实时荧光定量PCR介绍宝生物工程（大连）有限公司8/19/2024实时荧光定量PCR介绍28/19/2024主要内容RealTimePCR基础知识12RealTimePCR实验方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR应用实例实时荧光定量PCR介绍38/19/2024RealTimePCR基础知识1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的检测方法RealTimePCR基础知识1实时荧光定量PCR介绍48/19/2024Real Time PCR的用途的用途RealTimePCRRealTimePCR用途用途定性分析定性分析定量分析定量分析病毒及病原菌定量分析导入基因拷贝数解析GMO定量检测差异显示结果验证基因芯片结果验证siRNA效果确认mRNA表达量分析病毒及病原菌检测物种鉴定基因分型绝对定量绝对定量相对定量相对定量实时荧光定量PCR介绍58/19/2024RealTimePCR的原理 激激发光光发射射光光使用RealTimePCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。RealTimePCRCt值实时荧光定量PCR介绍68/19/2024RealTimePCR基础知识1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的检测方法RealTimePCR基础知识1实时荧光定量PCR介绍78/19/2024TaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.SYBRSYBRGreenIGreenI荧光染料嵌合法荧光探针法RealTimePCR的检测方法实时荧光定量PCR介绍88/19/2024荧光染料嵌合法（SYBRGreenI）SYBRGreenI：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenISYBRGreenI实时荧光定量PCR介绍98/19/2024Primer退退 火火 FFFFSYBR Green I 法法作用机理示意图作用机理示意图Pol.FPrimerPol.延延 伸伸 FFFFFFPrimer热变性热变性 FFFF实时荧光定量PCR介绍108/19/2024TaqMan法作用机理法作用机理TaqMan探针为一寡核苷酸，5端标记一个报告基团（Reporter），3端标记一个淬灭基团（Quencher）。RQ实时荧光定量PCR介绍118/19/2024RQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.热变性热变性 退退 火火 延延 伸伸 TaqManProbe法原理示意图 实时荧光定量PCR介绍128/19/2024 One-Step RT-PCR特异性高多重PCR检出Probe设计要求高Probe法 Probe合成费用高SYBRGreenI法与Probe法比较常用于mRNA表达量分析等SYBRGreenI法 简便易行价格便宜要求反应的特异性不能进行多重PCR常用于SNP解析，病毒、病源菌检测实时荧光定量PCR介绍138/19/2024主要内容2RealTimePCR实验方法反转录反应反转录反应RealTimePCRRealTimePCR反应反应实时荧光定量PCR介绍148/19/2024RTPrimer的选择 RandomPrimerOligodTPrimerGeneSpecificPrimerRandom6merPrimerGeneSpecificPrimerOligodTPrimerPCRR-PrimerPCRF-Primer实时荧光定量PCR介绍158/19/2024目的片段在距Poly(A)Tail1.5kbp以内适用，RT效率较高。OneStepRT-PCR只能使用GeneSpecificPrimer，但不适用于复数基因的检出。53GeneSpecificPrimer目的片段RFAAAAAA53目的片段RF1,500baseOligodTPrimerRandom目的片段53RF目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表达量分析最适。OligodTPrimer53RFAAAAAA目的片段Random适用于mRNA表达量分析，提升反应检测的灵敏度。RTPrimer的选的选择择实时荧光定量PCR介绍168/19/2024RealTimePCR引物设计引物设计目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。RealTimePCR用引物与普通用引物与普通PCR引物设计要求不同引物设计要求不同=对引物设计要求严格普通普通PCR引物引物RealTimePCR引物引物实时荧光定量PCR介绍178/19/2024两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值 Tm值40-60%(最好45-55%)GC含量Primer长度80-150bp(尽量限制在300bp以内)扩增片段大小17-25base使用BLAST检索，确认引物特异性 特异性 引物内部或两条引物之间避免3base以上的互补序列 引物3末端避免2base以上的互补序列 互补性3末端序列 整体上碱基不能过偏 个别部分避免GCrich或ATrich(特别是3端) 避免T/C连续，A/G连续序列 3末端避免GCrich或ATrich 3末端碱基最好为G或C 3末端碱基尽量避免为T尽量在Exonjunction上设计引物，限制基因组DNA扩增 RT-PCR用引物RealTimePCR引物设计原则引物设计原则实时荧光定量PCR介绍188/19/2024探针的Tm比引物高8-10 Tm值20-24bp Probe长度探针5末端的第一个碱基不能是G5末端序列 目的序列GC含量相对较高的区域设计 整体上碱基不能过偏 个别部分避免GCrich或ATrich(特别是3端)；避免T/C连续，A/C连续序列Probe内部或Probe与两条引物之间避免3base以上的互补序列 互补性BLAST检索确认Probe特异性 特异性RealTimePCR用TaqMan探针设计原则RealTimePCR探针设计原则实时荧光定量PCR介绍198/19/2024线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认PCR扩增效率（E）：0.8-1.235Cycles内可得到好的定量结果。