新药临床前毒理学评价PreclinicalToxicologicalEvaluationofNewDrug1新药临床前毒理学评价Contents目的意义急性毒性试验(acute)长期毒性试验(chronic)特殊毒性试验(遗传、生殖、致癌)其它毒性试验(过敏、刺激etc.)药物非临床研究质量管理规范（GLP）SFDA新药审评会案例学习2新药临床前毒理学评价Acute Toxicity Test概念、目的意义传统方法基本内容和要求有关问题其它实验方法3新药临床前毒理学评价Concept动物单次或24h内多次给予受试物后，一定时间内(14天)所产生的毒性反应毒理研究早期阶段进行4新药临床前毒理学评价目的意义(DO STAR)毒性剂量 Toxic Dose安全剂量范围 Safety margin 毒性反应 Toxic reaction: 性质、程度、量 毒关系、产生、达峰、持续时间及反复产生 毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性 寻找毒性反应靶器官 Target Organ 毒性反应是否可逆 Reversibility解毒或解救措施 Antidote确保临床用药安全(重点监测指标)5新药临床前毒理学评价目的意义q阐明药物毒性作用及强度、计算相对毒性参数 q了解毒性靶器官q为长毒、特殊毒性试验剂量设计q为期临床试验起始剂量选择q为临床毒副反应监护提供参考q其它 (DO STAR)6新药临床前毒理学评价OECD口服急性毒性分级等 级LD50高毒（Very Toxic)25 mg/kg有毒（Toxic)25200 mg/kg有害（Harmful)2002000 mg/kg不分级（Unclassified)2000 mg/kg7新药临床前毒理学评价相对毒性参数 治疗指数TI=LD50/ED50安全系数SF=LD5/ED95可靠或确实安全系数CSF=LD1/ED99安全范围SM=(LD1/ED99-1)X100%SED50/ED50,越大越安全qLD5基本无害量ED95基本有效量qLD1肯定无害量ED99肯定有效量8新药临床前毒理学评价为临床毒副反应监护提供参考 中毒症状,起始、持续、恢复时间中毒靶器官对抗试验为临床急救提供依据 9新药临床前毒理学评价为长毒等试验选择剂量提供依据 长期毒性剂量设计qLD50法 (1/10, 1/50, 1/100)qMTD法 ( 1, 1/3, 1/10)生殖毒性试验高剂量为母鼠MTD主要药效学剂量限度、一般药理学和药动学剂量设计也要参考急性毒性的LD5010新药临床前毒理学评价为特殊毒性试验选择剂量提供依据 致突变试验q啮齿类动物微核试验高剂量为1/2 LD50q果蝇伴性隐性致死试验的高、低剂量分别为1/2 LD50和1/4 LD50q精原细胞染色体畸变试验高剂量=1/2 LD50 短期致癌试验高剂量=MTD11新药临床前毒理学评价I 期临床选择起始剂量提供参考 细胞毒类抗癌药，I期临床起始剂量= 1/10 LD5012新药临床前毒理学评价其 它系列化合物的合格率分析(除理化性质为主外)也参考LD50复方药物的相互作用, 也可通过拆方及合用的LD50来判别相互作用性质比较不同途径的LD50，获得一些生物利用度信息，为剂型开发提供参考13新药临床前毒理学评价基本原则 执行GLP整体性具体问题具体分析阶段性随机、对照、重复方法公认14新药临床前毒理学评价动 物获得尽量多信息前提下，使用尽量少动物 啮齿类-小鼠或大鼠 非啮齿类-犬或猴二种动物(啮齿类及非啮齿类)小鼠18-22g; 大鼠120-150g; 犬用成年犬 初始体重不应超过或低于平均体重的20%各半 (勤俭办事，服从命令)15新药临床前毒理学评价受 试 物工艺稳定、符合临床用质量标准标明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，附质检报告辅料、溶剂、试剂等应标明批号、规格和生产厂家，符合试验要求 16新药临床前毒理学评价受 试 物原料药 临床拟用剂型复方制剂：复方 + 拆方 (增毒？新毒？)