第四节 代谢调节控制育种7 工业微生物代谢控制育种第四节 代谢调节控制育种 代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。目的产物积累方向进行。抗反馈调节突抗反馈调节突变株选育变株选育l1. 1. 概念：概念：指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突变型。株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突变型。l调节基因突变，致使不能形成活性化的阻抑物；调节基因突变，致使不能形成活性化的阻抑物；l操纵基因突变，丧失和阻抑物结合的亲和力。操纵基因突变，丧失和阻抑物结合的亲和力。 因此，可以利用一些易同化碳源或价廉易得的碳源作为基质生产所需因此，可以利用一些易同化碳源或价廉易得的碳源作为基质生产所需的诱导酶类。的诱导酶类。l2. 2. 筛选方法及实例筛选方法及实例l(1) (1) 限量诱导物恒化培养限量诱导物恒化培养l(2) (2) 循环培养循环培养l(3) (3) 鉴别性培养基的利用鉴别性培养基的利用l(4) (4) 筛选筛选4.1 4.1 组成型突变株的选育组成型突变株的选育 ( (1) 1) 限量诱导物恒化培养限量诱导物恒化培养将野生型菌种经诱变后移接到低浓度将野生型菌种经诱变后移接到低浓度诱导物的恒化器中连续培养诱导物的恒化器中连续培养由于底物浓度低到对野由于底物浓度低到对野生型不发生诱导作用，生型不发生诱导作用，所以诱导型的野生菌不所以诱导型的野生菌不能生长能生长突变株由于不经诱导即突变株由于不经诱导即可产生诱导酶而利用底可产生诱导酶而利用底物，因而得以生长成为物，因而得以生长成为组成型菌株组成型菌株4.1 4.1 组成型突变株的选育组成型突变株的选育2. 2. 筛选方法及实例筛选方法及实例 ( (2) 2) 循环培养循环培养含有诱导物含有诱导物的培养基的培养基不含诱导物不含诱导物的培养基的培养基交交替替连连续续循循环环培培养养由于组成型突变株在两种培养基上都由于组成型突变株在两种培养基上都能产酶，生长逐渐占优势能产酶，生长逐渐占优势4.1 4.1 组成型突变株的选育组成型突变株的选育2. 2. 筛选方法及实例筛选方法及实例(3) (3) 鉴别性培养基的利用鉴别性培养基的利用甘油作惟一甘油作惟一碳源碳源涂布诱涂布诱变孢子变孢子悬液悬液喷上喷上O-O-硝基苯酚硝基苯酚- -D-D-半乳糖苷半乳糖苷( (ONPG)ONPG)组成型组成型诱导型诱导型4.1 4.1 组成型突变株的选育组成型突变株的选育2. 2. 筛选方法及实例筛选方法及实例 ( (4) 4) 筛选筛选l经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。长，野生型不能生长。l例如：利用苯例如：利用苯-半乳糖半乳糖(PG)(PG)筛选筛选-半乳糖苷酶组成型突变半乳糖苷酶组成型突变株。株。4.1 4.1 组成型突变株的选育组成型突变株的选育2. 2. 筛选方法及实例筛选方法及实例l概念：概念：抗分解阻遏和抗分解抑制的突变株。抗分解阻遏和抗分解抑制的突变株。l分解代谢阻遏现象：分解代谢阻遏现象：在初级或次级代谢中都存在，其含义在初级或次级代谢中都存在，其含义是指代谢过程中酶的合成往往受高浓度的葡萄糖或其他易是指代谢过程中酶的合成往往受高浓度的葡萄糖或其他易分解利用的碳源或氮源所抑制。分解利用的碳源或氮源所抑制。l选育抗分解调节突变株选育抗分解调节突变株( (如碳源、氮源或磷酸盐分解调节如碳源、氮源或磷酸盐分解调节) )，其实就是筛选合成酶的产生不受碳、氮、磷的代谢阻遏，其实就是筛选合成酶的产生不受碳、氮、磷的代谢阻遏或抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生长期开始合成，或抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生长期开始合成，延长产抗期以提高产量。