琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis1 天天然然琼琼脂脂（agaragar）: :又名琼胶、菜燕、冻粉 是从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。l 琼脂糖（琼脂糖（agaroseagarose）半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷D-D-半乳糖半乳糖2 核核酸酸凝凝胶胶电电泳泳是是分分子子克克隆隆核核心心技技术术之之一一，用用于于分分离离、鉴鉴定和纯化定和纯化DNADNA或或RNARNA片段片段1. 因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2. 对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。3. 凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、 核酸、病毒 等大分子物质。4. 透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6. 样品易回收，常用于制备。琼脂糖凝胶电泳的优点3缺点缺点1. 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。2. 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。3. 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。4. 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 4一、实验目的一、实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNADNA的原理和方法的原理和方法DNADNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。作用下向正极泳动。DNADNA分分子子在在琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中泳泳动动时时，有有电电荷荷效效应应与与分分子子筛筛效效应应。不不同同DNADNA的的分分子子量量大大小小及及构构型型不不同同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。二、实验原理二、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定。具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定。5琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳法法分分离离DNADNA，主主要要是是利利用用分分子子筛筛效效应应，迁迁移移速速度度与与分分子子量量的的对对数数值值成成反反比比关关系系。因因而而就就可可依依据据DNADNA分分子子的的大大小小使使其其分分离离。该该过过程程可可以以通通过过把把分分子子量量标标准准参参照照物物和和样样品品一起进行电泳而得到检测。一起进行电泳而得到检测。溴溴化化乙乙锭锭（Ethidium Ethidium BromideBromide, EBEB）为为扁扁平平状状分分子子，在在紫紫外外光光照照射射下下发发射射荧荧光光。EBEB可可与与DNADNA分分子子形形成成EB-DNAEB-DNA复复合合物物，其其荧荧光光强强度度与与DNADNA的的含量成正比。据此可粗略估计样品含量成正比。据此可粗略估计样品DNADNA浓度。浓度。 6三、实验材料、器具及药品三、实验材料、器具及药品 质粒质粒DNADNA样品。样品。 电电泳泳仪仪，电电泳泳槽槽，电电子子天天平平，移移液液器器，枪枪头头，微微波波炉炉，紫紫外透射检测仪等。外透射检测仪等。 琼琼脂脂糖糖，1XTBE1XTBE电电泳泳缓缓冲冲液液，溴溴化化乙乙锭锭（EBEB），6X6X载载样样缓缓冲液冲液 四、实验步骤四、实验步骤 1g 1g 琼琼脂脂糖糖加加入入100ml 100ml 1TAE1TAE电电泳泳缓缓冲冲液液中中，摇摇匀匀。在在微微波波炉炉中中加加热热至至琼琼脂脂糖糖完完全全溶溶解解。（冷冷却却到到6060，加加入入100l100l的的0.5mg/ml EB0.5mg/ml EB，并摇匀。），并摇匀。）7 用用胶胶带带将将制制胶胶板板两两端端封封好好，插插入入适适当当梳梳子子，将将溶溶解解的的琼脂糖（约琼脂糖（约5050）倒入，室温冷却凝固。）倒入，室温冷却凝固。 充充分分凝凝固固后后撕撕掉掉两两端端的的胶胶布布，将将凝凝胶胶置置入入电电泳泳槽槽中中，加加1TAE1TAE电电泳泳缓缓冲冲液液至至液液面面覆覆盖盖凝凝胶胶1-2mm1-2mm，小小心心垂垂直向上拔出梳子。直向上拔出梳子。 用用移移液液器器吸吸取取总总DNADNA或或质质粒粒样样品品4l4l于于封封口口膜膜上上，再再加加入入2l 2l 的的6X6X载样缓冲液，混匀后，载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔小心加入点样孔。 打打开开电电源源开开关关，调调节节电电压压至至3-5V/cm3-5V/cm，可可见见到到溴溴酚酚蓝蓝条带由负极向正极移动，电泳约条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min30min-60min。8 将将染染色色后后的的凝凝胶胶置置于于紫紫外外透透射射检检测测仪仪上上，盖盖上上防防护护观观察察罩罩，打打开开紫紫外外灯灯，可可见见到到发发出出荧荧光光的的DNADNA条带。条带。 将将凝凝胶胶放放入入EBEB染染液液中中染染色色5-10min,5-10min,用用清清水水稍稍微微漂洗。漂洗。 910111213141516171 2 3 M 18 1 1、DNADNA分子的大小分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比； 2 2、琼脂糖浓度、琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； 3 3、DNADNA的构象的构象 同一分子：超螺旋环状线状切口环状DNA的迁移速率决定因素的迁移速率决定因素194 4、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。5 5、所用的电压、所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。