授课教师：田宝玉授课教师：田宝玉授课教师：田宝玉授课教师：田宝玉EMAIL:TIANBYFJNU.EDU.CNEMAIL:TIANBYFJNU.EDU.CNPHONE:13067359543PHONE:13067359543基因工程基因工程Genetic Engineering切切接接转转增增检检基因工程内容和步骤基因克隆和基因克隆和DNA分析（分析（第第5版版）第一部分第一部分 基因克隆和基因克隆和DNA分析的基本原理分析的基本原理第1章 为什么说基因克隆与DNA分析非常重要第2章 基因克隆的载体质粒和噬菌体第3章 从活细胞中纯化DNA第第4章章 DNA纯化后的利用纯化后的利用第5章 将DNA引入活细胞第6章 大肠杆菌的克隆载体第7章 真核生物的克隆载体第8章 怎样获得特定基因的克隆第9章 聚合酶链反应（PCR）第二部分第二部分 基因克隆和基因克隆和DNA分析在研究中的应用分析在研究中的应用第10章 基因的位置和结构的研究第11章 基因表达和功能的研究第12章 基因组研究第三部分第三部分 基因克隆和基因克隆和DNA分析在生物技术中的应用分析在生物技术中的应用第13章 克隆基因的表达第14章 基因克隆和DNA分析在医学中的应用第15章 基因克隆和DNA分析在农业中的应用第16章 基因克隆和DNA分析在法医学和考古学中的应用第第4章章 DNA纯纯化后的利用化后的利用DNA操作酶DNA连接酶DNA限制性内切酶4.1 DNA操作酶的范围核酸酶（nuclease）连接酶（ligase）聚合酶（polymerase）修饰酶（modifying enzyme）拓扑异构酶（topoisomerase）其它4.1 DNA操作酶的范围4.1.1 核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶定义：打断DNA链中连接相邻核苷酸的磷酸二酯键4.1 DNA操作酶的范围4.1.1 核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶分类：外切核酸酶和内切核酸酶从DNA分子的末端一个一个地切除核苷酸链在一个DNA分子内部打开磷酸二酯键4.1 DNA操作酶的范围4.1.1 核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶外切核酸酶（单链或双链切割）-Bal31Bal31：同时对DNA分子的双链末端一个一个地切除核苷酸链越来越短单核苷酸4.1 DNA操作酶的范围4.1.1 核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶外切核酸酶（单链或双链切割）-核酸外切酶核酸外切核酸外切酶酶：可以从DNA双链中一条链的3 末端一个一个地切除核苷酸链产物：单链DNA分子（不能作用于单链分子）4.1 DNA操作酶的范围4.1.1 核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶内切核酸酶（单链或双链切割）-S1核酸酶S1核酸核酸酶酶：催化单链DNA分子降解成为5单核苷酸作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子4.1 DNA操作酶的范围4.1.1 核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶内切核酸酶（单链或双链切割）-DNaseDNase（脱氧核糖核酸酶） ：打开DNA分子内部任意的磷酸二酯键（包括单链和双链）产物为单核苷酸与寡核苷酸或单核苷酸（可以用在RNA提取中去除DNA）4.1 DNA操作酶的范围4.1.1 核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶内切核酸酶（单链或双链切割）-限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶：能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶基因工程中主要工具酶-一把特殊的剪刀4.1 DNA操作酶的范围4.1.2 连接酶：将两个核酸分子连接起来的酶连接酶：将两个核酸分子连接起来的酶DNA连接酶DNA连连接接酶酶（ （ligase） ）：在一条DNA链的3末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团（-P）的情况下，能够催化在2条DNA链之间形成的磷酸二酯键4.1 DNA操作酶的范围缺口（nick）裂口（gap）4.1 DNA操作酶的范围4.1.3 聚合酶：复制核酸分子的酶聚合酶：复制核酸分子的酶DNA聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶：能够合成一条与一直模板DNA或者RNA互补的新DNA双链要素：模版和引物4.1 