延长产抗期以提高产量。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育二、抗分解调节突变株的选育抗分解阻遏、抗分解抑制（一）解除碳源调节突变株的选育（二）氮源（三）磷酸盐 筛选此类突变株的目的筛选此类突变株的目的由于葡萄糖分解产物的积累，阻遏抗生素合成的关键酶，从而抑由于葡萄糖分解产物的积累，阻遏抗生素合成的关键酶，从而抑制抗生素的合成。在实际生产中，采用流加葡萄糖或应用混合碳制抗生素的合成。在实际生产中，采用流加葡萄糖或应用混合碳源可以控制分解中间产物的累积来减少不利影响，但最根本的办源可以控制分解中间产物的累积来减少不利影响，但最根本的办法则是筛选抗碳源分解调节突变株，以解除上述调节机制，达到法则是筛选抗碳源分解调节突变株，以解除上述调节机制，达到增产的目的。增产的目的。 筛选方法与实例筛选方法与实例(1) (1) 循环培养法循环培养法(2) (2) 鉴别性培养基鉴别性培养基(3) (3) 特殊氮源特殊氮源(4) (4) 葡萄糖结构类似物葡萄糖结构类似物4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1. 1. 解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育(1) (1) 循环培养法循环培养法快速利用的快速利用的碳源培养基碳源培养基慢速利用的慢速利用的碳源培养基碳源培养基交交替替培培养养突变型解除了阻遏现象，在乳糖的培突变型解除了阻遏现象，在乳糖的培养基上比野生型生长速度快，养基上比野生型生长速度快，4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1. 1. 解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育(2) (2) 鉴别性培养基鉴别性培养基含有葡萄糖含有葡萄糖的琼脂平板的琼脂平板涂布诱涂布诱变后的变后的菌体菌体喷上喷上O-O-硝基苯酚硝基苯酚- -D-D-半乳糖苷半乳糖苷( (ONPG)ONPG)突变型突变型野生型野生型4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1. 1. 解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育(3) (3) 特殊氮源特殊氮源l用葡萄糖为碳源，受阻遏酶的底物作为惟一氮源用葡萄糖为碳源，受阻遏酶的底物作为惟一氮源配制成培养基，连续移接诱变后的产气杆菌配制成培养基，连续移接诱变后的产气杆菌( (AerobactersAerobacters aerogenesaerogenes) )，可以筛选出不受葡可以筛选出不受葡萄糖阻遏的组氨酸酶突变株。萄糖阻遏的组氨酸酶突变株。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1. 1. 解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育(4) (4) 葡萄糖结构类似物葡萄糖结构类似物l 特性：特性：2-dG2-dG和和3-mG3-mG既不被微生物代谢又具有分解阻遏作用，既不被微生物代谢又具有分解阻遏作用，因此可用来筛选抗分解阻遏的突变株。因此可用来筛选抗分解阻遏的突变株。2-dG3-mG4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1. 1. 解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育4.葡萄糖结构类似物-（1）筛选方法涂琼脂平板出发菌株诱变抗2-dG或3-mG菌落优势生长低浓度2-dG或3-mG一种特殊碳源经诱导酶水解才能利用野生型菌株淘汰l 筛选方法筛选方法l培养基要求含低浓度培养基要求含低浓度2-dG2-dG或或3-mG3-mG及及一种生长碳源，该碳源必须经相应一种生长碳源，该碳源必须经相应的诱导酶水解才能被微生物同化利用。