电冲动可以通过间隙连接从突触前向突触后传导，动作电位可以迅速从一个细胞传到另一个细胞，实现细胞间的快速通讯。 3）间隙连接在早期胚胎发育和细胞分化过程中的作用 a. 出现在脊索动物、大多数无脊椎动物胚胎发育的早期； b. 连接子蛋白抗体 可以使胚胎发育出现缺陷； c. 可能为细胞在胚胎中的“位置信息”的传递提供通路，从而影响其分化。 d. 肿瘤细胞之间的间隙连接明显减少或者消失。 （二）胞间连丝（plasmodesmata） 2、胞间连丝的功能 1）与动物细胞的间隙连接类似。允许MW1000、半径约 1mg/ml； （ 2） pH 6.9； （ 3）离子：需要Mg2+， Ca2+除去； （ 4）温度：37装配，0解聚； （ 5） GTP 3、体内微管装配动态(P330) 大多数微管处于动态组装和去组装状态， http:/www.ppkao.com资料分享平台 间期：微管 微管蛋白亚单位 分裂期：微管 纺锤体 细胞中某些微管结构非常稳定，如纤毛、鞭毛； 4、微管组织中心（MTOC） (P330) 微管在生理状态或实验处理解聚后重新装配的地点。 动物的MTOC 是中心体(centrosome)和基体（basal body） （补充） MTOC 的主要功能是帮助微管装配过程中的成核反应，微管从MTOC 开始生长； MTOC 提供了微管的起点和方向性。 基体是鞭毛和纤毛的MTOC； 植物细胞没有MTOC。 中心体动物细胞中主要的微管组织中心，由一对中心粒组成； 基粒位于鞭（纤）毛根部的微管组织中心结构。 中心粒和基粒均为微管性结构，由9 组三联体微管组成，二者同源； 可以自我复制，基粒中含有DNA，可以编码自身蛋白。 （四）微管特异性药物（P331） 秋水仙素（colchicine）生物碱，能与未聚合的微管二聚体结合，阻止成核反应。如果加到微管的两端，可以阻止微管蛋白的装配和解聚。 低浓度阻断细胞于中期； 高浓度所有的微管解聚。 紫杉酚（taxol）、重水（D2O）促进微管的装配和稳定。 （五）微管的功能（P331） 1、维持细胞形态 （ 1）维持细胞不对称形状；如：秋水仙素处理使细胞变圆； （ 2）细胞突起部分的形成和维持，如纤毛、鞭毛、轴突等。 2、细胞内运输作为运输轨道（P331 下） 物质从合成部位 功能部位； 以神经元轴突运输和鱼色素细胞中色素颗粒运输为例。 （ 1）神经元轴突运输 微管可以作为高尔基和其他小泡和颗粒运输的轨道，速度2 微米/秒； 双向性； 2 种引擎蛋白 驱动蛋白（向极运输）、 胞质动力蛋白（向极运输）； （ 2）色素颗粒的运输 通过色素颗粒在色素细胞中的运输改变分布，从而改变体色，适应环境。 3、鞭毛、纤毛运动（P333） 鞭毛（flagellae）和纤毛（cilia）是具有运动功能的细胞表面特化结构； 都具有“9 2”排列的微管束结构。 4、纺锤体和染色体运动（P334） 纺锤体微管的来源：分裂期胞质微管网架崩解，微管蛋白重新组装； 纺锤体微管的组成： 动粒微管连接动粒和两极； 极性微管两极发出，在中部交错； 星体微管构成星体 染色体运动的分子机制： 三、中间纤维（P335）（ intermediate filament， IF） 直径10nm 左右，直径介于微丝和微管之间； IF 是最稳定的细胞骨架成分，主要起支撑作用； IF 在细胞中围绕着细胞核分布，成束成网，并扩展到细胞质膜，与质膜相连结。 http:/www.ppkao.com资料分享平台 （一）成分：分为5 类： 具有组织特异性，不同类型细胞含有不同IF。 通常一种细胞含有一种中间纤维，少数含有2 种以上。 肿瘤细胞转移后仍保留源细胞的IF。 （二）IF 的装配（P339） 两个单体形成超螺旋二聚体（角蛋白为异二聚体） 两个二聚体反向平行组装成四聚体； 四聚体组成原纤维； 4 根原纤维组成中间纤维。 特点： IF 无极性；无动态蛋白库；装配与温度和蛋白浓度无关；无需ATP、 GTP 或结合蛋白的辅助，不受秋水仙素、细胞松弛素B 的干扰。 在细胞分裂过程中也出现解聚和聚合，是磷酸化和去磷酸化的结果。 细胞骨架小结 第十章 第二节 细胞核骨架 概 述 核内基质 核纤层 核孔复合物 本节内容 一、核基质 二、染色体支架 三、核纤层 一、核基质 （一）形态结构和成分 1、形态（P344） 因不同分离方法而异，直径约3 30nm 的纤维蛋白构成的网络。 2、成分（P344） 不同类型、不同阶段的细胞中核基质成分均不同，通常包括： 核骨架蛋白(分离出400 多种) 核骨架结合蛋白 少量RNA 概念：核骨架结合序列（MAR） (P346 下 ) DNA 中约3的序列与核骨架结合，存在于DNA 放射环 和活性转录基因的两端，称为核骨架结合序列（matrin association region， MAR）。 特点：富含AT富含DNA 解旋元件富含反向重 复序列含有转录因子结合位点 功能：将DNA 锚定在核骨架上为调控蛋白提供 结合位点，参与DNA 复制、转录、修复和 重复的调控。 （ 1）核骨架蛋白（P344） 与核骨架结合序列（MAR）结合的蛋白质，又称为MAR 结合蛋白，能稳定DNA 放射环结构，无严格的DNA 序列特异性。 