前 言 中心法则： 第一章 PCR 一、概念： PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction ）是利用 DNA 在体外摄氏95 高温时变性会变成单链，低温（经常是 60 C 左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至 DNA 聚合酶最适反应温度（72 C 左右） ，DNA 聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。 二、原理： DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。 双链 DNA 在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在 DNA 聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制 DNA 的变性和复性，加入设计引物，DNA 聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。 PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性- 退火- 延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 95左右一定时间后，使模板 DNA双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 DNA 与引物的退火（复性） ：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 60左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA 模板- 引物结合物在 72、DNA 聚合酶（如 Taq DNA 聚合酶）的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对原则与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性- 退火- 延伸三过程就可获得更多的“ 半保留复制链” ，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟，23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 理的半保留复制是生物进化和传代的重要途径双链在多种酶的作用下可双链因此通过温度变化控制的变性和复性加入设计引物聚合酶就可以成性模板经加热至左右一定时间后使模板双链或经扩增形成的双链解离使三、引物 PCR 反应中有两条引物，即 5 引物和 3 引物。设计引物时以一条 DNA 单链为基准（常以信息链为基准） ，5 端引物与位于待扩增片段 5 端上的一小段 DNA序列相同；3 端引物与位于待扩增片段 3 端的一小段 DNA 序列互补。 引物设计的基本原则 引物长度：15-30bp ，常用为 20bp 左右，Tm 值在 60比较好。 引物碱基：G+C 含量以 40-60% 为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。 常用引物设计软件有：Primer Premier5.0 、Vector NTI Suit 、DNAstar 等 Tm 值： Tm 值就是 DNA 熔解温度，指把 DNA 的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的 DNA， Tm 值不同。 DNA 中 GC 含量越高， Tm 值越高， 成正比关系。 Tm 计算公式为：Tm = 4(G + C)+ 2 (A + T) 四、示意过程： 例如：Taq Plus DNA Polymerase(P201) 反应体系： DDW To 20l Taq DNA Polymerase (5 U/l) 1U-2U 10 Taq Plus Buffer(with 15mM MgCl2) 2l 25mM MgCl2 optional dNTP Mix (10 mM each) 0.4l 引物 F (10 M) 0.8l 引物 R (10 M) 0.8l 模板 DNA 根据说明书提供的参考浓度选择 反应程序： 95 5 min ( 预变性) 95 30 sec 30-35循环 60 30 sec 72 60 sec/kb 72 7 min (彻底延伸) 附：DNA 与 RNA 的区别？ 1、组成单位不同：DNA 的组成单位是脱氧核苷酸，RNA 的组成单位是核糖核苷酸， 2、组成碱基不同：DNA 的组成碱基是 ATGC ，RNA 的组成碱基是 AUGC 3、组成五碳糖不同：DNA 的组成五碳糖是脱氧核糖，RNA 的组成五碳糖是核糖， 4、空间结构不同：DNA 是双螺旋结构，RNA 一般是单链。 5、功能不同：DNA 是遗传物质，RNA 一般在细胞中不作为遗传物质。 理的半保留复制是生物进化和传代的重要途径双链在多种酶的作用下可双链因此通过温度变化控制的变性和复性加入设计引物聚合酶就可以成性模板经加热至左右一定时间后使模板双链或经扩增形成的双链解离使第二章 逆转录 一、概念： 逆转录(reverse transcription) 是以 RNA 为模板合成 DNA 的过程。以 DNA 为模板合成 RNA 的过程叫做转录，此过程与该流动方向（DNA 到 RNA）相反，故称为逆转录。 二、原理： 人们通过体外模拟该过程，以样本中提取的 mRNA 为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的 cDNA，构建 cDNA 文库，并从中筛选特异的目的基因。该方法已成为基因工程技术中最常用的获得目的基因的策略之一。 三、mRNA ： Messenger RNA (mRNA ）又叫做信使 RNA，是一类在蛋白质合成时充当模板的 RNA。信使 RNA 是脱氧核糖核酸（DNA）转录合成的带有遗传信息的一类单链 RNA。它在核糖体上作为蛋白质合成的模板，决定肽链的氨基酸排列顺序。mRNA 存在于原核生物和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器（如线粒体和叶绿体）中。 