的诱导酶水解才能被微生物同化利用。l 抗性突变株的性质抗性突变株的性质l应用应用2-dG2-dG或或3-mG3-mG不仅可以定向选育分解阻遏脱敏突变株，也可有效地不仅可以定向选育分解阻遏脱敏突变株，也可有效地分离到高产菌株。分离到高产菌株。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1. 1. 解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育(4) (4) 葡萄糖结构类似物葡萄糖结构类似物2. 2. 解除氮源分解调节突变株的选育解除氮源分解调节突变株的选育l氮源分解调节：氮源分解调节：指含氮产物的酶受快速利用的氮源阻遏。指含氮产物的酶受快速利用的氮源阻遏。l类型：类型：细菌、酵母、霉菌等微生物对细菌、酵母、霉菌等微生物对初级代谢初级代谢产物的氮降产物的氮降解物具有调节作用。解物具有调节作用。次级代谢次级代谢的氮降解物的阻遏主要指铵的氮降解物的阻遏主要指铵盐和其他快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解调节盐和其他快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解调节作用。作用。l实例：实例：筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶产量筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶产量的一种有效方法。的一种有效方法。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育二、抗分解调节突变株的选育（三）解除磷酸盐调节突变株的选育初级代谢必须过量时影响次级代谢磷酸盐基本耗竭，抗生素合成开始发酵工业中，磷酸盐常被控制在亚适量。3. 3. 解除磷酸盐调节突变株的选育解除磷酸盐调节突变株的选育（A A）磷酸盐对次生产物的调节机制磷酸盐对次生产物的调节机制(1) (1) 通过初级代谢的变化影响次级代谢通过初级代谢的变化影响次级代谢 加强初级代谢，推迟抗生素合成的起始；加强初级代谢，推迟抗生素合成的起始； 改变糖类分解代谢途径，磷酸盐有利于糖酵解，从而改变糖类分解代谢途径，磷酸盐有利于糖酵解，从而降低戊糖途径的活力，导致某些以戊糖途径为先导的抗生降低戊糖途径的活力，导致某些以戊糖途径为先导的抗生素合成受抑制；素合成受抑制； 限制抗生素合成的诱导物；限制抗生素合成的诱导物； 抑制或阻遏磷酸脂酶类的合成。抑制或阻遏磷酸脂酶类的合成。(2) (2) 磷酸盐对磷酸盐对ATPATP调节：调节：磷酸盐可能通过调节细胞内的效应磷酸盐可能通过调节细胞内的效应物物cAMPcAMP、ATPATP等来控制抗生素的基因表达。等来控制抗生素的基因表达。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育（B B） 发酵过程中对磷酸盐的控制发酵过程中对磷酸盐的控制l其添加浓度要严格限制在亚适量的水平，但最主要的目标是选育解除其添加浓度要严格限制在亚适量的水平，但最主要的目标是选育解除磷酸盐调节突变株。磷酸盐调节突变株。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育3. 3. 解除磷酸盐调节突变株的选育解除磷酸盐调节突变株的选育 （C C）抗磷酸突变株抗磷酸突变株的筛选方法的筛选方法4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育3. 3. 