Western blot 实验技术曹曹 红红2012.11.15Westernblot实验技术优秀定义：定义：n印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。n1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。n而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法。Westernblot实验技术优秀Western blot 原理原理nWestern Blot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质混合物，经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗体起反应，经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。n由于Western blot检测技术具有简便，快捷等特点，所以目前该技术也被广泛应用于蛋白质表达水平的检测。Westernblot实验技术优秀Western Blot 信号放大基本原理信号放大基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。Westernblot实验技术优秀Western Blot一般流程一般流程底片扫描、分析底物显色二抗孵育一抗孵育封闭转膜SDS-PAGE电泳蛋白样品的制备Westernblot实验技术优秀n培养细胞培养细胞：洗掉培养基，PBS洗23次，加入裂解液，用细胞刮刀将贴壁细胞刮下，超声波匀浆器匀浆，冰上静置30分钟，4度，12000转，离心15分钟，收集上清.n组织样品组织样品：快速取材、液氮速冻、按每80毫克组织加1毫升的比例加入裂解液,超声波匀浆器匀浆，静置60分钟，4度，12000转，离心15分钟，收集上清.n样品保存：避免反复冻融样品，EP管分装-20度保存，不要超过2周，最长不要超过1个月；-80度（或-70度）保存，一般不超过半年，最多1年。n裂解液：裂解液： Tris-HCl, EDTA, NP40 ， CHAPS, PMSF ， protein inhibitor ,（磷酸酶抑制剂：氟化钠、钒酸钠）蛋白样品的制备蛋白样品的制备Westernblot实验技术优秀BCA（bicinchoninic acid, 二辛可酸）法测定蛋白浓度二辛可酸）法测定蛋白浓度n原理：在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm除有高地光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。n浓度检测范围：10-2000ug/mln步骤：(1)标准品与待测样品稀释(至检测范围）；(2)与等体积WR工作液混合；(3)37度反应2hr；(4)测定562nm处光密度(OD)值;(4)绘制标准曲线并计算蛋白浓度Westernblot实验技术优秀SDS-PAGE（polyacrylamide gel electrophoresis, 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应.SDS （十二烷基硫酸钠）是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例的SDS后後,由于SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量的蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。Westernblot实验技术优秀M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的Tris缓冲液（积层胶：PH=6.8；分离胶：PH=8.8）MTEMED（四甲基己二酸），加速剂，催化APS产生自由基M过硫酸铵(现配现用)：产生自由基，并引发丙烯酰胺单体聚合MTris-甘氨酸电泳缓冲液（PH=8.3）凝胶成份凝胶成份Westernblot实验技术优秀nSDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。n不连续体系由电极缓冲液、凝胶（积层胶和分离胶）所组成。积层胶是由APS催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.8的Tris-HCl。分离胶是由APS催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.8Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。n2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，因而其分离条带清晰度及分辨率均较好。Westernblot实验技术优秀凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212Westernblot实验技术优秀制备样品制备样品n样品缓冲液：1）SDS：断裂分子内和分子间的氢键，取消蛋白质分子内的疏水作用，使分子去折叠，破换蛋白分子的二、三级结构；去除蛋白质电荷。2）强还原剂：如beta巯基乙醇或DTT（二硫苏糖醇），能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂3）溴酚蓝：指示剂n步骤：混匀、沸水煮5min，4度离心，置冰上备用。n注意：处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1-3分钟，以消除亚稳态聚合。Westernblot实验技术优秀蛋白蛋白markerNEB蛋白marker Bio-rad彩虹markerWesternblot实验技术优秀凝胶染色凝胶染色n标准考马斯亮蓝染色法（1）电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于50%甲醇和10%乙酸中)；（2）室温下振摇温育至过夜；（3）去除染色液，收集保存可重复使用20-40次；（4）依次在25%甲醇和7.5%乙酸中室温振摇下脱色。灵敏度为0.1-0.5ug蛋白每条带。n注：使用加热的染色液或脱色液可以缩短染色或脱色时间。将染色液或脱色液在微波炉或水浴中加热，（大约50-60），染色时间可缩短至20min,脱色时间约1-2h。Westernblot实验技术优秀Westernblot实验技术优秀操作图示Westernblot实验技术优秀注意事项 （1）所有蛋白样品定量一致，体积一致，不够的用裂解液补满，样品两侧的泳道用等体积的1loading buffer上样，Marker也用1loading buffer调整至与样品等体积，这样可以避免最边上的孔道电泳时出现扩散，使最边上的孔道电泳出现误差。 （2）Western Blot一般上样30100微克不等，结果跟目的蛋白的含量、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以调整。 （3）积层胶的目的使得loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离胶 ，如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分离胶。而在分离是理论上小电压长时间分离的效果会更好，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好，同时制胶前一定要使胶混匀，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶，使胶不均匀。 （4）pH对整个反应体系的影响是至关重要的，在SDSPAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是TrisHCL缓冲系统，积层胶是pH6.8，分离胶pH8.8；而电泳缓冲液使用的Tris甘氨酸缓冲系统，PH8.3Westernblot实验技术优秀PVDFPVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理：膜和硝酸膜结合蛋白的原理： 一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差，背景相对较弱。 尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用，但相对较弱，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好，但背景相对较强。分类：分类： 半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法。BIO-RAD的半干转运系统的弱点就是无法控温，当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的情况下，就很容易烧胶。 转膜转膜Westernblot实验技术优秀转膜步骤转膜步骤 半干实验步骤：半干实验步骤： 先将PVDF膜在甲醇中浸泡约30s,在放入转膜缓冲液里浸泡数分钟。每块胶用60mA，1h，从下到上的顺序：阴极/滤纸/PVDF膜/凝胶/滤纸, 凝胶面向阴极，保持湿润和没有气泡。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带转移到膜上的效率。 湿转实验步骤：湿转实验步骤： 将膜，凝胶放置到湿转夹子中，膜面向正极，凝胶面向负极，300 mA横流转膜1.5-2小时，时间和电压可以根据转移蛋白质分子量进行相应调整，转膜后丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带转移到膜上的效率。Westernblot实验技术优秀转膜系统转膜系统MiniTrans-BlotcellcomponentsWesternblot实验技术优秀聚丙烯酰胺胶聚丙烯酰胺胶-膜三明治膜三明治半干转快速，约10-30min湿转较稳定，300mA，1.5-2hWesternblot实验技术优秀封闭封闭原理：原理： 脱脂奶粉中主要是乳清蛋白和酪蛋白。原理就是用非抗原的蛋白去封闭膜，避免标记抗体固定在膜上引起背景增高，即脱脂奶粉中的蛋白通过疏水作用与膜上没有蛋白的部分结合，从而可以阻止一抗与膜通过疏水作用结合而产生很高的背景。种类：种类： 常用的封闭液有bovine serum albumin(BSA),non-fat milk, casein, gelatin, tween-20等,一般用non-fat milk.实验步骤：实验步骤： 5%脱脂奶粉（用1x TBS配制，或1xTBST配制）封闭过夜 或室温12小时。注意：注意：奶粉封闭液最为物廉价美，但若牛奶中可能含有需western的蛋白时，则不能用其作为封闭液。Westernblot实验技术优秀一抗、二抗孵育一抗、二抗孵育1 1：原理：原理： 一抗可以与要检测的蛋白特异结合，二抗可与一抗结合，同时二抗上带有特异的酶（如辣根过氧化物酶HRP，碱性磷酸酶法AP,化学发光显色法HRP ),此酶可以分解底物使胶片感光。2 2：实验步骤：实验步骤： 一抗孵育：5%脱脂奶粉稀释一抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时或4度过夜（抗体浓度及孵育时间需根据不同的抗体做相应调整， 1xTBST，洗膜3次，每次5分钟 二抗孵育：5%脱脂奶粉稀释二抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时， 1x TBST,洗膜3次，每次5分钟Westernblot实验技术优秀显影显影1 1、HRP-ECLHRP-ECL发光法：发光法： 将A、B发光液按比例稀释混合均匀滴在膜上。置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干。2 2、图片分析：、图片分析： 标定Marker，进行分析与扫描。Westernblot实验技术优秀灰度分析灰度分析 剪取条带剪取条带 灰度分析灰度分析 计算比值计算比值Westernblot实验技术优秀Western Blot常见问题分析常见问题分析Westernblot实验技术优秀SDS-PAGE电泳电泳胶不平？胶不平？胶不平？胶不平？凝胶漏液？凝胶漏液？凝胶漏液？凝胶漏液？胶板洗刷干净胶板洗刷干净胶板洗刷干净胶板洗刷干净加入加入加入加入APSAPSAPSAPS和和和和TEMEDTEMEDTEMEDTEMED的量要合适的量要合适的量要合适的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混加入试剂后摇匀，使其充分混加入试剂后摇匀，使其充分混加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀合，防止部分胶块聚合不均匀合，防止部分胶块聚合不均匀合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶温度合适，受热不均匀导致胶温度合适，受热不均匀导致胶温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀聚合不均匀聚合不均匀聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐Westernblot实验技术优秀常见问题n提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。n“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。n“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。Westernblot实验技术优秀n为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。n为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.8）；适当降低电压；n电泳时间比正常要长？可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。Westernblot实验技术优秀初学者常见问题初学者常见问题n为什么电泳电压很高而电流却很低呢？比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。n浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。n凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在30min-1hr内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。Westernblot实验技术优秀转膜及抗体检测转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？单个或多个白点？单个或多个白点？单个或多个白点？转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡中浸泡中浸泡中浸泡5-10min5-10min5-10min5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，“ “三三三三明治明治明治明治” ”结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的滤纸绵之间垫上少许普通的滤纸绵之间垫上少许普通的滤纸绵之间垫上少许普通的滤纸确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温Westernblot实验技术优秀背景太高1.膜没有均匀浸湿2.膜或者缓冲液污染3.封闭不充分4.抗体与封闭剂出现交叉反应5.抗体浓度过高 原因原因对对策策1.1.转膜前用转膜前用100%100%甲醇将膜完甲醇将膜完全浸湿全浸湿2.2.拿取膜与吸水纸时要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液套，更换新鲜转膜缓冲液3.3.检测一抗、二抗与封闭剂检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应是否有交叉反应4.4.杂交前检测一抗、二抗的杂交前检测一抗、二抗的工作浓度工作浓度Westernblot实验技术优秀THANKS!Westernblot实验技术优秀