已鉴定的MAR 结合蛋白（P344） DNA 拓扑异构酶（DNA topoisomerase ） 间期 核骨架主要成分 分裂期 染色体骨架的主要成分 核基质蛋白（nuclear matrin） matrin D， E， F， G4 等 组蛋白H1（ histone 1） 核纤层蛋白A， B（ lamin A， B） 支架附着因子A（ scaffold attachment factor A） （ 2）核骨架结合蛋白（P346） 转录因子：具有严格的DNA 序列特异性 酶：组蛋白乙酰化/去乙酰化酶，DNA 聚合酶 和 等； 受体：核内激素受体 供体 http:/www.ppkao.com资料分享平台 （ 3）其他 B23 肌动蛋白 3、核骨架的功能（P347） 核骨架与DNA 复制 DNA 聚合酶结合于核骨架上并被激活，核骨架是DNA 复制的空间支架； DNA 复制起始位点是MAR。 核骨架和基因表达（P348） 具有转录活性的基因都结合在核骨架上； RNA 聚合酶在核骨架上具有结合位点； RNA 的合成是在核骨架上进行的，基因只有结合在核骨架上才能进行转录。 与染色体构建有关（P348） 一般认为核骨架与染色体骨架为同一类物质，30nm的染色质纤维就是结合在核骨架上，形成放射环状的结构，在分裂期进一步包装成光学显微镜下可见的染色体。 二、染色体支架（P349）（ chromosomal scaffold） 染色体中由非组蛋白构成的结构支架。 （一）染色体支架的成分 约 30 种非组蛋白组成，其中SC、SC （ DNA 拓扑异构酶 ） 为主要组分，占 40以上。 （二）染色体支架与核骨架的关系 二者有相同的组分，核骨架的某些结构组分可能在分裂期中转变为染色体支架。 三、核纤层（nuclear lamina）（ P350） （一）形态结构 普遍存在于间期细胞核中，是位于内层核膜下的纤维蛋白片层或纤维网络，分布于内层核膜和染色质之间，厚度约30 100nm，可支持核膜，并与染色质及核骨架相连。 核纤层纤维的直径约10nm， 纵横排列成网络，在分裂期，核纤层解体为蛋白单体形式。 （二）成分（P351） 由核纤层蛋白（lamin protein）构成，同属一个蛋白家族。 A 型核纤层蛋白：核纤层蛋白A、 C B 型核纤层蛋白：核纤层蛋白B 具有中间纤维的所有结构特征（P352） 直径10nm； 耐高盐和非离子去垢剂处理；具有相同的抗原决定簇；结构上密切联系 （三）核纤层在细胞分裂过程中的变化（P353） 分裂前期，核膜崩解，核纤层解聚，A 型核纤层蛋白以可溶性单体形式弥散于胞质中，B 型核纤层蛋白则与核膜小泡保持结合状态； 分裂末期，核膜重现，核纤层在染色体周围重新装配； 核纤层蛋白的磷酸化和去磷酸化可能是核纤层结构动态变化的调节因素。 （四）功能（P354） B 型核纤层蛋白与核膜结合能力最强，修饰结构稳定，在细胞周期中保持与核膜结合； A 型核纤层蛋白与染色质结合能力较强，修饰后结构不稳定，在分裂期以可溶性蛋白形式释放于细胞质中； 细胞核装配的模型（P354）： 核纤层的功能： 1保持核的形态，为核膜和染色质提供支架； 2参与染色质的组装：核纤层在细胞分裂时呈现出周期性的变化，在间期核中，核纤层提供了染色质（异染色质）在核周边锚定的位点。 3.参与细胞核的组装：在前期结束时，核纤层被磷酸化，核膜解体。其中B 型核纤肽与核膜残余小泡结合，A 型溶于胞质中。在分裂末期，核纤肽去磷酸化重新组装，介导了核膜的重建。 第十一章 细胞增殖及其调控 细胞增殖是生命的基本特征，种族繁衍、个体发育、机体修复等都离不开细胞增殖。 http:/www.ppkao.com资料分享平台 初生婴儿有1012 个细胞，成人1014 个，约200 种类型； 成人体内每秒钟有数百万新细胞产生，以补偿衰老和死亡的细胞； 1 个大肠杆菌若按20 分钟分裂一次的速度保持下去，则两天即可超过地球的重量。 研究细胞周期的意义： 1、理论意义：认识细胞生长和细胞增殖规律； 2、肿瘤治疗: 通过任何方法将细胞周期停滞在任何一点,即可抑制或杀死肿瘤细胞； 3、普通疾病和遗传疾病治疗: 针对已知病因进行特殊治疗,即可达到治疗疾病的目的 本章内容 第一节 细胞周期与细胞分裂第二节 细胞周期的调控 第一节 细胞周期与细胞分裂 一、细胞周期（cell cycle）（一）概述 1、定义：通过细胞分裂产生的新细胞生长开始，到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程。 2、细胞周期的划分：G1 期、S 期、G2 期、M 期 G1 期：决定了细胞周期时间长短； S 期 G2 期 总时间相对恒定 M 期 3、细胞增殖行为的分类： 周期性细胞（cycling cell）：细胞持续分裂，如上皮组织的基底层细胞； 静止期细胞（quiescent cell）： 又称G0 期细胞。细胞暂时停止分裂，执行一定的生理功能，多发生于G1 期 。如结缔组织中的成纤维细胞。 终末分化细胞：终生不再分裂。 （二）细胞周期中各个不同时期及其主要事件 1、 G1 期 （ 1）起始：子细胞生成标志其开始，是一个细胞周期的第一阶段。 （ 2）事件： 开始合成细胞生长所需要的各种蛋白质、糖类、脂质等，但不合成DNA； 限制点（检验点、检测点； 酵母中称“起始点”） 定义： G1 晚期中的一个基本事件，迈向S 期的条件 影响限制点的因素： a、外在因素：营养供给、相关激素刺激； b、内在因素：细胞分裂周期基因（cdc 基因） 产物的调控。 