DNA操作酶的范围4.1.3 聚合酶：复制核酸分子的酶聚合酶：复制核酸分子的酶种类很多，基因工程中常用到四种（1）DNA聚合酶（大肠杆菌）DNADNA聚合酶聚合酶：当DNA双链分子中存在一个单链缺口时，DNA聚合酶与单链区域结合，合成一条新链，替换并降解原来存在的那段DNA具备DNA合成和水解双重酶活性4.1 DNA操作酶的范围4.1.3 聚合酶：复制核酸分子的酶聚合酶：复制核酸分子的酶（2）Klenow片段（DNA聚合酶一部分）DNADNA聚合酶聚合酶的合成酶活性和水解酶活性是由酶分子的不同部分控制，其中酶分子前段325个氨基酸具有水解酶活性，切掉这一部分后，剩下的部分则只具有聚合酶活性，剩下的DNA聚合酶片段称为KlenowKlenow片段片段，在基因工程中可以用来补缺口4.1 DNA操作酶的范围4.1.3 聚合酶：复制核酸分子的酶聚合酶：复制核酸分子的酶（3）Taq DNA聚合酶（PCR）TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶是一种来源于嗜热菌Thermus aquaticus的高度热稳定的DNA聚合酶，95孵育时的半衰期大于40分钟4.1 DNA操作酶的范围4.1.3 聚合酶：复制核酸分子的酶聚合酶：复制核酸分子的酶（4）反转录酶（病毒，依赖于RNA的DNA聚合酶）反转录酶反转录酶是以RNA为模版合成互补的DNA链（cDNA）4.1 DNA操作酶的范围4.1.4 修饰酶：去除或添加化学基团的酶修饰酶：去除或添加化学基团的酶（1）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）碱性磷酸酶碱性磷酸酶：去除DNA分子5末端的磷酸基团4.1 DNA操作酶的范围4.1 DNA操作酶的范围4.1.4 修饰酶：去除或添加化学基团的酶修饰酶：去除或添加化学基团的酶（2）多核苷酸激酶（polynucleotide kinase）多核苷酸激酶多核苷酸激酶：在DNA分子5游离末端添加磷酸基团（活性正好和碱性磷酸酶相反碱性磷酸酶相反）4.1 DNA操作酶的范围4.1.4 修饰酶：去除或添加化学基团的酶修饰酶：去除或添加化学基团的酶（3）末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶：在DNA分子3末端添加一个或多个脱氧核苷酸构建人工粘性末端，不需要模板4.1 DNA操作酶的范围4.1.5 拓扑异构酶：向共价闭合环状拓扑异构酶：向共价闭合环状DNA中引入或消除双螺旋的酶中引入或消除双螺旋的酶限制性内切酶的发现和功能限制性内切酶II在特定的核苷酸序列处切割DNADNA分子中识别序列的出现频率在实验室条件下进行限制性酶切对限制性内切酶的酶切结果进行分析DNA分子大小的估计4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶通过作图标出一个DNA分子上的不同限制性位点平末端和黏末端4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶准确可重复4.2.1 限制性内切酶的发现和功能限制性内切酶的发现和功能4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶20世纪50年代宿主调控性限制4.2.1 限制性内切酶的发现和功能限制性内切酶的发现和功能4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶1970年年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。等分离出第一种限制性核酸内切酶。Werner Arber 理论预见限制酶理论预见限制酶Daniel Nathans 用限制酶切得用限制酶切得SV40 DNA片断片断Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶得到第一个限制酶1978年年Nobel生理或医学生理或医学奖奖4.2.1 限制性内切酶的发现和功能限制性内切酶的发现和功能4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶目前为止，在细菌中已经发现了目前为止，在细菌中已经发现了12001200多种限制性内切酶，分为三类：多种限制性内切酶，分为三类：I.I. 其识别位点与切割位点相距其识别位点与切割位点相距1000-5000bp1000-5000bp，切割位点不表现严格的切割位点不表现严格的特异性特异性；2 2条链上的断裂位点相距条链上的断裂位点相距70-7570-75个核苷酸；个核苷酸；II.II. 