易降解：含降解产物量最高的受试物进行急毒试验，并与临床样品的急毒试验结果比较17新药临床前毒理学评价给药途径临床拟用途径 + 原型药物较完全进入循环途径（如静脉注射）啮齿类ig给药前应禁食12h，不禁水18新药临床前毒理学评价剂量和分组 给药剂量：未见毒性量严重毒性量设空白和/或溶媒（辅料）对照小动物4-6个剂量组, 组距0.65-0.85,求LD50大动物可用50%等量递升法(近似致死剂量法), 求出ALD和MTD，不必达到致死量 19新药临床前毒理学评价给药容积 不等浓度等容量给药常规及最大给药容量为: 动物给药途径 给药量 小鼠 ig0.2-1.0 ml/20giv、ip、sc0.1-0.5 ml/20g大鼠 ig1.0-2.0 ml/100giv、ip、sc0.5-1.0 ml/100g20新药临床前毒理学评价观察指标及时间药后4h内详观, 后每天上下午各一,观察14d记录毒性反应、死亡情况, 中毒症状、发生时间、持续时间、严重程度、恢复期及动物最短、最长死亡时间其它指标：一般指标、体重变化等21新药临床前毒理学评价观 察指指 征征 可能涉及的器官、组织、系统 . 鼻孔呼吸阻塞，呼吸频率和 深度改变，体表颜色改变A AE ECNS，感官，神经肌肉等 .运动功能：运动频率和特点的改变A AJ JCNS，感官，神经肌肉等.惊厥(抽搐)：随意肌明显的无意识收缩或惊厥性收缩A AE ECNS,CNS,呼吸衰竭,神经肌肉,自主神经 .反射A AF F感官，神经肌肉 .眼检指征A AH H自主神经；出血，感染 .心血管指征A AE E自主神经,CNS,心输出量降低等.唾液分泌 A A自主神经 .竖毛 A A自主神经 .痛觉丧失 A A感官，CNS .肌张力A AB B自主神经等 .胃肠指征A AB B自主神经，胃肠动力等.皮肤A AB B刺激性，炎症，过敏等急性毒性研究的一般观察和指征 22新药临床前毒理学评价病理学检查 大体解剖(濒死动物+死亡动物+存活动物)组织病理学检查: 体积、颜色、质地等改变时23新药临床前毒理学评价结果处理 实验资料用Bliss法计算LD50。必要时求不同性别LD50 表. XXX急性毒性结果及LD50计算剂剂 量量 对数剂量对数剂量 动物数动物数 死亡动物数死亡动物数 死亡率死亡率 机率单位机率单位 LD50及可信限及可信限(mg/kg) (X) (只只) (只只) % (Y) (mg/kg)24新药临床前毒理学评价结果处理剂量反应、时间反应关系反应可能涉及组织、器官或系统肉眼病变和组织病检，初步判断毒性靶器官病检报告应附：病检者签名+单位盖章+病理照片 确定NOAEL、MTD、ALDetc，初步判断受试物的安全范围25新药临床前毒理学评价综合评价判断反应与药物作用相关性：q时间、发生率、剂量-反应关系q动物种属及背景数据q病理学检查结果q同类药物特点安全范围、毒性严重程度及可恢复性毒性作用靶器官q毒性可能涉及部位q大体解剖和组织病理学检查结果26新药临床前毒理学评价注意问题光化学治疗药和辐射增敏剂急毒试验照光+不照光分别测定LD50复方(a+b)中各组分毒性相互作用评价27新药临床前毒理学评价注意问题充分重视预试毒理学界对LD50看法q试验结果（信息）的一部分qLD50测定不足：v动物消耗量大v获得信息有限v测得数值不准28新药临床前毒理学评价EPA Policies Discourages the use of the ClassicalLD50testUsesStructurallyRelatedActivities(SRA)toobviatetheneedfortestingonanimalsRecommendstheLimittest29新药临床前毒理学评价EPA PoliciesBeyondtheLimit,recommendsqapproximatelethaldoseqtheup-and-downmethods30新药临床前毒理学评价近似致死剂量法(非啮齿类动物)6只健康Beagle犬或猴。犬6-12 m，猴2-3 y 估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。