基因工程药物制备技术Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望一、实验目的一、实验目的 通过本实验了解和掌握基因工程蛋白药物的发酵表达、提取、纯化及纯度检测等基本方法二、实验原理本实验工程菌在含卡那霉素的LB培养基中，在IPTG诱导下可大量表达重组蛋白。重组蛋白以无活性、不溶性的包涵体形式存在。要获得活性蛋白，必须进行变性、复性处理。重组蛋白N端存在6个连续的组氨酸His序列，可与镍进行可逆鳌合反应，因此，可用镍螯合的琼脂糖柱Ni-IDA进行亲合纯化，以镍柱亲合层析法获得纯化的重组蛋白。工程菌培养工程菌培养破菌破菌诱导表达诱导表达包涵体制备包涵体制备变性变性复性复性重组蛋白纯化重组蛋白纯化（亲和层析）（亲和层析）紫外分光光紫外分光光度计检测度计检测三、实验器材三、实验器材恒温震荡培养箱、超净工作台、天平、高速冷冻离心机、制冰机。、超声波细胞破碎仪、ompW 重组大肠杆菌、试剂、玻璃器皿等四、四、实验内容1 1、实验设计及菌种活化、实验设计及菌种活化实验整体设计方案的确定 培养基及溶液的配制工程菌接种培养配制溶液配制溶液 每组试管、三角烧瓶培养基各一份；每组试管、三角烧瓶培养基各一份；PBSPBS全班全班2 2升；升； 培养基灭菌后加卡那霉素。培养基灭菌后加卡那霉素。菌种活化菌种活化 取菌种接种于取菌种接种于10ml10ml的的LBLB培养基中（试管）培养基中（试管），3737，190r/min190r/min摇床培养过夜。摇床培养过夜。溶液配方溶液配方1 1LBLB培养基培养基（1L1L） 蛋白胨蛋白胨 10g 10g 酵母膏酵母膏 5g 5g NaCl 10g NaCl 10g 用用 NaOH NaOH溶液调溶液调pHpH至至7.47.4，高压灭菌。，高压灭菌。2 2卡那卡那/LB/LB液体培养基液体培养基中，按终浓度中，按终浓度50g/ml50g/ml加入卡那霉素（母液浓度加入卡那霉素（母液浓度为为0.25g/ml0.25g/ml）3 3PBSPBS（pH7.4pH7.4）（1L1L） NaCL 8g KCL 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 用用 HCL HCL调节溶液的调节溶液的pHpH至至7.47.4，高压灭菌后，保存于室温。，高压灭菌后，保存于室温。2、 工程菌的发酵培养及诱导表达工程菌的发酵培养及诱导表达实验内容实验内容工程菌的发酵培养工程菌的发酵培养诱导表达外源蛋白诱导表达外源蛋白离心收集菌体离心收集菌体配制液体配制液体实验操作实验操作1 1摇瓶发酵表达摇瓶发酵表达 将试管中活化的菌种接入三角烧瓶，将试管中活化的菌种接入三角烧瓶，37，190r/min摇菌培养摇菌培养34小时，加入小时，加入IPTG至终浓度至终浓度为为1mmol/L（母液（母液0.1mol/L），），37诱导表达诱导表达3-4小时。小时。2 2菌体收集菌体收集诱导表达完毕后，诱导表达完毕后，4 10000rpm离心离心10min，PBS缓冲液清洗一次后同样条件离缓冲液清洗一次后同样条件离心后再次收集菌体。心后再次收集菌体。-20保存备用。保存备用。3 3配制包含体洗涤液（明天用）配制包含体洗涤液（明天用）包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液I I：包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液IIII：包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液IIIIII：变性液变性液（300mL)变性液：变性液： 100MLTris 1.2114gEDTA 0.0584g2-硫苏糖醇硫苏糖醇 0.154 g 尿素尿素 48.048g HCl 调至调至pH 7.5包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液I：（：（1L）Tris 6.057g浓浓HCl 2mLEDTA 0.584gNaCl 5.85gTriston X-100 5 mL尿素尿素 240.24g包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液II （1L）Tris 6.057g浓浓HCl 2mL EDTA 0.584g NaCl 5.85g Triston X-100 3mL包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液III （1L）Tris 12.114g浓浓HCl 3mLEDTA 0.584g 2-硫苏糖醇（硫苏糖醇（DTT） 1.54 g 以下为每升溶液配方以下为每升溶液配方3、破菌及包涵体的变性、破菌及包涵体的变性实验内容实验内容菌体的破碎菌体的破碎包涵体的分离包涵体的分离包涵体的洗涤包涵体的洗涤标准曲线的绘制标准曲线的绘制实验操作：实验操作：（1 1）悬浮菌体悬浮菌体：离心收集的菌体，用：离心收集的菌体，用5050毫升毫升PBSPBS（pH 7.4pH 7.4）悬浮菌体。）