第八章 人工种子 人工种子概述繁殖体种类及其培养技术人工种子制备人工种子研究及应用前景第一节 人工种子概述人工种子人工种子( (artificial seeds)artificial seeds)亦称体细胞种子。亦称体细胞种子。 早期的人工种子概念是：体细胞胚经过人工种皮早期的人工种子概念是：体细胞胚经过人工种皮包被后而形成的体细胞种子。包被后而形成的体细胞种子。 任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。n根据包被的程度可将人工种子分为三大类：根据包被的程度可将人工种子分为三大类： 裸露的或休眠的繁殖体 如微鳞茎，微块茎等。它们在不加包被的情况下也具有较高的成株率。 人工种皮包被的繁殖体 一些体细胞胚、原球茎等不能过度干燥，但只需要用人工种皮包被即可维持良好的发芽状态，如胡萝卜体细胞胚。 水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体 大多数体细胞胚、不定芽、茎尖等均需要先包埋在半液态凝胶中，再经人工种皮包裹才能避免失水，从而维持良好的发芽能力。 根据繁殖体的类型可分为两类：根据繁殖体的类型可分为两类： 一类是体细胞胚人工种子； 另一类是非体细胞胚人工种子 n据报道，目前已对据报道，目前已对2626个科，个科，3636个属的植物进行了人工种子研究。个属的植物进行了人工种子研究。其研究范围显示出两大特点：其研究范围显示出两大特点： 一是重要经济作物和粮食作物的人工种子报道日益增多； 二是以微器官为繁殖体的报道日益增多，其中包括微芽、微枝、原球茎、小鳞茎、小块茎等。在无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种性，又可以使之具有实生苗的复壮效应； 可以对优异杂种种子不通过有性制种而快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植物更具有主要的适用意义； 对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍体、非整倍体、工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大繁殖应用； 与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的危险； 与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输。 马铃薯薯试管管块茎人工种茎人工种子子试管管块茎人工茎人工种子田种子田间种植种植第二节 繁殖体的种类及其培养技术 繁殖体是人工种子的主体，早期的研究认为，体细胞胚是人工种繁殖体是人工种子的主体，早期的研究认为，体细胞胚是人工种子制备的最佳繁殖体。子制备的最佳繁殖体。 以体细胞胚作为繁殖体并不适用于所有的植物：遗传变异更大；以体细胞胚作为繁殖体并不适用于所有的植物：遗传变异更大；许多植物的体细胞胚诱导十分困难。许多植物的体细胞胚诱导十分困难。 微器官作为人工种子繁殖体的报道日益增多。微器官作为人工种子繁殖体的报道日益增多。 19901990年，有关人工种子的报道以体细胞胚为繁殖体的占年，有关人工种子的报道以体细胞胚为繁殖体的占63.6%63.6%，以芽为繁殖体的报道占，以芽为繁殖体的报道占36.4%36.4%； 19941994年，以体细胞胚为繁殖体的报道则只占年，以体细胞胚为繁殖体的报道则只占48.8%48.8%，以芽为繁，以芽为繁殖体的占殖体的占38.1%38.1%，另有，另有13.1%13.1%为其它类型的繁殖体。为其它类型的繁殖体。 不同类型繁殖体比较繁殖体生产一不同繁殖体的比较体细胞胚体细胞胚 形成需要经过至少两形成需要经过至少两个阶段：个阶段： 第一阶段，在含高生第一阶段，在含高生长素浓度的培养基中，长素浓度的培养基中，诱导培养胚性细胞；诱导培养胚性细胞； 第二阶段，在较低生第二阶段，在较低生长素或无生长素的培长素或无生长素的培养基中形成体细胞胚。养基中形成体细胞胚。微芽微芽 发生一般只需一个发生一般只需一个培养程序，但有时培养程序，但有时为了增加繁殖体的为了增加繁殖体的数量，也需进行一数量，也需进行一定次数的继代。定次数的继代。 微型变态器官微型变态器官 块茎、块根以及鳞块茎、块根以及鳞茎、球茎类的繁殖茎、球茎类的繁殖体产生可能需要经体产生可能需要经过不同的诱导程序。