按50%递增法，设计出剂量序列表 31新药临床前毒理学评价First32新药临床前毒理学评价最低致死剂量 最高非致死剂量 最低致死剂量 最高非致死剂量OR近似致死剂量范围 近似致死剂量范围 Second33新药临床前毒理学评价MTD法最大允许浓度和最大允许容积仍未测出LD50, 可只求MTD值一次或24h多次(总量5g/kg)给20只动物q观察14d, 未见死亡, 则MTD XX g/kg; 个别死亡, 则写成LD50 XX g/kgqiv要求 pH 5-8，速度：大、小鼠 10-20sqig时空腹, 即禁食12-16h左右34新药临床前毒理学评价常用容量和最大容量(ml)给药途径小鼠20g大鼠200g豚鼠400g家兔1.5kg犬10kgig0.2-1.01.0-4.01.0-5.05.0-10.0 50-100ip0.2-1.01.0-3.02.0-5.05.0-10.05-15im0.1-0.20.2-0.50.2-0.50.5-1.02-5iv0.2-0.51.0-2.01.0-5.03.0-10.035-50sc0.1-0.50.5-1.00.5-2.01.0-3.03-1035新药临床前毒理学评价最大无毒性反应剂量（noobservedadverseeffectlevel,NOAEL)：指受试物在一定时间内，按一定方式与机体接触，用灵敏的现代检测方法和观察指标未发现损害作用的最高剂量最小毒性反应剂量：动物出现毒性反应的最小剂量最大耐受量（maximaltolerancedose，MTD）：不引起受试动物死亡的最高剂量最小致死剂量（minimallethaldose，MLD）：引起个别受试动物出现死亡的剂量半数致死量（medianlethaldose,LD50）：在一定试验条件下引起50%受试动物死亡的剂量。36新药临床前毒理学评价长 期 毒 性 试 验 Long-term Toxicity Study目的意义基本内容和要求有关问题Mechanic?Innovative?37新药临床前毒理学评价目的意义(DOSTAR)毒性剂量ToxicDose安全剂量范围Safetymargin毒性反应Toxicreaction:性质、程度、量毒关系、产生、达峰、持续时间及反复产生毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性寻找毒性反应靶器官TargetOrgan毒性反应是否可逆Reversibility解毒或解救措施Antidote确保临床用药安全(重点监测指标)38新药临床前毒理学评价基本原则 执行GLP整体性具体问题具体分析阶段性随机、对照、重复方法公认39新药临床前毒理学评价ProcedureAnimalsHousingDrugRouteDosageGroupDurationIndexRecoveryTimeReport（动饲药径剂组周指恢时报告）40新药临床前毒理学评价Animalinvitro体系筛选实验动物种属或品系理想动物q对受试物生物转化与人体相近q对受试物敏感q已有大量历史对照数据41新药临床前毒理学评价Animals rodent non-rodent rat beagle dog mouse monkey42新药临床前毒理学评价Animal二种动物，啮齿类首选大鼠，非啮齿类用Beagle犬, 必要时用猴、猪等符合等级要求 来源、品系、遗传背景清楚，有动物质量合格证 大鼠6-9 w， Beagle犬6-12 m,体重CV20各半 必要时，可用疾病模型动物进行试验 Duration 6m, natural death ( rat: 1y-15%, 1.5y-50%, 2y-70-80%) (勤俭办事，服从命令）43新药临床前毒理学评价XXX 体外代谢种属比较研究代谢产物Area(%)人猴犬大鼠小鼠M0原形84.763.247.686.278.5M1去乙基5.6327.79.877.3516.4M2-1羟基化-0.268.190.170.69M2-2羟基化0.290.468.480.35-结合体内动物药代结果用大鼠和猴进行安评结合体内动物药代结果用大鼠和猴进行安评动物选择44新药临床前毒理学评价XXXX西地那非已上市药枸橼酸钠西地那非改酸根（化4）PDE5抑制剂，治疗男性ED选用雄性动物进行下列试验急性毒性（大鼠、小鼠）安全药理学（小鼠、犬）须与已上市药物进行对比 （已上市药需国外进口或买不到时？）动物选择45新药临床前毒理学评价治疗HER2阳性乳腺癌药物治疗妇女HER2阳性乳腺癌用雌性动物进行一般毒理学研究厂家要求选用雌雄各半动物，何故？