识别序列具有特异性识别序列具有特异性，且序列为旋转对称性，切割位点位于限制性，且序列为旋转对称性，切割位点位于限制性内切酶识别序列之内，限制性内切酶的功能核甲基化酶的功能分开；内切酶识别序列之内，限制性内切酶的功能核甲基化酶的功能分开；是基因工程中常用的内切酶；是基因工程中常用的内切酶；III.III. 由由R R、MSMS亚基共同组成，其中亚基共同组成，其中MSMS亚基具有位点识别和甲基化修饰的亚基具有位点识别和甲基化修饰的双重功能；双重功能；R R亚基具有内切酶活性。切割位点位于识别位点的一侧若亚基具有内切酶活性。切割位点位于识别位点的一侧若干碱基对处，无序列特异性，而只与识别位点的距离有关，从干碱基对处，无序列特异性，而只与识别位点的距离有关，从7-7-26bp26bp不等。在与识别位点结合之后，修饰作用和限制作用取决于两不等。在与识别位点结合之后，修饰作用和限制作用取决于两个亚基之间的竞争。个亚基之间的竞争。限制性内切限制性内切酶的分的分类4.2.1 限制性内切酶的发现和功能限制性内切酶的发现和功能4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶I I和和IIIIII型型酶酶识别识别序列特点：序列特点： 一般具有内切一般具有内切酶酶和甲基化和甲基化酶酶的活性，的活性， 识别识别或切割或切割位点不恒定，位点不恒定， 不不具具备备用来做工具用来做工具酶酶， ，IIII型型酶酶识别识别序列特点：序列特点： 均有均有严严格的格的识别识别特定核苷酸的序列特定核苷酸的序列， ， 识别识别的核苷酸序列一般在的核苷酸序列一般在4 48 8个碱基个碱基对对 大多数大多数识别识别位点具有位点具有180180度旋度旋转对转对称的称的结结构形式构形式4.2.1 限制性内切酶的发现和功能限制性内切酶的发现和功能4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.2 限制性内切酶限制性内切酶II在特定核苷酸序列处切割在特定核苷酸序列处切割DNA4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.2 限制性内切酶限制性内切酶II在特定核苷酸序列处切割在特定核苷酸序列处切割DNA命名：命名：400400余种余种IIII类酶，鉴定的识别和切割位点有类酶，鉴定的识别和切割位点有300300多种，商品化多种，商品化100100多种，多种，DNADNA重组技术中常用的有重组技术中常用的有2020多种。多种。其命名书写规则：其命名书写规则：以生物体属名的第一个大写字母和种名的前以生物体属名的第一个大写字母和种名的前2 2个小写字母构成酶的基本个小写字母构成酶的基本名称；名称；若酶在一个特殊菌株上发现，则将株名的第一个字母加在基本名称之若酶在一个特殊菌株上发现，则将株名的第一个字母加在基本名称之后；后；若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则还用一个大写字母若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则还用一个大写字母表示这些非染色体的遗传因子；表示这些非染色体的遗传因子；酶最后的部分为罗马字母，表明该生物发现此酶的先后顺序。酶最后的部分为罗马字母，表明该生物发现此酶的先后顺序。如如HindIIIHindIII 表明在表明在HeamophilusHeamophilus influenzaeinfluenzae d d菌株种发现的第菌株种发现的第3 3种种酶；酶； EcoRIEcoRI 表明在表明在Escherichia coliEscherichia coli的抗药性的抗药性R R质粒上发现的第一质粒上发现的第一个酶个酶4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.2 限制性内切酶限制性内切酶II在特定核苷酸序列处切割在特定核苷酸序列处切割DNA4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.2 限制性内切酶限制性内切酶II在特定核苷酸序列处切割在特定核苷酸序列处切割DNAII 型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的1800旋转对称型回文结构回文结构5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的识别序列4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.2 限制性内切酶限制性内切酶II在特定核苷酸序列处切割在特定核苷酸序列处切割DNA回文结构回文结构 