过不同的诱导程序。 植物植物种种类繁殖繁殖体体类型型培养程序培养程序及培养天及培养天数数培养基培养基及蔗糖及蔗糖浓度度激素激素浓度（度（mg./L）其它成分其它成分(mg/L)2,4-DNAAZeatinBAKin体体细胞胚胞胚StepI,21MS,3%2.01.01.0LH(100)StepII,21MS,3%0.11.00.5LH(100),谷氨谷氨酰胺胺(500)微芽微芽21MS,3%0.05-0.25.0桉桉树体体细胞胚胞胚StepI,20B5,4-5%2.0-4.01.0StepII,28-56改良改良H,3%0.2-0.50.5ADE(40)微芽微芽25改良改良H,3%0.2-0.50.5-2.0ADE(40)茶茶树体体细胞胚胞胚StepI,28MS,4%0.5-1.01.00.5StepII,30MS,2-3%1.00.5GA(0.3),IAA(0.3-0.5)不定不定芽芽25MS,2-3%1.01.0IAA(0.3)华腺腺萼木萼木体体细胞胚胞胚StepI,25MS,3%1.00.21.0StepII,20MS,0.2-0.3%0.21.0不定不定芽芽25MS,2-3%0.010.2IAA(0.3),GA(0.1)兰花花原球原球茎茎25MS,2%0.1椰子汁椰子汁(10%)部分植物繁殖体部分植物繁殖体诱导培养条件培养条件（引自引自陈正正华等，等，1998）芥菜芥菜型油型油菜菜不同繁殖体成苗所需不同繁殖体成苗所需时间及成株率（及成株率（引自引自陈正正华等，等，1998）植植物物繁殖体繁殖体类型型正常株数正常株数百分比百分比非正常株数非正常株数百分百分比比成苗所需成苗所需天数天数茶茶树体体细胞胚胞胚171783831060不定芽不定芽777713132025华腺萼木腺萼木体体细胞胚胞胚475342474060不定芽不定芽466933472025二. 繁殖体培养技术体细胞胚培养体细胞胚培养微型变态器官培养微型变态器官培养微芽繁殖体培养微芽繁殖体培养体细胞胚规模化生产n作为人工种子繁殖体的体细胞胚，其基本要求是要具有作为人工种子繁殖体的体细胞胚，其基本要求是要具有发育上的同步性，还必需满足如下标准特征：发育上的同步性，还必需满足如下标准特征： 其一，形态正常，具有完整的胚结构；其一，形态正常，具有完整的胚结构； 其二，与母体植物的基因型基本相同，特别是在重要经济性状和其二，与母体植物的基因型基本相同，特别是在重要经济性状和农艺性状上没有变异；农艺性状上没有变异； 其三，具有较好的成熟性，能耐一定程度的脱水。其三，具有较好的成熟性，能耐一定程度的脱水。 其次，作为实用化的体细其次，作为实用化的体细胞胚种子还必需满足一定胞胚种子还必需满足一定的数量需求，规模化生产的数量需求，规模化生产是其基本前提。是其基本前提。 Choi等（2002）建立了人参体细胞胚大规模液体培养体系，每500ml容器可生产体细胞胚12,000个。在体细胞发育至子叶期早期，将其转入二分之一MS无机盐附加9%蔗糖浓度的培养基中诱导加入休眠，获得了良好效果。 其它一些植物如芹菜、苜宿等体细胞胚的批量化培养也取得类似结果。 微型变态器官繁殖体的培养微型变态器官繁殖体的培养 光照：光照：能够形成变态器官的植物常常具有光照周期上的双重需要，能够形成变态器官的植物常常具有光照周期上的双重需要， 光照强度亦是影响变态器官形成的重要因素之一。光照强度亦是影响变态器官形成的重要因素之一。 温度：温度：离体培养诱导变态器官形成时，必需充分考虑自然条件下离体培养诱导变态器官形成时，必需充分考虑自然条件下该植物变态器官产生所需要的温度条件。该植物变态器官产生所需要的温度条件。 培养基蔗糖浓度：培养基蔗糖浓度：现有研究资料显示，培养条件下的变态器官形现有研究资料显示，培养条件下的变态器官形成与培养基的蔗糖浓度有关，较高的蔗糖浓度对于一些植物的微型成与培养基的蔗糖浓度有关，较高的蔗糖浓度对于一些植物的微型变态器官形成似乎是必要条件。变态器官形成似乎是必要条件。 激素：激素：植物变态器官的形成常常发生在内源激素发生某种变化以植物变态器官的形成常常发生在内源激素发生某种变化以后，外源激素的调控主要通过内源激素的变化而起作用，而不同培后，外源激素的调控主要通过内源激素的变化而起作用，而不同培养条件下的内源激素水平又具有很大差异。养条件下的内源激素水平又具有很大差异。 