解除磷酸解除磷酸 盐调节突变株盐调节突变株的选育的选育 营养缺陷型突变株的特性：营养缺陷型突变株的特性： （1）代谢障碍突变株，由结构基因突变引起合成代谢中一个酶失活，使某个生）代谢障碍突变株，由结构基因突变引起合成代谢中一个酶失活，使某个生化反应发生遗传性障碍，使菌株丧失合成某种物质的能力，导致该菌株在培养化反应发生遗传性障碍，使菌株丧失合成某种物质的能力，导致该菌株在培养基中不添加这种物质就无法生长。基中不添加这种物质就无法生长。 （2）营养缺陷型菌株常常会使发生障碍的前一步的中间代谢产物得到累积，这）营养缺陷型菌株常常会使发生障碍的前一步的中间代谢产物得到累积，这就成为利用营养缺陷型菌株进行工业发酵来就成为利用营养缺陷型菌株进行工业发酵来积累有用中间代谢产物积累有用中间代谢产物的依据。的依据。 （3）营养缺陷型菌株由于生物合成途径中某一步发生障碍，合成反应不能完成，）营养缺陷型菌株由于生物合成途径中某一步发生障碍，合成反应不能完成，从而从而解除了终产物反馈阻抑解除了终产物反馈阻抑。外加限量需要的营养物质，克服生长的障碍，使。外加限量需要的营养物质，克服生长的障碍，使终产物不至于积累到引起反馈调节的浓度，从而有利于中间产物或另一途径的终产物不至于积累到引起反馈调节的浓度，从而有利于中间产物或另一途径的某种终产物的积累。某种终产物的积累。4.3 4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型在代谢调节育种中的应用1.1.在初级代谢调节育种中的应用在初级代谢调节育种中的应用（1）直线式生物合成途径直线式生物合成途径4.3 4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型在代谢调节育种中的应用 （2 2） 分支式生物分支式生物合成途径合成途径 实例实例1 1：谷氨酸谷氨酸棒状棒状杆菌的杆菌的L-L-谷氨酸生谷氨酸生物合成途径物合成途径生物素缺陷型生物素缺陷型硫胺素缺陷型硫胺素缺陷型4.3 4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型在代谢调节育种中的应用1.1.在初级代谢调节育种中的应用在初级代谢调节育种中的应用l实例实例2 2：谷氨酸棒状杆菌的腺核苷酸、鸟核苷酸的合成代谢途径谷氨酸棒状杆菌的腺核苷酸、鸟核苷酸的合成代谢途径腺嘌呤缺陷型腺嘌呤缺陷型协同反馈抑制协同反馈抑制l实例实例3 3 高丝氨酸营养缺陷型菌株的赖氨酸合成途径高丝氨酸营养缺陷型菌株的赖氨酸合成途径高丝氨酸缺陷型高丝氨酸缺陷型协同反馈抑制协同反馈抑制2. 2. 在次级代谢调节育种中的应用在次级代谢调节育种中的应用（1 1）抗生素增产：）抗生素增产：抗生素产生菌的营养缺陷株多数生产能力是下降抗生素产生菌的营养缺陷株多数生产能力是下降的。然而，在初级或次级代谢产物的分支代谢途径中，营养缺陷的。然而，在初级或次级代谢产物的分支代谢途径中，营养缺陷型切断初级代谢支路，有可能使抗生素增产。型切断初级代谢支路，有可能使抗生素增产。4.3 4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型在代谢调节育种中的应用实例：四环素、制霉菌素产生菌的脂肪酸缺陷型可增加抗实例：四环素、制霉菌素产生菌的脂肪酸缺陷型可增加抗生素。生素。脂肪酸缺陷型脂肪酸缺陷型 （2 2）新产品）新产品 实例：实例： 金霉素第六碳原子上甲金霉素第六碳原子上甲基是由蛋氨酸供应的，基是由蛋氨酸供应的，如果获得蛋氨酸缺陷型，如果获得蛋氨酸缺陷型，阻断了蛋氨酸这一区段阻断了蛋氨酸这一区段的合成，导致次级代谢的合成，导致次级代谢中甲基供给受到限制，中甲基供给受到限制，结果产生去甲基金霉素，结果产生去甲基金霉素，而不产生金霉素。而不产生金霉素。4.3 4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型在代谢调节育种中的应用2. 2. 在次级代谢调节育种中的应用在次级代谢调节育种中的应用四、渗漏缺陷型在代谢调节育种中的应用渗漏缺陷型：一种特殊的营养缺陷型。