动物选择46新药临床前毒理学评价HousingT,humidity,light,ventilation,animalfeedsRat:5/cageorseparated，acclimation1wDog:TBtest,anthelminticacclimation:1-2w/1m47新药临床前毒理学评价饲养管理主要因素动物类别小鼠、大鼠豚鼠、家兔犬温度()20-2618-2818-28湿度40-70%40-70%40-70%换气次数10-15次/h10-15次/h10-15次/h气流速度13-18cm/s13-18cm/s13-18cm/s压力正压正压负压洁净度100000级100000级落下细菌3个/皿3个/皿照明150-300Lux150-300Lux噪声60db60db臭气氨浓度20ppm氨浓度20ppm48新药临床前毒理学评价Drug test article / solvent / excipient name, batch No. , source, specification, purity, preserve condition, etc same quality criterion 49新药临床前毒理学评价Route与临床用药途径一致临床iv , 大鼠给药1月，ip代替im或sc应变换注射部位必要时改变给药途径但应说明原因50新药临床前毒理学评价模拟临床给药途径纤维蛋白胶：犬腹腔给药小儿止泻贴剂：相当于脐部给药途径方式51新药临床前毒理学评价DoseandGroup三个给药组,单位：mg(IU)/kg或mg(IU)/m2不等浓度等容量给药低剂量组高于有效剂量，不出现毒性中剂量组轻微或中等度毒性高剂量组明显/严重毒性，或个别动物死亡空白对照溶媒或赋形剂q溶媒或赋形剂有毒性时则增加正常对照组阳性对照52新药临床前毒理学评价DoseandGroup大鼠各15只/组大动物各5只/组53新药临床前毒理学评价特例：等浓度不等容量给药白蛋白：疗效与蛋白浓度有关紫杉醇脂肪乳：乳剂的比例影响紫杉醇安全性途径方式54新药临床前毒理学评价Corresponddurationofclinicalad.withanimalad.clinicalad.durationanimalad.duration2w1m2w1m3m3m6m3m6m(rat)9m(dog)duration3mad.6dayweekly(Mon.toSat.)55新药临床前毒理学评价 药物临床疗程啮齿类非啮齿类可支持临床研究阶段2周1个月1个月1个月II期3个月3个月III期（生产）3个月3个月3个月II期6个月6个月III期（生产）6个月6个月6个月II期6个月9个月III期（生产）6个月6个月9个月II期6个月9个月III期（生产）注：表中给药期限均为最短给药期限，不包括恢复期，均为完整试验56新药临床前毒理学评价Index-Clinical Examinations rodent non-rodent signs of ill health +pupil , T behavioral changes breath, sialosis reaction to treatment vomitingDead or moribund animal: necropsy within 1h57新药临床前毒理学评价Index-Hematology受试物对造血系统有影响，应重视骨髓检查细胞计数RedBloodCell(RBC)血红蛋白Hemoglobin(Hb)红细胞容积Hematocrit(Hct)平均红细胞容积(MCV)平均红细胞血红蛋白(MCH)平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)网织红细胞计数Reticulocyte白细胞计数及其分类WBC&DC血小板计数Platlet凝血酶原时间ProthrombinTime(PT)58新药临床前毒理学评价Index-ClinicalChemistry天门冬氨酸氨基转换酶AspartateAminotransferase(AST)丙氨酸氨基转换酶AlanineAminotransferase(ALT)碱性磷酸酶AlkalinePhosphatase(ALP)肌酸磷酸激酶CreatinePhosphokinase(CPK)尿素氮BloodUreaNitrogen（BUN）肌酐Creatinine（Cr）总蛋白TotalProtein（TP）白蛋白Albumin（Alb）血糖Glucose(Glu)总胆红素TotalBilirubin（Tbill）总胆固醇TotalCholesterol（Tch）甘油三酯Triglyceride(TG)-谷氨酰转移酶（非啮齿类动物）-GT(non-rodent)钾离子浓度K氯离子浓度Cl钠离子浓度Na59新药临床前毒理学评价Index-Urinalysis尿液外观Colorandappearance