如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增。NoTemplateControl确认30Cycles内无引物二聚体产生。相关系数（r2）：大于0.98反应性能确认实时荧光定量PCR介绍208/19/2024主主 要要 内内 容容3RealTimePCR解析方法1.标准曲线分析2.融解曲线分析3.绝对定量和相对定量解析方法实时荧光定量PCR介绍218/19/2024标准曲线制作扩增曲线标准曲线标准品梯度的选择：56个梯度标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为1010510410310210110010105 5 10104 4 10 103 3 10 102 2 10101 1 10100 0实时荧光定量PCR介绍228/19/2024标准品的种类 基因组基因组DNA质粒质粒TotalRNA&cDNA体外转录体外转录RNADNA样品定量标准品RNA样品定量标准品实时荧光定量PCR介绍238/19/2024质粒标准品构建流程基因组DNAPCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因目的基因质粒质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101copies/ul，作为标准品。实时荧光定量PCR介绍248/19/2024体外转录RNA标准品构建流程RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101copies/ul，作为标准品。T7RNApolymerase体外转录RNATotalRNAPCRcDNARTT7PromoterTTTTTPCR产物产物目的基因目的基因目的基因AAAAAAAAAA实时荧光定量PCR介绍258/19/2024理想的标准品扩增曲线基线平整NegativeControl为水平线指数区较明显，陡度大平台区汇于一起线性范围宽实时荧光定量PCR介绍268/19/2024理想的标准曲线理想的标准曲线 相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。扩增效率 相关系数 扩增效率（E）计算方法 标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct值时E=10-1/a-1标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10)E=10-a-1实时荧光定量PCR介绍278/19/2024RealTimePCR解析方法3RealTimePCR解析方法1.标准曲线分析2.融解曲线分析3.绝对定量和相对定量解析方法实时荧光定量PCR介绍288/19/2024融解曲线分析 Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。 SYBRGreenI法进行检出时，要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。实时荧光定量PCR介绍298/19/2024特异性产物特异性产物非特异产物非特异产物引物二聚体引物二聚体对PCR产物特异性进行分析融解曲线分析实时荧光定量PCR介绍308/19/20243RealTimePCR解析方法1.标准曲线分析2.融解曲线分析3.绝对定量和相对定量解析方法Real Time PCR解析方法解析方法实时荧光定量PCR介绍318/19/2024绝对定量解析方法提取样品引物设计标准品制备RealTimePCR反应数据分析流程实时荧光定量PCR介绍328/19/2024绝对定量解析方法通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。10105 510104 410103 310101 1扩增曲线图标准曲线图 检测样品检测样品10102 2实时荧光定量PCR介绍338/19/2024相对定量解析方法以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正，进行相对表达量分析。SampleBSampleA目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同进行相对表达量分析必要性实际上目的基因表达量分析实时荧光定量PCR介绍348/19/2024相对定量解析方法相对定量解析方法管家基因管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因, , 如如：GAPDH、-actin等。等。筛选方法筛选方法 根据文献提供根据文献提供 通过具体实验筛选通过具体实验筛选实时荧光定量PCR介绍358/19/2024主要内容RealTimePCR基础知识12RealTimePCR实验方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR应用实例 对SARS病毒基因进行定量分析绝对定量绝对定量相对定量相对定量 分析小鼠PAH基因在不同组织中的表达量变化实时荧光定量PCR介绍368/19/2024绝对定量应用例对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量检测方法TaqManprobe法检测样品3个从SARS样品中提取的TotalRNA目的基因SARS病毒RNA内参SARSInternalControlRNA标准品SARSControlRNA试剂OneStepPrimeScriptRT-PCRKit（PerfectRealTime）（DRR064）仪器SmartCycler实时荧光定量PCR介绍378/19/2024SYN247F02SYN247R03SYN247F01SYN247R02SYN247R01SYN247F01BamHHindpBluescriptIISK(+)VectorT7PromoterBamHHindSacsiteSARSControlRNA构建绝对定量应用例对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量实时荧光定量PCR介绍388/19/2024 