6 6、琼脂糖种类、琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；20 不同类型琼脂糖的性质不同类型琼脂糖的性质 琼脂糖类型琼脂糖类型凝结温度凝结温度/熔化温度熔化温度/ / 标准琼脂糖标准琼脂糖3538353890959095不同厂家生不同厂家生产的不同商产的不同商品其凝结温品其凝结温度和熔化温度和熔化温度有一定差度有一定差异异4042404285908590 高强度琼脂糖高强度琼脂糖3443344385958595 修饰的低熔点修饰的低熔点/ / 凝凝点琼脂糖点琼脂糖253525356365636535356565 超低熔点超低熔点81581540454045 低黏性低熔点琼脂低黏性低熔点琼脂糖糖253025307070383885853030757521不同类型琼脂糖分离不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围片段的范围浓浓 度度（%）标标 准准(kb)高强度高强度(kb)低熔点低熔点(kb)低黏度低溶低黏度低溶点点(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.122常用的电泳缓冲液常用的电泳缓冲液4 保存备用保存备用.7、电泳缓冲液、电泳缓冲液23TAETAE和和TBETBE电泳缓冲液比较电泳缓冲液比较都是常用电泳缓冲液，二者相比：都是常用电泳缓冲液，二者相比：1 1）TAETAE的缓冲容量较低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的的缓冲容量较低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；阳极一侧将发生酸性化；2 2）TBETBE比比TAETAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3 3）双链线状）双链线状DNADNA片段在片段在TAETAE中比在中比在TBETBE中迁移快中迁移快10%10%；4 4）对于高分子质量的）对于高分子质量的DNADNA，TAETAE的分辨率略高于的分辨率略高于TBETBE，对于低分，对于低分子质量的子质量的DNADNA，TAETAE要差些。超螺旋要差些。超螺旋DNADNA在在TAETAE中的电泳分辨率中的电泳分辨率要好于要好于TBETBE。 24凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液载载样样缓缓冲冲液液：临临上上样样到到凝凝胶胶加加样样孔孔之之前前与与待待电电泳泳的的样样品相混合的一种缓冲液。品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：载样缓冲液有三个作用：1 1）增加样品密度保证）增加样品密度保证DNADNA沉入加样孔内；沉入加样孔内；2 2）使样品带有颜色便于简化上样过程；）使样品带有颜色便于简化上样过程；3 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。迁移。2566凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液类型类型6 6 缓冲液缓冲液贮存温度贮存温度I I0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝440.25%0.25%二甲苯氰二甲苯氰40% (m/V)40% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液IIII0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝室温室温0.25%0.25%二甲苯氰二甲苯氰15% 15% 聚蔗糖聚蔗糖(Type400)(Type400)水溶液水溶液IIIIII0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝440.25%0.25%二甲苯氰二甲苯氰30%30%甘油水溶液甘油水溶液IVIV0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝4440% (m/V)40% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液26琼脂糖凝胶中琼脂糖凝胶中DNADNA的检测的检测 通过染色通过染色, , 紫外灯下检测。紫外灯下检测。 主要采用溴化乙锭（主要采用溴化乙锭（ethidium bromide, ethidium bromide, EBEB）染色法。）染色法。2728使用使用EB染色注意事项染色注意事项（1）EB被认为是一种强致癌物质被认为是一种强致癌物质（2）EB可用来检测单链或双链核酸可用来检测单链或双链核酸（3）EB使用时的配制、贮存及使用使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 g/ml 。（4）当要知道）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电情况下电泳，电泳结束后再用泳，电泳结束后再用EB染色。染色。29凝胶中凝胶中DNADNA的成像的成像 可以用透射或入射紫外光对可以用透射或入射紫外光对EBEB染色的凝胶成像，染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。图像可以直接输出到计算机观察。30关于琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法关于琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法几点注意事项几点注意事项1）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整齐，的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。气泡。2）每孔最大）每孔最大DNA上样量决定于上样量决定于DNA样品片段的大小、数目样品片段的大小、数目及样品孔形状与容量。及样品孔形状与容量。3）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。4）在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳极）在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳极槽中反复吸打电泳缓冲液以清洗。（对于槽中反复吸打电泳缓冲液以清洗。（对于Southern印迹转印迹转移和需要回收移和需要回收DNA片段的电泳，则应该每一个样品用一个片段的电泳，则应该每一个样品用一个枪头加样，避免样品交叉污染。）枪头加样，避免样品交叉污染。） 315）凝凝胶胶中中加加入入EB进进行行电电泳泳，便便于于紫紫外外线线下下观观察察电电泳泳状状态态，但但EB会会导导致致线线形形DNA迁迁移移率率下下降降，这这在在酶酶切切质质粒粒与与空空白白对照质粒一起电泳时应值得注意。对照质粒一起电泳时应值得注意。6）电电泳泳过过程程中中，溴溴化化乙乙锭锭向向负负极极移移动动，与与DNA泳泳动动的的方方向向相相反反，较较长长时时间间的的电电泳泳会会造造成成靠靠正正极极方方向向的的凝凝胶胶中中溴溴化化乙乙锭锭含含量量低低，会会对对含含量量较较少少的的小小分分子子DNA片片段段检检测测困困难难。处处理理方方法法是是：将将凝凝胶胶在在0.5ug/ml的的EB溶溶液液中中染染色色3045分分钟。钟。7）判判断断正正负负极极的的另另一一方方法法是是负负极极气气泡泡（H2）比比正正极极气气泡泡（O2）多一倍。）多一倍。32