芽繁殖体的培养n大多数情况下，微芽、不定芽的培养往往直接从外植体上直接诱大多数情况下，微芽、不定芽的培养往往直接从外植体上直接诱导形成，培养方式简单，且勿需高浓度的激素处理，因此所产生导形成，培养方式简单，且勿需高浓度的激素处理，因此所产生的繁殖体基本保持了原有植物的品种特性。的繁殖体基本保持了原有植物的品种特性。 根据植物类型不同，可选取不同的外植体类型作为芽产生的来源，根据植物类型不同，可选取不同的外植体类型作为芽产生的来源，如非洲紫罗兰一般选用叶片为外植体，诱导不定芽作为微繁殖体；如非洲紫罗兰一般选用叶片为外植体，诱导不定芽作为微繁殖体；榆树类植物则可选根作为外植体产生微芽；石竹类花卉可以茎尖榆树类植物则可选根作为外植体产生微芽；石竹类花卉可以茎尖为外植体培养侧芽作为繁殖体。为外植体培养侧芽作为繁殖体。第三节 人工种子包被 繁殖体繁殖体预处理理繁殖体包埋繁殖体包埋人工种皮装配人工种皮装配一繁殖体的处理体细胞胚形成后，需要在无激素培养基上经过一定阶段的后熟培体细胞胚形成后，需要在无激素培养基上经过一定阶段的后熟培养，然后进行脱水干燥，再将畸形胚选出后才能进行包埋。在脱养，然后进行脱水干燥，再将畸形胚选出后才能进行包埋。在脱水之前用水之前用ABAABA处理体细胞胚强迫其进入休眠，更有利于长期贮存。处理体细胞胚强迫其进入休眠，更有利于长期贮存。 微型变态器官繁殖体不能过度脱水，但亦需要适当干燥，除去表微型变态器官繁殖体不能过度脱水，但亦需要适当干燥，除去表面及多余的水分，同时要进行表面消毒处理以繁殖包被后的感染。面及多余的水分，同时要进行表面消毒处理以繁殖包被后的感染。为了延长贮存时间，亦需根据使用季节进行适当的休眠处理。为了延长贮存时间，亦需根据使用季节进行适当的休眠处理。 芽为繁殖体的类型，则不能进行脱水处理，但必需筛选生长健壮、芽为繁殖体的类型，则不能进行脱水处理，但必需筛选生长健壮、组织充实的芽进行包埋。组织充实的芽进行包埋。 二繁殖体的包埋n包埋介质的要求：包埋介质的要求： 首先必需是对繁殖体及其它生物是无毒的，并具有一定的缓冲强首先必需是对繁殖体及其它生物是无毒的，并具有一定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输和种植操作中的安全。度，以保证繁殖体在生产、运输和种植操作中的安全。 同时，它最好能够提供类似于胚乳的营养物质，以供繁殖体发芽同时，它最好能够提供类似于胚乳的营养物质，以供繁殖体发芽的需要。的需要。 此外由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到微生物感染危害，此外由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到微生物感染危害，因此介质中还应含有适当的杀菌剂。因此介质中还应含有适当的杀菌剂。 n常用的两种人工胚乳液配方：常用的两种人工胚乳液配方： MSMS（或或SHSH、WhiteWhite）培养基加入培养基加入1.5%1.5%的马铃薯淀粉水解物；的马铃薯淀粉水解物； SHSH（0.50.5）培养基加入培养基加入1.5%1.5%的麦芽糖。的麦芽糖。 几种植物人工种子的附加成分及成苗率（引自陈正华等，1998）植物及繁殖体海藻酸钠浓度()培养基及蔗糖浓度激素及其浓度（mg/L）成苗率（）四会贡柑体细胞胚3MT，4%GA(1),IBA(0.25)30-70（无菌）唐菖蒲小球茎4-5MS，1.5%IBA(0.5),GA(0.1)93（无菌）热带兰花球茎4改良MSNAA(1.0),BA(0.2)95（无菌）赤桉微芽4改良HNAA(0.2-0.5)80-90（无菌）小麦体细胞胚61/4MSGA(1),防腐剂(200),IAA(0.2),活性炭45（有菌）n以海藻酸钠作包埋剂以海藻酸钠作包埋剂的操作程序是：的操作程序是： 在配制好的海藻酸钠在配制好的海藻酸钠溶液中，按一定比例溶液中，按一定比例加入繁殖体并混匀。加入繁殖体并混匀。 将其逐滴滴入将其逐滴滴入2.0%-2.0%-2.5%2.5%的的CaClCaCl2 2溶液中，溶液中，经经20203030min.min.的离子的离子交换作用即形成含有交换作用即形成含有繁殖体具有一定刚性繁殖体具有一定刚性的人工种子，的人工种子， 用无菌水漂洗用无菌水漂洗2020min.min.以终止反应。以终止反应。 图5.5多头自动人工种子包被系统示意图。1.双活塞泵；2.灭菌器； 3.加湿器；4.振动器； 5.