遗传性代谢障碍不完全，酶活力下降而不完全丧失，能在基本培养基上少量生长选育方法：. 营养缺陷型菌株接种于基本培养基 平板上 2. 挑菌（生长特别慢、菌落小）l概念：概念：抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产：株。其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产：l如果由于如果由于结构基因突变结构基因突变而使变构酶成为不能和代谢终产物相结合的，便是而使变构酶成为不能和代谢终产物相结合的，便是失去了反馈抑制的突变，称为失去了反馈抑制的突变，称为“抗反馈突变型抗反馈突变型”；l如果是由于如果是由于调节基因突变调节基因突变引起调节蛋白不能和代谢终产物相结合而失去阻引起调节蛋白不能和代谢终产物相结合而失去阻遏作用的，称为遏作用的，称为“抗阻遏突变型抗阻遏突变型”。 一般而言，抗阻遏突变结果使胞内酶有可能成倍增长，而抗反馈突变的一般而言，抗阻遏突变结果使胞内酶有可能成倍增长，而抗反馈突变的胞内酶量没有什么变化。但从作用效果上讲，均造成终产物大量积累，而胞内酶量没有什么变化。但从作用效果上讲，均造成终产物大量积累，而且往往两种突变同时发生，难以区别。通常就统称为且往往两种突变同时发生，难以区别。通常就统称为“抗反馈调节突变型抗反馈调节突变型”。4.5 4.5 抗反馈调节突变株的选育抗反馈调节突变株的选育l在在实际应用实际应用中，抗反馈调节突变株的选育可以通过以中，抗反馈调节突变株的选育可以通过以下几个方面：下几个方面：从遗传上解除反馈调节从遗传上解除反馈调节 ( (如各种抗性和耐性育种、回复突如各种抗性和耐性育种、回复突变子的应用等变子的应用等) )截流或减少终产物堆积截流或减少终产物堆积 ( (如借助营养缺陷型或采用渗漏缺如借助营养缺陷型或采用渗漏缺陷型等陷型等) )移去终产物移去终产物 ( (借助膜透性的突变等借助膜透性的突变等) )4.5 4.5 抗反馈调节突变株的选育抗反馈调节突变株的选育1.1.回复突变引起的抗反馈调节突变株回复突变引起的抗反馈调节突变株2.2.耐自身产物突变株选育耐自身产物突变株选育3.3.抗终产物结构类似物突变株的选育抗终产物结构类似物突变株的选育4.4.累积前体和耐前体突变株的选育累积前体和耐前体突变株的选育4.5 4.5 抗反馈调节突变株的选育抗反馈调节突变株的选育l1. 1. 概念：概念：一种可逆性突变，即具有突变型基因的个体通过再突变又成为野一种可逆性突变，即具有突变型基因的个体通过再突变又成为野生型表型的过程。生型表型的过程。l2. 2. 产生的原因产生的原因(1) (1) 原有基因的回复突变原有基因的回复突变：指基因内部位点突变引起的逆向突变现象，分以下两种情况：指基因内部位点突变引起的逆向突变现象，分以下两种情况： 同一基因内的同一个或几个碱基的突变引起的回复，消除了原有突变效应，完同一基因内的同一个或几个碱基的突变引起的回复，消除了原有突变效应，完全恢复野生基因型及其功能，即真正的回复突变；全恢复野生基因型及其功能，即真正的回复突变； 在同一基因内，但不同的位点碱基的变化，改变了基因的核苷酸序列，补偿了在同一基因内，但不同的位点碱基的变化，改变了基因的核苷酸序列，补偿了原有突变点已失去的功能，使其出现野生表型，称为基因内抑制突变。原有突变点已失去的功能，使其出现野生表型，称为基因内抑制突变。4.5.1 4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株回复突变引起的抗反馈调节突变株(2) (2) 非非原有基因的回复突变原有基因的回复突变l概念：在概念：在DNADNA分子链上的一个基因突变成为突变型，随后在分子链上的一个基因突变成为突变型，随后在邻近的基因某位点碱基发生突变，抑制了前一个突变基因邻近的基因某位点碱基发生突变，抑制了前一个突变基因的效应，重新出现野生型的表型，又称为的效应，重新出现野生型的表型，又称为抑制基因突变抑制基因突变。