在真核生物中，最初转录生成的 RNA 称为核不均一 RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA） ，然而在细胞浆中起作用，作为蛋白质的氨基酸序列合成模板的是 mRNA（messenger RNA ） 。hnRNA 是 mRNA 的未成熟前体。两者之间的差别主要有两点：一是 hnRNA 核苷酸链中的一些片段将不出现于相应的mRNA 中，这些片段称为内含子（intron） ，而那些保留于 mRNA 中的片段称为外显子（exon） 。也就是说，hnRNA 在转变为 mRNA 的过程中经过剪接，被去掉了一些片段，余下的片段被重新连接在一起；二是 mRNA 的 5 末端被加上一个 m7pGppp 帽子，在 mRNA3 末端多了一个多聚腺苷酸（polyA）尾巴。 mRNA 的核苷酸序列与 DNA 序列相应，决定着合成蛋白质的氨基酸序列。三个核苷酸组成一个密码子，每个密码子由三个前后相联的核苷酸组成，一个密码子只为一种氨基酸编码。共有 64 个密码子。 理的半保留复制是生物进化和传代的重要途径双链在多种酶的作用下可双链因此通过温度变化控制的变性和复性加入设计引物聚合酶就可以成性模板经加热至左右一定时间后使模板双链或经扩增形成的双链解离使四、示意过程 反应体系： DEPC 水 To 20l 5 RT buffer 4l dNTP Mix (10 mM each) 1l Oligo dT （50m）/N6 1l RNase inhibitor （40U/l ） 1l Reverse Transcriptase （200U/l ） 1l RNA 模板 1ng-1g 反应程序： 逆转录 50 45min 逆转录酶失活 85 5min 附： 逆转录实验的注意事项： 1、RNA 容易降解。RNase A 酶非常稳定，是导致 RNA 降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活， 但限制因素去除后又迅速复性。 用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使 RNase 完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与 RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。 2、用 TRIZOL 或 RNA 提取试剂盒提取的总 RNA，包括信使 RNA(mRNA) ，转运 RNA(tRNA) 和核糖体 RNA(rRNA)。其中核糖体 RNA(rRNA) 占总 RNA 的80-85%，信使 RNA(mRNA) 只占 1-2% 。 理的半保留复制是生物进化和传代的重要途径双链在多种酶的作用下可双链因此通过温度变化控制的变性和复性加入设计引物聚合酶就可以成性模板经加热至左右一定时间后使模板双链或经扩增形成的双链解离使第三章 荧光定量 PCR 一、概念： 是指在PCR 反应体系中加入能够指示DNA 片段扩增过程的荧光染料(SYBR Green 等)或荧光标记的特异性的探针(TaqMan Probe 等)，通过对 PCR 过程中产生的荧光信号积累实时监测整个 PCR 过程，再结合相应的计算机软件对所获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品特定 DNA 片段的初始浓度。 二、信号产生原理 三、重要概念 1、荧光基线：指 PCR 循环起始时，虽然荧光信号积累，但仍在仪器可以检测的灵敏度下，接近一条直线。 2、荧光阈值：等于 3-18个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍，处于 PCR 扩增的指数期，一般仪器会自动给出一个荧光阈值，也可人为调节。 理的半保留复制是生物进化和传代的重要途径双链在多种酶的作用下可双链因此通过温度变化控制的变性和复性加入设计引物聚合酶就可以成性模板经加热至左右一定时间后使模板双链或经扩增形成的双链解离使3、Ct 值：指荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的循环数。 4、内参基因：又叫管家基因，是细胞中持续、恒量转录表达的基因，每个细胞中管家基因的转录水平相差很小， 且始终和待测靶序列经过相同的处理过程， 因而可以校正各个操作环节如组织样本的多少、RNA 提取过程的得率及完整度、逆转录效率、RNA 定量过程产生的误差，将靶基因归一化到相同细胞数比较。常用的内参基因有 GAPDH、 -Actin、 -Tubulin等。 四、分类 目前常用的定量方法有两种： 绝对定量和相对定量。 两者的区别在于制作标准曲线的标准品的靶基因拷贝数是否已知。 1、绝对定量：DNA 标准品的拷贝数是已知的，可以根据标准曲线和待测样本的Ct 值，计算出待测样本靶序列的拷贝数。 2、相对定量：DNA 标准品的拷贝数是未知的，只已知稀释倍数，可以根据各待测样本和相应内参基因的 Ct 值，计算出待测样本靶序列的拷贝数之间相差的倍数。 理的半保留复制是生物进化和传代的重要途径双链在多种酶的作用下可双链因此通过温度变化控制的变性和复性加入设计引物聚合酶就可以成性模板经加热至左右一定时间后使模板双链或经扩增形成的双链解离使第四章 克隆和点突变 一、传统克隆概念： 一般意义上，在由限制性核酸内切酶修饰过的质粒 DNA 序列中插入外源的目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导进宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程。 二、实验流程： 1）线性化载体的制备 2）插入片段 PCR 扩增 3）进行重组反应 4）反应产物转化、涂板 可概括为切、连、转、选。 切是指用序列特异的限制性内切酶切开载体 DNA，或者切出目的基因；连是指用 DNA 连接酶将目的 DNA 同载体 DNA 连接起来， 形成重组的 DNA 分子；转是指通过特殊的方法将重组的 DNA 分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；选则是从宿主群体中挑选出携带有重组 DNA 分子的个体。 附：基本概念 1、质粒载体： 质粒是独立于细菌染色体外自我复制的遗传因子，在基因工程中作为最常用，最简单的载体，一般包括三部分：遗传标记基因（抗生素抗性基因） ，复制区，多酶位点区域。