比重SpecificgravitypH值pHvalue尿糖Glucose尿蛋白Protein尿胆红素Bilirubin尿胆原Urobilinogen酮体Ketones潜血Blood白细胞WBC亚硝酸盐Nitrite镜检*Microscopyofcentrifugeddeposit60新药临床前毒理学评价Index-Pathology称重并计算系数心脏heart肝脏liver脾脏spleen肺脏lung肾脏kidneys脑brain肾上腺adrenals胸腺thymus睾丸testes附睾epididymides子宫uterus卵巢ovariescalculateorganweightsrelativetobodyweight,pairedorgansweightogether61新药临床前毒理学评价Index-Pathology病检脏器组织脑（大脑、小脑、脑干）脊髓（颈、胸、腰段）垂体胸腺甲状腺甲状旁腺食管唾液腺胃小肠和大肠肝脏胆囊*肾脏肾上腺脾脏胰腺气管肺62新药临床前毒理学评价Index-Pathology病检脏器组织主动脉心脏附睾睾丸卵巢子宫前列腺乳腺坐骨神经膀胱眼（发现异常时）*视神经*给药局部骨髓淋巴结（包括给药局部淋巴结、肠系膜淋巴结）63新药临床前毒理学评价Index-Pathologyheartliverspleenlungkidneybrainadrenalspancreasstomachduodenumjejunumileumcoloncecum（盲）pituitarythymusspinalcordprostatetestesepididymidesuterusovariesopticnerveinjectionsiteboneandmarrowurinarybladderlymphnodes(mesenteric,local)thyroid¶thyroidlobes64新药临床前毒理学评价脏器取材样式（SOP)肺脏脑65新药临床前毒理学评价01 肝脏02030405 肾脏 膀胱 心脏 肺06 脾脏 胸腺07 甲状腺08 气管09 脑垂体10胃切片中组织排列和方向66新药临床前毒理学评价IndexECG,Eye大动物长期毒性必须做 ECG观察指标：心率、P波电压、P-R间期、R波电压、QRS时间、ST段、T波电压和Q-T间期67新药临床前毒理学评价RecoveryObservation : 1/31/2 animal, 26w Late toxic reaction and reversibility Items : same as treatment period68新药临床前毒理学评价测试次数 能反映动态变化 q一般行为、食量每天观察记录q大鼠体重每周一次q大动物生理指标每半月一次q大动物ECG 导联，给药前、给药期间、停药及恢复期均要检测q发现有阳性指标应加大观察密度 69新药临床前毒理学评价Observations Western Chinese Recombinant 34 times 2 times antibody 6m(rat) 9m(dog)Toxic reaction: properties, degree, dose-toxicity relationship, initiating time，peak time, lasted time, late reaction toxicity, accumulating toxi-city, tolerance 70新药临床前毒理学评价Frequencyoflab.investigations rat单个动物，背景数据和文献数据可参考qNon-rodent：数量少、个体差异大，单个动物的试验数据具有重要毒理学意义。须与给药前、对照组和背景数据进行多重比较，文献数据参考价值有限91新药临床前毒理学评价统计学意义和生物学意义有统计学意义并不一定有生物学意义判断因素q数据变化剂量反应关系q其他相关参数改变q与历史背景数据比较q异常数据合理解释 