4.5.1 4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株回复突变引起的抗反馈调节突变株2. 2. 产生的原因产生的原因 区别基因回复突变和抑制基因突变的方法区别基因回复突变和抑制基因突变的方法l将回复突变菌株和野生型菌株进行回交试验或杂交重组将回复突变菌株和野生型菌株进行回交试验或杂交重组试验，观察它们的子代是否有突变型出现：试验，观察它们的子代是否有突变型出现： 有同样的突变型重新出现，说明回复突变和原来突变型不在有同样的突变型重新出现，说明回复突变和原来突变型不在同一位置而是分开的，属于抑制基因回复突变株；同一位置而是分开的，属于抑制基因回复突变株； 如果杂交后代没有产生突变型，表明回复突变的位置与原突如果杂交后代没有产生突变型，表明回复突变的位置与原突变型位点相同，是真正的回复突变。变型位点相同，是真正的回复突变。4.5.1 4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株回复突变引起的抗反馈调节突变株3. 3. 回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选 l(1) (1) 初级代谢途径障碍性回复突变型初级代谢途径障碍性回复突变型l采用回复突变方法来筛选抗反馈调节突变株是根据采用回复突变方法来筛选抗反馈调节突变株是根据“原养型原养型营营缺型缺型原养型原养型”选育途径进行的。二次突变后的情况有以下两种：选育途径进行的。二次突变后的情况有以下两种： 一种是在原位点发生回复突变，恢复野生型酶活力；一种是在原位点发生回复突变，恢复野生型酶活力； 另一种是在原突变位点以外位置回复突变。这种回复突变体的表型另一种是在原突变位点以外位置回复突变。这种回复突变体的表型虽然与原养型相似，但基因型不同，它并不是原有结构基因的恢复，而虽然与原养型相似，但基因型不同，它并不是原有结构基因的恢复，而是是反馈调节变构酶的调节中心发生突变反馈调节变构酶的调节中心发生突变造成。突变后的调节中心与活性造成。突变后的调节中心与活性中心相互影响，催化位点得以恢复酶活力，由于调节位点已发生突变，中心相互影响，催化位点得以恢复酶活力，由于调节位点已发生突变，它不能再和阻遏物结合，因此，它不能再和阻遏物结合，因此，回复突变解除了反馈调节机制，使有效回复突变解除了反馈调节机制，使有效代谢产物大量累积代谢产物大量累积。4.5.1 4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株回复突变引起的抗反馈调节突变株 ( (2) 2) 次级代谢途径障碍性的回复突变次级代谢途径障碍性的回复突变l次级代谢回复突变，是一种初级代谢途径或次级代谢途径障碍性回复突变次级代谢回复突变，是一种初级代谢途径或次级代谢途径障碍性回复突变型。例如金霉素回复突变就是利用型。例如金霉素回复突变就是利用“原养型原养型营缺型营缺型原养型原养型”选育途径选育途径进行的，获得了增产。进行的，获得了增产。l除放线菌外，真核微生物获得高活性的回复突变的例子不多。除放线菌外，真核微生物获得高活性的回复突变的例子不多。l回复突变的选育途径也可以应用回复突变的选育途径也可以应用“零变株零变株”的回复突变型来达到超产目的。的回复突变型来达到超产目的。“零变株零变株”指完全失去产生抗生素能力的突变株；指完全失去产生抗生素能力的突变株；选育途径是：原养型选育途径是：原养型零变株零变株回复突变型。回复突变型。“零突变零突变”可以发生在初级代谢，也可以发生在次生代谢途径中，总之是失去了产可以发生在初级代谢，也可以发生在次生代谢途径中，总之是失去了产量的代谢障碍突变。量的代谢障碍突变。“零变株零变株”的回复突变株的筛选的回复突变株的筛选4.5.1 4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株回复突变引起的抗反馈调节突变株3. 