2、 S 期DNA 合成期 （ 1）起始：开始合成DNA （ 2）事件： DNA 半保留复制； 组蛋白合成； 新合成的DNA 立即与组蛋白结合； 受到多种细胞周期调节因素的调控。 3、 G2 期 （ 1）起始： DNA 复制完成后； （ 2）事件： DNA、结构物质和亚细胞结构完成必要准备； G2 检测点检测DNA 复制情况、细胞体积、环境因素等。 4、 M 期细胞分裂期 形式：有丝分裂体细胞 减数分裂生殖细胞 结果：遗传物质平均分配到两个子细胞中去。 （三）细胞周期研究方法 1、细胞周期测定 （ 1）脉冲标记DNA 复制测定法 http:/www.ppkao.com资料分享平台 （ 2）流式细胞分选仪测定法 流式细胞仪的工作原理 利用流式细胞分选仪测定细胞周期 2、细胞周期同步化 细胞同步化(synchronization)是指在自然发生的、或经人为处理，使细胞群体的细胞周期一致。 （ 1）自然同步化 多核体：如：粘菌、疟原虫。 某些水生动物的受精卵：如海胆、海参、两栖类。 增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。 （ 2）人工同步化 人为地将处于不同时期的细胞分离开来。振荡密度梯度离心药物诱导： DNA合成阻断法 分裂中期阻断法 条件依赖性突变株 a、 DNA 合成阻断法 药物：TdR(胸腺嘧啶脱氧核苷)和羟基脲（HU） 原理：无/低毒DNA 合成抑制剂，加入、洗脱两次，可以使细胞在G1/S 交界处同步； 优点：同步化效率高，几乎适合所有体外培养的细胞系。 b、分裂中期阻断法 药物：秋水仙素、秋水仙胺、nocodazole 原理：微管合成抑制剂，将细胞阻断在分裂中期； 优点：操作简便，效率高， 缺点：毒性大 c、条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用 转移到限制条件下培养，细胞被同步化在某一特定时期。 （四）特异的细胞周期 1、早期胚胎细胞的细胞周期 存在阶段：受精卵卵裂过程 特点：卵裂球体积不变，细胞数目增加； 卵裂时间大大短于体细胞周期时间； G1 和 G2 期非常短； 细胞周期调控因子和调节机制与体细 胞基本一致。 2、植物细胞的细胞周期 同样含有G1、 S、 G2 和 M 四个时期； 不含有中心体； 以中间板进行胞质分裂。 3、酵母细胞的细胞周期 4、细菌的细胞周期 二、有丝分裂（以动物细胞为例） （一）有丝分裂过程 G1 间期 S G2 细胞周期 前期 中期 M 期 后期 末期 胞质分裂期 胞质分裂（cytokinisis） 主要事件：赤道板附近细胞表面下陷，形成环形的分裂沟（furrow）。分裂沟逐渐加深， http:/www.ppkao.com资料分享平台 直到两个子细胞完全分开。 （二）与有丝分裂有关的亚细胞结构 1、中心体 2、动粒与着丝粒 3、纺锤体（spindle） 1、中心体 间期细胞一般包含一个中心体，由一对中心粒组成； 中心体在G1 末开始复制，S 期复制完成，但不分离，G2 期，两个中心体开始分离，移向细胞的两极，并参与纺锤体形成。 2、动粒和着丝粒 3、纺锤体 由微管和微管结合蛋白组成，状如纺锤； 包括动粒微管、极性微管和星体微管； 中心体的分离：KRPs 和细胞质动力蛋白共同作用的结果。 (三 )染色体运动的动力机制 1、染色体列队（chromosome alignment） 染色体向赤道板运动的过程 微管和动粒的结合 在前期，Mad 蛋白和Bub 蛋白位于染色体的动粒上，促使动粒敏化并与微管接触。微管一旦结合动粒，两种蛋白随即消失。 未与微管结合的动粒会产生抑制信号，阻止下一阶段的出现。 染色体在赤道板上排列： 牵拉（pull）假说和外推（push）假说： 2、染色体分离 染色单体分离并向细胞两极运动的机制 后期A 和后期B 阶段假说： 后期A ： 动粒微管的动粒端解聚造成微管变短； 染色单体逐渐拉向两极； 后期B，移动素类蛋白（KRPs）与极性微管重叠区结合并“搭桥”，通过向微管正极行走，促使极性微管相互滑动，两极之间距离变长。 胞质动力蛋白（dynein）在星体微管和细胞膜之间搭桥，并向星体微管负极移动，进一步将两极之间的距离拉长。 三、减数分裂（meiosis） 385 概述： 定义：特殊形式的有丝分裂，发生于有性生殖细胞形成过程中。 DNA 复制一次，而细胞进行两次分裂，最终产生染色体组数目减半的配子。 两次分裂称为减数分裂和减数分裂； 基本特点：染色体组数目减半；发生遗传重组 （一）减数分裂前间期 386（ premeiotic interphase） 特点： 可以划分为G1、 S、 G2 期； S 期持续时间长，DNA 仅复制总量的99.7%99.9%； L 蛋白的阻止作用； 细胞核大于体细胞核，染色质多凝集成异染色质； 不同物种中G2 期长短不一。 （二）减数分裂过程 前期 中期 后期 末期 胞质分裂期 http:/www.ppkao.com资料分享平台 间期无DNA 的合成 前期 中期 后期 末期 胞质分裂期 1、减数分裂期（meiosis ） （ 1）前期（prophase ） 主要事件：染色体配对和基因重组； 特 点：持续事件长，可达数周/月 /年； 阶段划分： 细线期 偶线期 粗线期 双线期 终变期 细线期（leptoenen） 387 前期的开始阶段，染色体凝集，但两条染色体臂不分离，呈单细线状； 细线状染色体上出现颗粒状结构染色粒（chromomere）； 端粒通过接触斑与核膜相连（有的物种中染色体状如花束）花束期。 