悬浮菌体。（2 2）超声破碎超声破碎：冰浴条件下超声波裂解细菌，：冰浴条件下超声波裂解细菌，功率功率400W400W，5s/5s,5s/5s,直至溶液变为半透明。直至溶液变为半透明。（3 3）收集包涵体沉淀：）收集包涵体沉淀：10000rpm10000rpm离心离心20min20min，弃上清，收集包涵体沉淀。，弃上清，收集包涵体沉淀。（4 4）包涵体的洗涤）包涵体的洗涤S沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液I I，充分混匀。，充分混匀。44，10000rpm10000rpm，离心，离心10min10min，弃去上清。，弃去上清。S沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液IIII，充分混匀。，充分混匀。44，10000rpm10000rpm，离心，离心10min10min，弃去上清。，弃去上清。S沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液IIIIII，充分混匀。，充分混匀。44，10000rpm10000rpm，离心，离心10min10min，弃去上清。，弃去上清。4、包涵体变性及复性包涵体的变性包涵体的变性测变性液蛋白含量测变性液蛋白含量复性复性配制亲和层析缓冲液配制配制亲和层析缓冲液配制（1 1）变性）变性 将包涵体沉淀按将包涵体沉淀按5%5%（V/VV/V）的稀释度用变性液）的稀释度用变性液悬浮，室温静置悬浮，室温静置3030分钟，分钟，10000rpm10000rpm离心离心30min30min，留，留上清。上清。（2 2）用）用紫外吸收法紫外吸收法测变性液蛋白含量测变性液蛋白含量 利用标准曲线，根据测出的未知样品的利用标准曲线，根据测出的未知样品的A280A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量。值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 （3 3）复性）复性将溶解后的蛋白质将溶解后的蛋白质150 ug/ml150 ug/ml稀释（稀释（100100200ug/ml200ug/ml），以），以PBSPBS低温透析，换透析低温透析，换透析液一次，透析过夜。液一次，透析过夜。洗脱缓冲液洗脱缓冲液B B NaH2PO4 6.00g NaCL 1.755g 咪唑 27.23 g 用高浓度NaOH调pH至8.0。（4）配制亲和层析缓冲液配制）配制亲和层析缓冲液配制（以下为每升配方）（以下为每升配方）平衡缓冲液平衡缓冲液A Na2HPO4 1.42 g KH2PO4 0.245 g NaCL 8.19g KCL 0.201 g 用高浓度用高浓度NaOH调调pH至至8.0。介质洗涤液介质洗涤液0.5M NaOH5 5、亲和层析及样品检测、亲和层析及样品检测k亲和层析k用紫外分光光度计初步检测样品亲和层析操作亲和层析操作（1）样品处理）样品处理 透析液透析液pH用高浓度用高浓度NaOH调调pH至至8.0待上样。待上样。（2）上样）上样 将样品以滴管沿壁轻轻加到平衡好的将样品以滴管沿壁轻轻加到平衡好的Ni-IDA上。上。（3）洗涤杂蛋白）洗涤杂蛋白 以平衡缓冲液洗以平衡缓冲液洗5个柱体积。个柱体积。（4）洗脱）洗脱 以咪唑洗脱液洗洗以咪唑洗脱液洗洗5个柱体积并收集洗脱液个柱体积并收集洗脱液 （5）介质清洗用10倍体积0.5M NaOH过柱，保证介质与NaOH溶液接触时间达到30分钟以上。用10介质倍体积去离子水洗去层析柱中的碱液。用510倍介质体积平衡缓冲液A平衡层析柱。思考题：1、发酵培养后加入IPTG的作用是什么2、为什么要对包涵体进行洗涤？3、亲和层析液分光光度计检测结果分析4、纯化后得到的表达蛋白还可用哪些方法定性检测或定量检测？5、菌种活化和发酵培养时，培养基中加入抗生素的目的是什么？