如如HindIIIHindIII AAGCTT AAGCTT TTCGAA TTCGAA HapIIHapII CCGG CCGG GGCC GGCC Cfr13I Cfr13I GGNCC GGNCC CCNGG CCNGG Eco81I Eco81I CCTNAGG CCTNAGG GGANTCC GGANTCC Not I Not I GCGGCCGC GCGGCCGC CGCCGGCG CGCCGGCG 4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.3 平末端和黏末端平末端和黏末端4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.3 平末端和黏末端平末端和黏末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 55 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH PPstI等产生的3粘性末端4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.3 平末端和黏末端平末端和黏末端同尾酶：有些来源不同的酶尽管其识别的序列不同，但是其切割出的同尾酶：有些来源不同的酶尽管其识别的序列不同，但是其切割出的DNADNA片段片段是有相同的粘性末端。是有相同的粘性末端。4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.4 DNA分子中识别序列的出现频率分子中识别序列的出现频率理论上：GATC 每44 = 256个碱基 出现一次GGATCC 每46 = 4096个碱基 出现一次实际上识别位点发生的频率从要小一点（如识别6个碱基的BamHI，BglII，SalI）4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.4 DNA分子中识别序列的出现频率分子中识别序列的出现频率限制性酶切位点通常称不会均匀分布于DNA分子中4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.5 在实验室条件下进行限制性酶切在实验室条件下进行限制性酶切如何做一个酶切反应：（1） 2ug DNA 浓缩到125ug/ml （不高不低，纯）16ul（2） 限制性内切酶 BglII （4U/ul） 一个酶单位（U）定义为一定温度（通常为37度）下1小时内切割1ugDNA所需要的酶量 2ug DNA 需要2U即 4U/ul X 0.5ul（3） 缓冲液（buffer） 10X4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.5 在实验室条件下进行限制性酶切在实验室条件下进行限制性酶切设计一个最普通的酶切体系设计一个最普通的酶切体系总体系 20ul10buffer H 2ul切割的DNA分子 16ul限制性内切酶 BglII (4u/ul) 0.5ulH2O 其余用H2O补齐体系 37 2小时4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.5 在实验室条件下进行限制性酶切在实验室条件下进行限制性酶切影响限制性内切酶活性的因素：影响限制性内切酶活性的因素：1.1.酶活定义：指在最适反应条件下（因酶而异，包括最适反应温度，酶活定义：指在最适反应条件下（因酶而异，包括最适反应温度，最适缓冲条件），经过最适缓冲条件），经过1 1小时反应将小时反应将1ugDNA1ugDNA完全分解所需要的酶量，完全分解所需要的酶量，称为酶活单位；称为酶活单位；2.2.影响酶活的因素：影响酶活的因素：a.a.DNADNA的纯度：限制性内切酶消化的纯度：限制性内切酶消化DNADNA底物的反应效率，很大程度上底物的反应效率，很大程度上取决于所使用取决于所使用DNADNA本身的纯度，而本身的纯度，而DNADNA制剂中的某些物质，如蛋白制剂中的某些物质，如蛋白质、酚、氯仿、酒精、质、酚、氯仿、酒精、EDTAEDTA以及以及SDSSDS等都可以抑制酶的活性。如果等都可以抑制酶的活性。如果DNADNA纯度不够，可以采用扩大反应体系来稀释杂质含量；纯度不够，可以采用扩大反应体系来稀释杂质含量；b.b.酶切消化的反应温度：大多数限制性内切酶的标准反应温度是酶切消化的反应温度：大多数限制性内切酶的标准反应温度是3737，也存在许多例外条件，如，也存在许多例外条件，如BamHI30, AccIII60BamHI30, AccIII60，TaqITaqI 65;65;在实际试验中,甲基化和星号活性是很少的. 