偶线期（zygotene）（配对期）388 联会（synapsis）：同源染色体配对（pairing），形成二价体（bivalent）； 联会起始于端粒接触斑（或者几个点），并向其他部位延伸，形成联会复合体（ synaptonemal complex）； 合成细线期未合成的约0.3%的 DNAzygDNA；此外，zygDNA 转录生成zygRNA，与配对有关。 粗线期（pachytene） 389 起始于联会完成后； 染色体进一步浓缩，与核膜保持接触； 该时期可持续几天到几个星期； 同源染色体间发生等位基因之间部分DNA 片段的交换和重组，产生新的等位基因的组合； 同源染色体间出现蛋白质结构重组结； 合成一部分DNAP DNA，编码一些与DNA 点切和修复有关的酶。 合成减数分裂专有的组蛋白，部分/全部置换体细胞类型的组蛋白。 卵母细胞中，还发生rRNA 的转录依旧能见到核仁； FISH resolution 双线期（diplotene） 389 下 重组结束，同源染色体开始分离，仅通过交叉（crossover）相互联系； 染色体发生不同程度的去凝集，有的物种中形成巨大的灯刷染色体，进行活跃的转录； 双线期在不同物种中持续时间长短不一（数月数十年） 终变期（diakinesis） 390 染色体重新凝集，形成短棒状； 交叉部位移向臂的端部端化（terminalization）； 终变期的结束标志着前期的完成。 （三）减数分裂过程的特殊结构及其变化 392 1、性染色体的分离 性染色体组成类型： 简单类型： XY 型（XX，XY） XO 型（XX，XO） ZW 型（ZW，ZZ） http:/www.ppkao.com资料分享平台 复杂类型：XY1Y2 型（XX, XY1Y2) X1X2Y 型（X1X2X1X2，X1X2Y ） 性染色体的配对和分离： XX 染色体的配对、分离与常染色体相同； XY 染色体：在中期也会排列在赤道板上，随后分别移向细胞的两极； XO 染色体：在第一次减数分裂，X 移向一极，结果产生1 个含有X 的细胞和1 个不含X 的细胞； 2、联会复合体和基因重组 联会复合体（synaptonemal complex， SC）的结构 由中央成分（central element）、侧成分（lateral element）和配对的染色体组成； 联会复合体的成分 中央成分、侧成分、横向纤维均由蛋白质组成； DNA 片段（50 550bp），挂/包含于侧成分中，无序列特异性，可能进入中央成分并发生重组。 第十一章 第二节 细胞周期的调控 一、细胞促成熟因子（MPF）（ P395） MPF（ maturation-promoting factor） 促成熟因子 细胞促分裂因子(mitosis-promoting factor) 期促进因子(M phase-promoting factor) 染色体超前凝集现象（premature chromosome condensation， PCC）M 期细胞与间期细胞的融合实验，导致染色体不同程度的凝集。 G1 期细胞与M 期细胞融合 G1 期 PCC 呈细单线状 S 期细胞与M 期细胞融合 S 期 PCC 呈粉末状 G2 期细胞与M 期细胞融合 G2 期 PCC 呈双线染色体状(P396 下 ) 1988 年，从蛙中实验分离MPF，并证明主要成分为p32 和 p45 两种蛋白，二者相互结合后，表现出蛋白激酶活性，可以使多种蛋白质底物磷酸化。 二、p34cdc2 激酶（P397） 1、 cdc 基因（cell division cycle gene）的发现 L.Hartwell， P. Nurse 利用酵母温度敏感突变株 2、 cdc 基因的表达产物 p34cdc2 ，本身不具有蛋白激酶活性，当与p56cdc13 结合后，可以使得多种蛋白底物磷酸化，又称p34cdc2 激酶； 3、 p34cdc2 与 MPF 的关系（P398） 免疫实验和序列分析证明： p34cdc2 与 p32 为同源蛋白 4、细胞周期蛋白（cyclin）与MPF（ P398） 1983 年，Tim Hunt 在海胆中发现两种细胞周期蛋白（cyclin A， B），广泛分布于各种真核生物中，含量随细胞周期而变化，间期积累，分裂期消失。 序列分析表明，周期蛋白B 与 p45 是同源物。 MPF 由 2 个亚单位： Cdc2 蛋白（催化亚单位）和周期蛋白B（调节亚单位）组成，二者结合具有蛋白激酶活性。 三、周期蛋白（cyclin）（ P399） 1、分类：发现众多周期蛋白，表达时期不同，功能多样： G1 期周期蛋白：只在G1 期表达，调节G1/S，存在时间较短； M 期周期蛋白：间期表达和积累，调节M，存在时间较长。 http:/www.ppkao.com资料分享平台 2、周期蛋白分子结构 （ 1）均含有一段保守的氨基酸序列周期蛋白框（cyclin box） ,约 100 氨基酸残基，介导周期蛋白和周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK 激酶）结合； （ 2） M 期周期蛋白分子近N 端含有一段由9 个氨基酸残基组成的破坏框（destruction box） RXXLGXIXN 参与由泛素介导的周期蛋白的降解。 （ 3）G1 期周期蛋白分子不含破坏框，但 C 端含有PEST 序列，与该类蛋白的更新有关。 3、 cyclin 在细胞周期中的变化（P400） 不同的周期蛋白在细胞周期中表达的时期不同，且与不同的CDK 结合，调节不同的CDK 激酶活性。 四、CDK 激酶 (p401) 1、定义 CDK 激酶（cyclin dependent kinase） 细胞中的该类蛋白与周期蛋白结合（作为调节亚单位），表现出蛋白激酶活性； 不同的CDK 激酶结合不同的周期蛋白，执行不同的调节功能。 2、 CDK 激酶分子结构（P401 下） 具有类似的CDK 激酶结构域（ CDK kinase domain），该域中的PSTAIRE 序列非常保守，可结合周期蛋白；存在被磷酸化修饰的位点，对酶活性起到调节作用。 五、细胞周期运转调控（P402 下） CDK 激酶对细胞周期起核心调控作用； 不同的CDK激酶在细胞的不同时期表现出活性，从而对细胞周期的不同时期进行调节。 （一）G2/M 期转化和CDK1 激酶的调节（P403） 1、 CDK1 激酶的周期性 MPF CDK1 or p34cdc2周期蛋白B p34cdc2含量稳定； 周期蛋白B含量周期性变化； CDK1 激酶活性依赖于周期蛋白B 的积累 2、 CDK1 激酶的功能（P403） 催化某些蛋白质特异位点的丝氨酸/苏氨酸残基，改变其结构和启动其功能，实现调控细胞周期的目的。 如： 组蛋白H1 磷酸化促进染色体凝集 核纤层蛋白磷酸化促使核纤层解聚 核仁蛋白磷酸化促使核仁解体 3、 CDK 激酶活性的调节因素（P404） 周期蛋白和CDK 激酶的结合（先决条件） wee1/mik1 激酶和CDK1-activiting kinase 催化CDK 的 Thr14、 Tyr15 和 Thr161 磷酸化 磷酸酶Cdc25 催化Thr14、 Tyr15 去磷酸化，才表现出激酶活性 （二）M 期周期蛋白与分裂中期向分裂后期转化（P404 下） 分裂中期，M 期周期蛋白A 和 B 迅速降解，CDK1 激酶活性丧失。被CDK1 激酶磷酸化的蛋白质去磷酸化，细胞从M 期向后期转化。 周期蛋白和的降解依赖于泛素化途径，分子结构中的破坏框起到重要调节作用 后期促进因子（APC）（ P406） 组分在分裂间期中表达，但只在M 期才表现出活性，可能受到CDK 激酶活性的调节。 APC 活性受到Cdc20 的正调控和纺锤体装配检验点的检控。 （三）G1/S 期转化与CDK 激酶（P407） G1 期周期蛋白包括D、 E、 (A) CDK 激酶包括CDK2、 CDK4 和 CDK6 周期蛋白D 为细胞G1/S 转化所必需； http:/www.ppkao.com资料分享平台 E CDK2 复合物为S 期启动必需；异常则导致细胞停滞于G1 期； 在 S 期，A CDK2 与 DNA 复制有关； 在 S 期，G1 期周期蛋白通过泛素化途径降解（PEST 序列） DNA 复制起始点的识别（P408） 复制起始点识别复合体（origin recognition complex， Orc），可以识别DNA 复制起点并与之结合，是DNA 复制必需条件。 Cdc6 和 Cdc45 也是DNA 必需调控因子。 “为什么有丝分裂中DNA 只能复制一次？” DNA 复制执照因子学说 细胞质中的Mcm 蛋白（minichromosome maintenance protein）等因子，在M 期核膜破裂时，与染色质结合，使之获得DNA 复制必需的执照； 进入S 期后，随着DNA 复制，“执照”信号不断消失，在G2 期，细胞核不再含有该信号，DNA 复制结束并不再起始。只能等到下一个M 期才能重新获得“执照”。 11 39 （四）DNA 复制延搁检验点（P410） DNA 复制不完成，细胞不能向M 期转化； S 期，Cdc25c 活性低，不能激活CDK1， Wee1 活性较高，抑制CDK1 的活性 DNA 复制未完成与Cdc25c、 Wee1 关系？ 六、其他因素对细胞周期的调控（p410） 1、原癌基因和抑癌基因 均是细胞生命活动所必需的基因，产物对细胞增殖和分化起着重要的调控作用； 原癌基因非正常表达，可导致细胞转化，增殖过程异常，甚至癌变； 抑癌基因表达产物对细胞增殖起负性调节作用。 2、外界因素： 辐射、化学物质、病毒、温度、pH 变化等。 第十二章 细胞分化 本章内容 第一节 细胞分化 第二节 癌 细 胞 第一节 细 胞 分 化 （ cell differentiation） 一、细胞分化的基本概念 1、概念 415 细胞分化（cell differentiation） 在个体发育中，由一种相同的细胞类型经过细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同的细胞类群的过程。 2、细胞分化的特点： 细胞分化是一种单向的、相对稳定和持久的过程, 但是在一定的条件下, 细胞分化又是可逆的； 分化的方向和程序是预先确定的，细胞生理状态随分化程度而改变； 个体中所有不同种类的细胞的遗传背景完全一样，分化细胞彼此之间在形态、结构、功能方面的不同是由于其拥有不同的蛋白质所致。 （一）细胞分化是基因选择性表达的结果 415 细胞分化不是遗传物质选择性丢失的结果，分化细胞仍具有完整的DNA； 细胞分化是由于基因选择性表达各自特有的专一性蛋白质，导致细胞形态、结构和功能的差异。 （二）管家基因与奢侈基因 415 管家基因（house-keeping genes） http:/www.ppkao.com资料分享平台 所有细胞中均要表达的基因，产物是维持细胞基本生命活动所必需的。 奢侈基因（luxury genes） 又称组织特异性基因（ tissue-specific genes）； 在不同细胞类型进行特异性表达的基因，其产物赋予各种类型细胞特异的形态结构特征和特异的生理功能。 细胞分化的本质奢侈基因在时间、空间上的差异表达； 其调控过程涉及到： 基因转录水平、转录后加工水平 DNA、染色体水平 翻译和翻译后加工和修饰水平 （三）组合调控引发奢侈基因的表达 组合调控（combinational control） 多种调控蛋白共同调控完成细胞分化。 往往一两种关键调控蛋白可以启动整个细胞分化的过程。 Ey（果蝇）转入到发育成腿的细胞中表达，最终诱导腿中部形成眼。 （四）转分化和再生 417 1、转分化（transdifferentiation） 一种类型的分化细胞转变成另一种类型分化细胞的现象。 2、转分化过程 去分化/脱分化（dedifferentiation） 再分化（redifferentiation） 去分化/脱分化： 细胞失去特有的结构和功能，变成具有未分化细胞特征的过程。 3、再生（regeneration） 418 定义：生物体缺失一部分后发生重建的过程。 如：蚂蟥、蚯蚓切断；海参吐出内脏；壁虎断尾；幼体蟾蜍肢体切除再生、沃尔夫晶体再生 特点：再生能力存在差异 植物比动物强； 低等动物比高度动物强； 二、影响细胞分化的因素 418 （一）细胞的全能性 1、全能性（totipotency） 细胞经过分裂和分化后仍具有产生完整有机体的潜能和特性。 受精卵、早期胚胎细胞、植物细胞具有全能性 随着分化，高等动物细胞逐渐丧失了发育成个体的能力。 蟾蜍的核移植实验（1952） 英国Roslin 研究所的Wilmut 于 1997 年 2 月 27 日在 Nature 上宣布用乳腺细胞的细胞核克隆出一只绵羊“ 多莉 ” (Dolly) 。“多莉”的诞生，既说明了体细胞核的遗传全能性，也翻开了人类以体细胞核竞相克隆哺乳动物的新篇章。此项技术荣登美国Science周刊评出的1997 年十大科学发现的榜首。 动物克隆成功的意义： 1、证实哺乳动物成体的特化细胞的细胞核仍具有发育全能性； 2、证实哺乳动物成体的特化细胞可以人为诱导彻底的去分化和再分化； 3、动物克隆并不是完全的“复制”； 动物克隆带来的问题： 1、克隆的技术障碍： 克隆动物的早衰现象； 克隆的高失败率：卵子流产、胎 儿过大、胎儿畸形衰竭、胎盘异常 http:/www.ppkao.com资料分享平台 2、克隆带来的问题： 克隆人实验中胚胎的人权？ 克隆人残疾？ 社会伦理问题克隆人的权利？ 人类的尊严？人群关系改变？ 宗教信仰冲突？ 自然规律的破坏？ 2、干细胞（stem cell） 419 干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类型的高度分化的子代细胞。 功能：控制和维持细胞的再生。 干细胞生命科学的新前沿 1999 年，science 将干细胞研究评为当年的十大科学进展！ 干细胞的特征： 非终末分化细胞，保持未分化或者低分化特征； 在机体的数目和位置相对恒定； 具有自我更新能力； 能无限地分裂和增殖； 具有多向分化潜能； 分裂慢周期性； 两种生长方式对称和非对称分裂。 干细胞的分类 干细胞发育阶段 干细胞发育潜能 胚胎干细胞（embryonic stem cell， ES） 定义：存在于着床前早期胚胎中的具有全能性的细胞，能在体外培养、传代，在一定条件下能够保持未分化二倍体状态及全能性。 特点：a、具有发育全能性，理论上可以诱导分化为机体中所有类型的细胞； b、可以在体外大量扩增、筛选、冻存和复苏而不丧失原有特性。 1998 年，Thomson 建立了人胚胎干细胞系（hES），为干细胞研究开启了新篇章。 胚胎干细胞的应用： 作为生产克隆动物的高效材料； 生产转基因动物的高效材料； 发育生物学研究的理想体外模型； 加快组织工程发展。 胚胎干细胞能分化成200 多种细胞，在临床上面临的两个难题：定向分化和致瘤性； 治疗性克隆面临的伦理道德问题。 造血干细胞 定义：指存在于造血组织内的一类能分化发育成各种血细胞的原始细胞。 分布：胎儿出生前，造血干细胞在胚胎肝脏中含量较多；出生后，主要存在于红骨髓内，在脾、淋巴组织和外周血中也有极少量分布。 造血干细胞的特点： a、多向分化： 能分化成至少八种髓系和淋巴系的血液细胞； b、自我更新： 造血干细胞具有高度自我更新和自我维持的能力，这是由于干细胞只进行不对称有丝分裂引起的。通过不断的复制维持永久的造血干细胞库。 c、 99.5的造血干细胞处于G0 期，在获得加强造血信息后，立即从G0 期转入G1 期，进入细胞周期，分裂增殖，直到造血信息停止。 d、分类：胎肝造血干细胞；骨髓造血干细胞； 外周血造血干细胞；脐血造血干细胞 http:/www.ppkao.com资料分享平台 造血干细胞的移植 骨髓移植（BMT） 外周血造血干细胞移植 脐血造血干细胞移植 年，等实施了世界上第例脐血干细胞 移植并获得成功. 