脉动腔膜；6.同轴沟；7.脉动腔； 8.喷碟； 9.旁路系统；10.反应池；11.搅拌子；12.硬化溶液及其输入。（引自Brandenberger和Widmer，1998）。baca.番木瓜体细胞胚人工种子（Castillo等，1998）；b.b.马铃薯微芽人工种子（Patel等，2000）；c.c.人参体细胞种子（Choi和Jeong，2002）。三人工种皮的装配n理想的人工种皮应该是：理想的人工种皮应该是： 具有一定的封闭性以保证人工胚乳的各种成分不易流失，具有一定的封闭性以保证人工胚乳的各种成分不易流失，同时又具有良好的透气性。同时又具有良好的透气性。 具有一定的坚硬度，以加强人工种子的耐储运性和适于具有一定的坚硬度，以加强人工种子的耐储运性和适于机械化操作。机械化操作。 无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽。无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽。 配制简单易行，成本低。配制简单易行，成本低。 n常用的人工种皮材料常用的人工种皮材料 早期使用Elvax 4260涂膜，价格昂贵，操作复杂、包裹效果不尽人意。 新近试验使用的二氧化硅化合物材料包括疏水的Tullanox和微亲水的Cab-O-Sil，二者均可以粉末状包裹在人工种子胶囊外层，操作时只需将胶囊在上述材料中滚动即可完成包被过程，操作简单易行，大量生产还可以机械化操作。 最近还报道一种硅酮种衣，它不仅可以抗真菌，而且可渗入水蒸气和氧气，这些材料均还处于试验之中。 第四节 人工种子实用化的策略 n陈正华等（陈正华等（19981998）对人工种子的应用提出了如下策略：）对人工种子的应用提出了如下策略： 微器官人工种子可能最先用于无性繁殖植物微器官人工种子可能最先用于无性繁殖植物 微器官人工种子可用于天然种子繁殖后代群体变异大的植物微器官人工种子可用于天然种子繁殖后代群体变异大的植物 以体细胞胚为繁殖体应用的可能性及需要注意的问题以体细胞胚为繁殖体应用的可能性及需要注意的问题 一微器官人工种子可能首先用于无性繁殖植物微器官如微芽，试管块茎、试管鳞茎等作为繁殖体时，成苗率高微器官如微芽，试管块茎、试管鳞茎等作为繁殖体时，成苗率高且出苗整齐一致，具有田间应用的可行性，同时且出苗整齐一致，具有田间应用的可行性，同时, ,离体培养的繁离体培养的繁殖体可完全去除病原物，因而已越来越多地用于无性繁殖种苗生殖体可完全去除病原物，因而已越来越多地用于无性繁殖种苗生产中。产中。 传统上的试管苗由于体积大、对携带储运条件要求苛刻因而限制传统上的试管苗由于体积大、对携带储运条件要求苛刻因而限制了使用规模。如果利用人工种子将有可能首先实现无性繁殖植物了使用规模。如果利用人工种子将有可能首先实现无性繁殖植物种子生产的彻底革命。种子生产的彻底革命。 以微芽为繁殖体的人工种子技术，有可能首先在无性繁殖的果树、以微芽为繁殖体的人工种子技术，有可能首先在无性繁殖的果树、花卉、林木等植物中得以应用。花卉、林木等植物中得以应用。 马铃薯人工种子应用马铃薯人工种子应用二微器官人工种子可用于天然种子繁殖后代群体变异大的植物 有些植物如桉树，虽然能够用天然种子繁殖，但种子繁有些植物如桉树，虽然能够用天然种子繁殖，但种子繁殖的植株群体变异大，树体不整齐。殖的植株群体变异大，树体不整齐。 不定芽试管苗繁殖技术已在生产上显示了树体整齐的优不定芽试管苗繁殖技术已在生产上显示了树体整齐的优越性，目前以微芽为繁殖体的人工种子技术已经建立。越性，目前以微芽为繁殖体的人工种子技术已经建立。 桉树人工种子在土壤中的成苗率已可达桉树人工种子在土壤中的成苗率已可达80%80%以上，且树以上，且树体十分整齐。体十分整齐。 三以体细胞胚为繁殖体应用的可能性及局限性 花或果实为经济产品的多年生植物如果树等，有可能出花或果实为经济产品的多年生植物如果树等，有可能出现较长的幼年期，使开花结果推迟，且还可能出现果实现较长的幼年期，使开花结果推迟，且还可能出现果实不整齐的现象。不整齐的现象。 以营养器官或木材为产品的植物中，以及在以改善生态以营养器官或木材为产品的植物中，以及在以改善生态环境、保护濒危树种或对性状一致性要求不严格的植物环境、保护濒危树种或对性状一致性要求不严格的植物中，体细胞胚繁殖体则具有其它繁殖体不可替代的优越中，体细胞胚繁殖体则具有其它繁殖体不可替代的优越性。性。