3. 回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选l发生障碍性突变的营养缺陷型，抗生素产量大多数都比发生障碍性突变的营养缺陷型，抗生素产量大多数都比亲株低，而回复突变株往往比原养型亲株高。原因在于：亲株低，而回复突变株往往比原养型亲株高。原因在于：lA. A. 缺陷型菌株缺陷型菌株中几种不能合成的氨基酸都是参与相应抗生素生中几种不能合成的氨基酸都是参与相应抗生素生物合成的，基因突变的结果是使菌体丧失参与合成这些氨基酸的物合成的，基因突变的结果是使菌体丧失参与合成这些氨基酸的酶活力，导致有关抗生素合成过程因缺乏氨基酸而产量下降。酶活力，导致有关抗生素合成过程因缺乏氨基酸而产量下降。lB. B. 回复突变回复突变除原变异位点发生逆转突变而使野生型基因重建以除原变异位点发生逆转突变而使野生型基因重建以外，有时还会发生原突变位点以外的基因内抑制或抑制基因突变。外，有时还会发生原突变位点以外的基因内抑制或抑制基因突变。l自身代谢产物，包括初级代谢产物和次级代谢产物。自身代谢产物，包括初级代谢产物和次级代谢产物。微生物控制初级代谢产物的反馈机制相当严格；微生物控制初级代谢产物的反馈机制相当严格；对次生产物，反馈调节机制也起重要作用。对次生产物，反馈调节机制也起重要作用。 要使这些产物适量生产，必须绕过这些调节机制。要使这些产物适量生产，必须绕过这些调节机制。l一个菌株的生产能力与耐自身抗生素的浓度是成正相关的。抗自一个菌株的生产能力与耐自身抗生素的浓度是成正相关的。抗自身产物能力是高产菌株的特性之一。身产物能力是高产菌株的特性之一。l除耐自身产物之外，还可以考虑与以下情况结合进行：除耐自身产物之外，还可以考虑与以下情况结合进行：第一，抗第一，抗Mg Mg 2 2离子突变离子突变第二，许多抗生素的钝化酶已知作为选择性标记，设想筛选第二，许多抗生素的钝化酶已知作为选择性标记，设想筛选高活性钝化高活性钝化酶的变株酶的变株，其自身耐性亦会提高。，其自身耐性亦会提高。钝化酶：又称合成酶，可催化某些基团结合到抗生素的钝化酶：又称合成酶，可催化某些基团结合到抗生素的OHOH基或基或NHNH2 2基上，基上，使抗生素失活。使抗生素失活。 4.5.2 4.5.2 耐自身产物突变株选育耐自身产物突变株选育l1. 1. 结构类似物结构类似物是指那些在结构上和代谢终产物是指那些在结构上和代谢终产物( (氨基酸、嘌呤、维生素等氨基酸、嘌呤、维生素等) )相似的物相似的物质。它们和终产物一样能够和变构酶的调节蛋白结合，起共遏物作用，用酶变构引起质。它们和终产物一样能够和变构酶的调节蛋白结合，起共遏物作用，用酶变构引起反馈阻抑；所不同的是，终产物与酶结合是可逆的，而类似物由于不真正掺入细胞结反馈阻抑；所不同的是，终产物与酶结合是可逆的，而类似物由于不真正掺入细胞结构，酶活性不会恢复，因而是构，酶活性不会恢复，因而是“假反馈抑制假反馈抑制”。4.5.3 4.5.3 抗终产物结构类似物突变株的选育抗终产物结构类似物突变株的选育l2. 2. 结构类似物对微生物是结构类似物对微生物是致死的致死的，它们往往具有抑菌的作用。在含有结构类，它们往往具有抑菌的作用。在含有结构类似物的培养基上野生型是不能生长，然而抗结构类似物的变株则能生长。似物的培养基上野生型是不能生长，然而抗结构类似物的变株则能生长。l3. 3. 抗代谢结构类似物育种是最早采用并取得显著成效的代谢育种方法，成为抗代谢结构类似物育种是最早采用并取得显著成效的代谢育种方法，成为当今初级代谢产物，尤其是氨基酸产生菌育种的主流。较之营养缺陷型的方当今初级代谢产物，尤其是氨基酸产生菌育种的主流。