大多数切不开都与自己的体系或者DNA质量有关.4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.6 对限制性内切酶的酶切结果进行分析对限制性内切酶的酶切结果进行分析标准电泳不能区分大小凝胶电泳可区分大小4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.6 对限制性内切酶的酶切结果进行分析对限制性内切酶的酶切结果进行分析表3-1 琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA大小范围的关系琼脂糖凝胶浓度/（%） 可分辨的线性DNA大小范围/（kb）0.3 6050.6 2010.7 100.80.9 70.51.2 60.41.5 40.22.0 30.1更小的DNA片段区分可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，40%聚丙烯酰胺凝胶电泳区分1-300bp的片段实验室通常操作的DNA片段在0. 5-10kb左右，所以一般使用0.8-1%的琼脂糖凝胶基因组则一般使用0.5-0.7的的琼脂糖凝胶4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.6 对限制性内切酶的酶切结果进行分析对限制性内切酶的酶切结果进行分析上样缓冲液： 6上样缓冲液 ： ： 0.25% 溴酚蓝， 0.25% 二甲苯青 FF ， 30% 甘油。 （40%蔗糖）4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.6 对限制性内切酶的酶切结果进行分析对限制性内切酶的酶切结果进行分析4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.6 对限制性内切酶的酶切结果进行分析对限制性内切酶的酶切结果进行分析凝胶中DNA分子的可视化EB在紫外照射下能把DNA分子显示出来Gelred，SYBR Green，Goldview等放射自显影（检测极微量的DNA）4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.7 DNA分子大小的估计分子大小的估计4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.8 通过作图标出一个通过作图标出一个DNA分子上的限制性酶切位点分子上的限制性酶切位点4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.8 通过作图标出一个通过作图标出一个DNA分子上的限制性酶切位点分子上的限制性酶切位点4.3 连接-将DNA连接在一起4.3 连接-将DNA连接在一起4.3.1 DNA连接酶的作用模式连接酶的作用模式5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG4.3 连接-将DNA连接在一起连接方式：连接方式：连接方式：连接方式： 相同粘性末端的连接相同粘性末端的连接 平头末端的连接平头末端的连接 不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接4.3 连接-将DNA连接在一起4.3.2 黏末端可增加连接的效率黏末端可增加连接的效率一般情况下，平末端只有黏末端连接效率的一般情况下，平末端只有黏末端连接效率的1/10-1/1001/10-1/100。4.3 连接-将DNA连接在一起4.3.2 黏末端可增加连接的效率黏末端可增加连接的效率如何提高平末端的连接效率如何提高平末端的连接效率（1 1）提高）提高DNADNA分子的浓度，增加末端接触的机会分子的浓度，增加末端接触的机会 （2） 例如，载体具有黏末端，DNA分子具有平末端，采取如下方法：4.3.3 黏末端可增加连接的效率黏末端可增加连接的效率 DNA DNA接头接头（linkerlinker）4.3 连接-将DNA连接在一起4.3.2 黏末端可增加连接的效率黏末端可增加连接的效率 寡核苷酸接头寡核苷酸接头4.3 连接-将DNA连接在一起4.3.2 黏末端可增加连接的效率黏末端可增加连接的效率 寡核苷酸接头寡核苷酸接头4.3 连接-将DNA连接在一起4.3.2 黏末端可增加连接的效率黏末端可增加连接的效率 通过附加同聚物反应产生黏末端通过附加同聚物反应产生黏末端4.3 连接-将DNA连接在一起平头末端的连接：平头末端的连接：不同粘性末端的连接：4.3 连接-将DNA连接在一起普通连接反应的设计：普通连接反应的设计：总体系 10ul10buffer 1ulVector (3k;500ng/ul) 1ulDNA fragment(500bp;50ng/ul) 3ulLigase 0.5-1ulH2O2 加水至10ul反应在16度过夜