天然的质粒都是环状双链 DNA，大小从几个到数百个 kb。 2、限制性核酸内切酶： 限制性核酸内切酶是可以识别 DNA 的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链 DNA 的一类内切酶，简称限制酶。 限制性内切酶识别 DNA 序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一理的半保留复制是生物进化和传代的重要途径双链在多种酶的作用下可双链因此通过温度变化控制的变性和复性加入设计引物聚合酶就可以成性模板经加热至左右一定时间后使模板双链或经扩增形成的双链解离使侧（如 EcoR I、BamH I、Hind 等） ，因而可形成粘性末端，另一些类酶如 Alu I、BsuR I、Bal I、Hal 、HPa I、Sma I 等，切割位点在回文序列中间，形成平整末端。 三、点突变 是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的 DNA 片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化） ，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高 DNA 所表达的目的蛋白的性状及表征， 是基因研究工作中一种非常有用的手段。 通俗的说， 通过设计引物，并利用 PCR 将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在 PCR 产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。 理的半保留复制是生物进化和传代的重要途径双链在多种酶的作用下可双链因此通过温度变化控制的变性和复性加入设计引物聚合酶就可以成性模板经加热至左右一定时间后使模板双链或经扩增形成的双链解离使第五章 细胞生物学 一、细胞凋亡： 细胞凋亡（apoptosis）指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的， 有关细胞死亡过程的研究，已成为生物学、医学研究的一个热点。因此，细胞凋亡的检测是实验研究过程中的重要手段。 用于早期凋亡：Annexin V Apoptosis Detection Kit 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V 是一种分子量为 3536 kD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力， 故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。 因此Annexin V 被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将 Annexin V 进行绿色荧光 (FITC 或 EGFP)标记，以标记了的 Annexin V 作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(Propidium Iodide, PI) 是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V 与 PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 理的半保留复制是生物进化和传代的重要途径双链在多种酶的作用下可双链因此通过温度变化控制的变性和复性加入设计引物聚合酶就可以成性模板经加热至左右一定时间后使模板双链或经扩增形成的双链解离使 用于晚期凋亡：TUNEL Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡晚期的一个显著特点是细胞染色体的 DNA 被内源核酸内切酶有规律的降解成长度约为 180-200 bp的整倍数的片段。TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) 法 应 用 末 端 脱 氧 核 糖 核 苷 酸 转 移 酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 在凋亡细胞的断裂 DNA 的 3 -OH末端催化掺入荧光分子标记的 dUTP，使得凋亡细胞可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。 二、细胞增殖周期： 细胞分裂具有周期性，即连续分裂的细胞，从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，为一个细胞周期。一个细胞周期细分为以下几个阶段： G0 期：分裂停止期，具有分裂能力的细胞在反复分裂数次之后，处于停止分裂状态的时期； G1 期：DNA 合成准备期，开始合成细胞生长需要的各种蛋白质，糖类，脂类、RNA 等生化物质，细胞 DNA 总量不变，主要为 S 期做准备； S 期：DNA 合成期，此阶段 DNA 数目加倍； G2 期：分裂准备期，DNA 合成已经终止，但是蛋白质、RNA 等仍在合成，主要为 M 期做准备； M 期：分裂期，细胞开始分裂，一分为二，分裂结束后，再次进入G0 期，循环分裂过程。 三、细胞转染： 转染， 是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。 随着基因与蛋白功能研究的深入， 转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。 转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例； 化学介导方法很多， 如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。 理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 理的半保留复制是生物进化和传代的重要途径双链在多种酶的作用下可双链因此通过温度变化控制的变性和复性加入设计引物聚合酶就可以成性模板经加热至左右一定时间后使模板双链或经扩增形成的双链解离使