较之营养缺陷型的方法，它具有以下法，它具有以下优点优点：l(1) (1) 如果找到适当的结构类似物，用此种选育法简单易行且效果显著如果找到适当的结构类似物，用此种选育法简单易行且效果显著；l(2) (2) 采用营养缺陷型菌株发酵，解除代谢调节是通过控制培养基中所需营养物采用营养缺陷型菌株发酵，解除代谢调节是通过控制培养基中所需营养物浓度来实现，并没有从遗传上根本解除代谢调节，所需营养物的量不易控制，浓度来实现，并没有从遗传上根本解除代谢调节，所需营养物的量不易控制，造成代谢产物不稳定；而抗结构类似物变株的代谢调节被解除，生产操作方便，造成代谢产物不稳定；而抗结构类似物变株的代谢调节被解除，生产操作方便，产量稳定；产量稳定；l(3) (3) 突变株易于保存，而且不发生回复突变，只要在保存培养基中加入适量结突变株易于保存，而且不发生回复突变，只要在保存培养基中加入适量结构类似物，即可防止回复突变。构类似物，即可防止回复突变。4.5.3 4.5.3 抗终产物结构类似物突变株的选育抗终产物结构类似物突变株的选育l4. 4. 选育实例选育实例l(1) (1) 直线合成途径直线合成途径l利用抗结构类似物的方法，可以直接累积终产物。如抗刀豆氨酸的突利用抗结构类似物的方法，可以直接累积终产物。如抗刀豆氨酸的突变株变株AIRAIR，可有效地积累精氨酸。可有效地积累精氨酸。l(2) (2) 分支途径分支途径l典型例子是黄色短杆菌的抗苏氨酸、赖氨酸和异亮氨酸的结构类似物典型例子是黄色短杆菌的抗苏氨酸、赖氨酸和异亮氨酸的结构类似物突变株选育。突变株选育。4.5.3 4.5.3 抗终产物结构类似物突变株的选育抗终产物结构类似物突变株的选育l5. 5. 抗代谢类似物的筛选方法抗代谢类似物的筛选方法l一般采用一般采用浓度梯度法浓度梯度法，即把结构类似物加入到培养基中，制成梯度，即把结构类似物加入到培养基中，制成梯度琼脂平板，将诱变剂处理后的菌体分离在琼脂平板上，经培养，从琼脂平板，将诱变剂处理后的菌体分离在琼脂平板上，经培养，从结构类似物浓度高的平板区挑取菌落于斜面，进一步纯化并开展液结构类似物浓度高的平板区挑取菌落于斜面，进一步纯化并开展液体发酵试验。筛选实例：抗异烟肼的酵母菌吡哆醇高产株的选育。体发酵试验。筛选实例：抗异烟肼的酵母菌吡哆醇高产株的选育。4.5.3 4.5.3 抗终产物结构类似物突变株的选育抗终产物结构类似物突变株的选育l 前体物对抗生素生物合成的产量影响：前体物对抗生素生物合成的产量影响：其一，作为组成成分掺入生物合成其一，作为组成成分掺入生物合成其二，导致反馈调节其二，导致反馈调节其三，引起毒性其三，引起毒性 解除前体物毒性的根本办法是筛选耐前体突变株。解除前体物毒性的根本办法是筛选耐前体突变株。1. 1. 耐耐“毒性毒性”前体突变株的选育前体突变株的选育2. 2. 耐前体结构类似物突变株的选育耐前体结构类似物突变株的选育3. 3. 耐前体的有关代谢物突变株的选育耐前体的有关代谢物突变株的选育4.5.4 4.5.4 累积前体和耐前体突变株的选育累积前体和耐前体突变株的选育1. 1. 耐耐“毒性毒性”前体突变株的选育前体突变株的选育4.5.4 4.5.4 累积前体和耐前体突变株的选育累积前体和耐前体突变株的选育实例：灰黄霉素耐实例：灰黄霉素耐前体突变株前体突变株D-756D-756的的选育选育2. 2. 耐前体结构类似物突变株的选育耐前体结构类似物突变株的选育实例实例1 1：硝吡咯菌素生物合成：硝吡咯菌素生物合成实例实例2 2：-内酰胺抗生素的生物合成内酰胺抗生素的生物合成4.5.4 4.5.4 累积前体和耐前体突变株的选育累积前体和耐前体突变株的选育5/65/6氟色氨酸氟色氨酸3. 3. 耐前体的有关代谢物突变株的选育耐前体的有关代谢物突变株的选育4.5.4 4.5.4 累积前体和耐前体突变株的选育累积前体和耐前体突变株的选育麦迪霉素麦迪霉素A A1 1的代谢径的代谢径六、细胞膜透性突变株选育 生物膜是透性膜细胞膜透性强，胞内物质易分泌到胞外 弱， ，引起反馈抑制六、细胞膜透性突变株选育1、营养缺陷型突变株可改变细胞膜透性选育营养缺陷型菌株，通过代谢控制培养控制细胞膜的生物合成，使细胞膜生理状态异常，解除渗透障碍2、温度敏感突变株的选育温度敏感突变株 ： 许可温度下正常生长， 非许可温度下不能生长繁殖 细胞膜某些结构异常3、溶菌酶敏感突变株的选育