主要局限于小孩或体重较轻的年轻人 临床应用的瓶颈： 造血干细胞的体外扩增 造血干细胞的转分化 2001 年， Cell 杂志报道，单个造血干细胞除重建了小鼠造血系统，还分化成肝、皮肤、肺组织。 神经干细胞： 定义：指存在于神经系统内的一类能分化发育成各种神经细胞的原始细胞。 特点：属多能干细胞，具有多种分化潜能，具有连续增殖能力。 神经干细胞的应用 神经干细胞分化为多巴胺神经元治疗帕金森氏症 神经干细胞的应用 红色区域为摄取多巴胺神经元分布的区域。 移植多巴胺神经元后病人症状明显改善 其他干细胞 胰腺干细胞 肝脏干细胞 肌肉干细胞 （二）影响细胞分化的因素 419 1、胞外信号分子对细胞分化的影响 胚胎诱导（近端组织的相互作用） 420 早期胚胎发育过程中，一部分细胞会影响周围细胞使其向一定的方向分化。 如： 眼的发生：视泡晶状体角膜 机理：细胞生长分化因子（旁泌素）通过旁分泌途径影响周围细胞 激素调节 远距离细胞间作用，出现在发育的晚期,激素引起的反应是按预先决定的分化程序进行的 ,其作用主要是引起靶细胞进行分化。 例如,激素和某些细胞因子对哺乳动物性别分化的调节 2、受精卵细胞质的不均一性 P421 卵母细胞中贮存的 mRNA 和蛋白质的分布是不均匀的,各种 mRNA 在细胞中都有定位分布,并随卵裂进入不同的子细胞中。 卵细胞质分布的不对称性 3、细胞间的位置效应 4、细胞记忆与决定 5、环境对性别决定的影响 6、染色质的变化与基因重排 第十二章 第二节 癌细胞 肿瘤（tumor）在致瘤因素作用下，细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致异常增生，形成肿块。 ? 良性肿瘤：生长缓慢，与周围组织边界明显。 ? 恶性肿瘤：癌症(cancer)，生长快、具有迁移性。 http:/www.ppkao.com资料分享平台 ? 据 2001 年卫生事业发展情况统计公报，恶性肿瘤为城市地区居民死因第一位。 ? 肿瘤组织由实质和间质两部分构成，实质是肿瘤细胞，间质由结缔组织和血管组成。 癌的类群 1、癌组织的外表面和内表面生长的癌 如肺癌、乳腺癌、结肠癌 2、瘤中胚层形成的组织中形成的癌 如骨、软骨、脂肪、结缔组织、肌组织 3、淋巴瘤和白血病淋巴和血液里面产生的癌。白血病主要是幼稚血细胞大量增殖并侵犯正常组织。 一、癌细胞的基本特征 1、细胞生长和分裂失去控制 不产生凋亡反应，细胞永生，核质比例增大（1： 1），分裂快速； 2、具有侵润性和扩散性 细胞间粘着性下降，侵润周围健康组织，或者通过血液和淋巴循环在其他部位粘着和增殖。 3、染色体异常 癌细胞染色体常常出现染色体的缺失和增加，即非整倍性（ aneuploidy）， 并且不会因此而进入凋亡。 4、细胞骨架的变化 癌细胞的细胞骨架少且杂乱 5、自分泌激活 能够分泌刺激自身增殖的生长因子促进自身分裂，培养中往往可以无血清生长。 6、细胞间作用改变 水解基底膜成分，间隙连接消失，异常表达膜受体蛋白，粘着别处细胞，逃避免疫监督 7、蛋白表达谱系或蛋白活性改变 往往出现胚胎细胞中表达的蛋白，具有较高的端粒酶活性，某些恶性增殖、扩散相关的蛋白。 8、 mRNA 转录谱系的改变 不同种类的癌细胞， mRNA 转录谱系存在差异 存在广泛的异质性 9、培养特征的改变 永生、可以悬浮培养、失去接触抑制，分裂期细胞增多。 二、癌基因与抑癌基因 （一）原癌基因和癌基因 1、原癌基因（proto-oncogene）的发现 在劳氏肉瘤病毒中发现一个Src 基因，可以导致被感染的鸡体内产生肿瘤。 在鸡体细胞基因组内也发现一个与病毒Src 同源性很高的基因片段，不具有致癌能力，称为细胞癌基因（cellular oncogene）或者原癌基因（proto-ongogene）。 随着多种病毒癌基因（ v-oncogene） 的发现，在真核细胞中陆续发现100 多种原癌基因。 2、原癌基因的定义： proto-oncogene A normal cellular gene that encodes a protein usually in involved in regulation of cell growth or differentiation and that can be mutated into a cancer-promoting oncogene, either by changing the protein-coding segment or by altering its expression. from Molecular Cell Biology （ 5th Edition） 2、癌基因（oncogene） A gene whose product is involved either in thansforming cells in culture or in inducing cancer in animals. Most oncogenes are mutant forms of normal genes (proto-oncogenes) that encode proteins involved in the control of cell growth or division. from Molecular Cell Biology （ 5th Edition） http:/www.ppkao.com资料分享平台 3、原癌基因向癌基因的转化 原癌基因的激活 点突变激活原癌基因的编码区发生突变，从而使产物的性质和活性发生变化； 强启动子插入激活改变了结构基因表达方式和表达的量； 染色体易位和重排使本不在一起的基因序列同原癌基因串连，可能合成新的蛋白质或者融合蛋白，改变了基因的自然活性； 原癌基因扩增拷贝数大量增加，转录水平大大提高。 （二）抑癌基因 正常细胞增殖过程中的负调控因子，它编码的蛋白质抑制细胞生长和阻止细胞癌变。如果突变，细胞由于丧失增殖的负调控而过度增殖。 癌基因是细胞分裂、肿瘤发生的“加速器”油门 抑癌基因是细胞生长和恶化的“制动器” 刹车 p53 基因是是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。该基因编码一种分子质量为53kDa 的磷酸化蛋白质，命名为P53。 p53 基因基因组的卫士 p53 蛋白相对分子量53X103 的多肽； 缺失导致Li Fraumeni 综合征； p53 基因的消除是许多肿瘤细胞转向完全恶化过程中一个重要步骤； p53 基因的功能： 激活一些分裂相关基因如p21； 指导遗传损伤的细胞进入凋亡； p53 基因和癌症放射化学治疗中的作用。 三、肿瘤的发生 （一）物理化学致癌物 1、化学致癌物 辐射对癌的诱发 包括来自太阳的紫外线、外层空间的宇宙射线、自然发生的放射性元素的放射线、医疗军事和实验中的高能辐射（如X 光） 。 （二）肿瘤发生遗传学 1、体细胞突变学说 致癌因子引起体细胞基因突变，使正常体细胞转化为前癌细胞，然后在一些促癌因素作用下，发展成癌细胞。该学说认为肿瘤起源于一个突变细胞（单克隆性），是突变细胞的单克隆增殖细胞群。 原发型肿瘤细胞内相同的染色体畸变、遗传标记和同工酶支持该学说。 过于简单，只注重外界致癌因素，忽略了细胞内部的遗传因素，无法解释遗传性肿瘤。 2、二次突变学说 认为肿瘤需要两次或者两次以上的突变才能发生。 遗传型的肿瘤，第一次突变发生在生殖细胞或者父母遗传而来，该个体的所有体细胞实质上都是潜在的前癌细胞，任何体细胞如果再发生第二次突变，就会转化为癌细胞。因而具有家族性、多发性、双侧性、早发性特点。 非遗传型肿瘤是由于第一次突变发生在成体的某个体细胞中，这个体细胞增殖的细胞克隆为前癌细胞，如果在这个细胞或者克隆再发生第二次突变，则可能形成肿瘤。因此具有发病迟、散发、单发、单侧性特点。 具有较广的临床证实，但是仍然忽视了遗传因素的作用。 3、癌基因学说 多步致癌假说（多次打击学说） 细胞癌变往往需要多个癌基因的协同作用，要经过多阶段的演变，不同阶段涉及不同癌基因的激活。换句话说，不同癌基因的激活在时间和空间上进行一定的配合，共同表达才能形成癌细胞表型。 http:/www.ppkao.com资料分享平台 第十三章 细胞衰老与凋亡 本章内容 第一节 细胞衰老 第二节 细胞凋亡 第一节 细胞衰老 cellular aging/cell senescence 一、Hayflick 界限（Hayflick limitation） 某种细胞在体外培养条件下所能进行分裂次数的极限。 该极限同该动物平均寿命相关； 该极限同细胞提供个体年龄相关； HeLa 等无限细胞系其染色体组型和遗传特性发生了本质性的改变，因而不受该极限规律的支配。 二、细胞在体内的衰老 细胞的衰老和死亡是常见现象，即使在个体发育的早期也会发生； 个体发育过程中，均有不同组织细胞在特定发育阶段呈现衰亡现象； 神经元细胞、肌肉细胞逐渐衰亡 可分裂细胞分裂周期延长（环境引起） 三、细胞衰老的特征 形态变化：核增大；染色质固化；内质网弥散、总量减少；线粒体数量减少、体积增大；致密体积累；膜弹性减低。 代谢功能：水分减少，酶含量和活性降低，核酸和蛋白合成减少，细胞呼吸减弱。 端粒减少到临界值，细胞则脱离细胞周期。 四、细胞衰老的机制 1、大分子合成错误成灾假说 酶 核酸合成循环中微小错误的积累引发连锁性错误，最终导致细胞代谢功能降低、衰老因子和有害废物积累，引起衰老和死亡。 2、自由基学说 代谢过程中产生的活性氧基团或者分子（ ROS） 引发的氧化性损伤（如膜是损伤、蛋白质的变性、DNA 复制的错误等）的积累，最终导致衰老。 3、端粒假说 高度分化的体细胞的端粒酶处于抑制状态，随着细胞分裂次数的增加，端粒不断缩短，当缩短到一定阈值时，引发hayflick 界限，细胞不再分裂。 少数细胞（如生殖细胞和癌细胞）的端粒酶保持较高活性，因而端粒很稳定，细胞不会衰老。 第二节 细胞凋亡（apoptosis） 一、细胞凋亡的概念和意义 又称为细胞编程性死亡（programmed cell death， PCD），是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序性的死亡，涉及一系列基因的激活、表达以及调控，具有生理性和选择性。 意义：维持多细胞生物个体发育的正常进行、保持稳定平衡、抵御外界因素的干扰具有重要作用。 二、细胞凋亡的特征 1、细胞坏死和程序性死亡的区别 2、细胞凋亡的生化特征 1、 180 200 梯状DNA 电泳条带（ladders）