92新药临床前毒理学评价正确判断毒性反应给药组和对照组之间差异来源q与受试物有关的毒性反应q动物对药物适应性改变q正常生理波动判断关注q剂量反应关系q参数变化幅度和性别差异q分析毒理学变化参数关联和机制q单个参数变化判断应慎重q结合TK93新药临床前毒理学评价毒性反应对于临床试验意义种属差异无关毒性：高剂量，非线性动力学代谢特异反应难以检测：头痛、头昏、头晕、腹胀、皮肤搔痒、视物模糊疑毒从有94新药临床前毒理学评价机制研究（探索药理/毒理信号通路）鉴别新分子实体是否有新的药理/毒理作用机制，加深对药物的认识与已有类似药物作用比较，判断是否属于新作用机制采用多种先进的生理、生化和分子生物学方法和技术对机制进行多层次研究例：1971年美国颁布国家癌症法以来，前列腺癌、肝癌、胰腺癌等发病率和/或死亡率没有明显改变95新药临床前毒理学评价Pfizer研发CETP抑制剂损失8亿$96新药临床前毒理学评价Torcetrapib的副作用源自脱靶效应辉瑞公司ILLUMINATE试验详细数据表明torcetrapib提高死亡率可能源于其脱靶效应动物研究发现切除肾上腺，可以阻断torcetrapib的升压效应，验证了醛固酮所起的作用美国转化医学协会的主席BruceLittman指出，torcetrapib事件另一个教训是，当涉及到黑箱机制时，尤其是与安全性有关的问题时，一定不要把所观察到的问题仅仅作为风险那么简单Nat Rev Drug DiscovVOL10|MAR2011|16397新药临床前毒理学评价2011年立普妥专利到期排名 通用名 商品名 公司适应症2009(亿) 2010(亿)1阿伐他汀 立普妥 辉瑞高胆固醇血症124.5114.0辉瑞急切希望torcetrapib弥补2011年立普妥专利到期带来的巨额损失，过度扩大了torcetrapib可能带来的经济效益，偏离了研发的科学性20102015，辉瑞至少失去18个药物的独家专利权。这些药物2009年销售收入达256亿美元，占总收入60%98新药临床前毒理学评价2012年全球处方药市场销售20强排名通用名商品名2012年2011年2010年1阿达木单抗修美乐9379602沙美特罗舒利迭7979863利妥昔单抗美罗华7365514甘精胰岛素来得时6753475曲妥珠单抗赫赛汀6457436立伐他汀拜斯亭6266687英夫利西单抗瑞米凯德6255618阿瓦斯汀贝伐单抗6257569度洛西汀欣百达60423910氯吡格雷波立维539888单位：亿美元99新药临床前毒理学评价排名通用名商品名2012年2011年2010年11依那西普42376212非格司亭纽拉思塔42403813普瑞巴林瑞卡423714西他列汀413315阿托伐他汀立普妥399611416埃索美拉唑耐信39448417孟鲁司特钠顺尔宁39555518依非韦伦Atripla363219布地奈德和福莫特罗信必可323120恩曲他滨和替诺福韦富马酸TRUVADA3229单位：亿美元2012年全球处方药市场销售20强100新药临床前毒理学评价整体性综合评价结合药学、药理学、PK、TK和其它毒理学研究(+临床研究)，利弊权衡，综合评价 找到：不良反应、毒性靶器官、安全范围、临床需重点检测指标及临床监护或解救措施26SCIENCEVOL3347OCT2011人卵细胞培养出胚胎干细胞Cell153,111,June6,2013人卵细胞停滞于减数分裂中期目前还无法进行人类克隆101新药临床前毒理学评价精子指导胚胎早期发育子代继承父源的DNA甲基化图谱，抛弃了母源的图谱，精子中携带的信息指导胚胎的发育Cell153,759772,May9,2013102新药临床前毒理学评价Thefourthmutationallowedthevirustospreadmoreeffectively,infectingferretsinneighbouringcages.3MAY2012|VOL485|NATURE|13103新药临床前毒理学评价22JUNE2012|VOL336|SCIENCE104新药临床前毒理学评价22JUNE2012|VOL336|SCIENCESCIENCE:让人们对H5N1型禽流感病毒的潜在威胁提高警惕，而新数据的公开则有利于降低这一病毒引发人际传播的可能性，激发病毒监控和防治方面的新研究，使世界变得更安全105新药临床前毒理学评价InnovativeAnimalDoseRouteIndexData handling106新药临床前毒理学评价SummaryImportanceObjective(DOSTAR)MethodsStandard&innovative107新药临床前毒理学评价StayHungry求知若渴StayFoolish大智若愚共 勉108新药临床前毒理学评价第二军医大学药物安全性评价中心第二军医大学卫生毒理学教研室谢谢 谢谢! !109新药临床前毒理学评价