纯化的SARSControlRNAOD值测定结果 体外转录的SARSControlRNA电泳照片M1 M1 M2M2M1: -HinddigestM2:DL2,000MarkerDNaseI处理前DNaseI处理后绝对定量应用例对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量实时荧光定量PCR介绍398/19/2024 DNABNITMSARAs2 Adaptor R BNITMSARAs2 Adaptor R SacSacsite site Bam Bam Hsite Hsite BNITMSARS1 Adaptor F BNITMSARS1 Adaptor F T7 PromoterT7 PromoterSARSInternalControlRNA的构建A AA ApBluescriptIISK(+)Vector 绝对定量应用例对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量实时荧光定量PCR介绍408/19/2024探针的选择 TemplatePrimerTaqManProbe5端报告基团3端淬灭基团SARSControlRNAorSARSGenomicRNA共用FAM标记Eclipse标记SARSInternalControlRNA共用ROX标记Eclipse标记绝对定量应用例对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量实时荧光定量PCR介绍418/19/2024SARSControlRNA105-101扩增曲线SARSGenomicRNASample1、扩增曲线 SARSInternalControlRNA扩增曲线 标准曲线绝对定量应用例对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量实时荧光定量PCR介绍428/19/2024定量结果对三个样品所含SARS病毒RNA进行了准确定量。绝对定量应用例对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量实时荧光定量PCR介绍438/19/2024相对定量应用例分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况检测方法SYBRGreenI荧光嵌合法管家基因GAPDH基因目的基因PAH基因标准品cDNA试剂PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（DRR047）SYBRPremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)（DRR820）仪器ThermalCyclerDiceRealTimeSystem（TP800）实时荧光定量PCR介绍448/19/2024TotalRNA提取TotalRNA基因组DNA去除标准品RNA制备标准曲线制作及预实验详细的实验资料获取实验设计及引物设计、合成样品RealTimePCR反应相对定量计算及数据分析数据整理及论文撰写相对定量应用例分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况实时荧光定量PCR介绍458/19/2024提取TotalRNA后电泳照片提取试剂：TaKaRaRNAisoPlus（D9108）相对定量应用例分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况M C L B M M：DL2,000DNAMarkerC：ControlRNAL：LiverRNAB：BrainRNA实时荧光定量PCR介绍468/19/2024目的基因标准曲线制作结果扩增曲线图融解曲线图标准曲线图管家基因标准曲线制作结果相对定量应用例分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况实时荧光定量PCR介绍478/19/2024扩增曲线图样品目的基因定量结果样品管家基因定量结果管家基因GAPDH目的基因PAH定量结果平均值定量结果平均值通过GAPDH校正的PAH校正值小鼠肝脏和脑中PAH的相对表达量样品a12288002221751966002011750.9053757212700204400样品a2227300207100219900196600样品b133360034097576.8082.182.4110-4134030092.65样品b235410082.4633590076.80相对定量应用例分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况实时荧光定量PCR介绍488/19/2024通过双标准曲线方法计算得出，苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因在小鼠肝脏中的表达量明显高于其在脑组织中的表达水平，二者的表达量比例约为3757：1。相对定量应用例分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况实时荧光定量PCR介绍498/19/2024RealTimePCR试剂使用SYBRGreenI法检测使用探针法检测使用荧光探针检测使用Cycling探针检测扩增的模板GC含量高或含有重复序列实时荧光定量PCR介绍508/19/2024RealTimeRT-PCR试剂使用SYBRGreenI法检测使用探针法检测使用荧光探针检测使用Cycling探针检测实时荧光定量PCR介绍518/19/2024高质量的产品、完善的服务High Quality Products& Rapid Reliable Service 刚才的发言，如刚才的发言，如有不当之处请多指有不当之处请多指正。谢谢大家！正。谢谢大家！52