人工种子和种质保存人工种子和种质保存植物组织培养植物组织培养大大家家好好！ 人工种子 1. 1. 人工种子的概念人工种子的概念 2. 2. 人工种子制备的技术要点人工种子制备的技术要点1.人工种子的概念 一. 基本概念狭义狭义 的概念是指植物离体培养中产生的的概念是指植物离体培养中产生的胚状体（包括体细胞胚和性细胞胚），包裹在胚状体（包括体细胞胚和性细胞胚），包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。条件下能够发芽出苗的颗粒体。广义广义 而言，人工种子是在胚状体或一块而言，人工种子是在胚状体或一块组织（顶芽、腋芽）、一个器官（小鳞茎等）组织（顶芽、腋芽）、一个器官（小鳞茎等）之外加上必要的营养成分（人工胚乳）后，用之外加上必要的营养成分（人工胚乳）后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体形成的与天然种子相似的颗粒体二、人工种子的结构二、人工种子的结构农业生产中使用的天然种子，一般都是由农业生产中使用的天然种子，一般都是由种被、胚乳和胚三部分构成。种被、胚乳和胚三部分构成。 目前研制的人工种子的结构目前研制的人工种子的结构: : 体细胞胚体细胞胚 人工种皮人工种皮 人工胚乳人工胚乳广义的体细胞胚由组织培养中获得的体细胞即胚状体、愈伤组织、原球茎、不定芽、顶芽、腋芽、小鳞茎等繁殖体组成。胶囊之外的包膜称之为人工种皮,有防止机械损伤及水分干燥等保护作用。包裹成功的人工种子既能通气、保持水分和营养,又能防止外部一定的机械冲击力。人工胚乳一般由含有供应胚状体养分的胶囊组成,养分包括矿质元素、维生素、碳源以及激素等。三. 人工种子分类根据根据RedenbaughRedenbaugh对人工种子的分类方法，可将人工对人工种子的分类方法，可将人工种子分为三大类：种子分为三大类： 裸露的或休眠的繁殖体裸露的或休眠的繁殖体 如微鳞茎，微块茎等。如微鳞茎，微块茎等。它们在不加包被的情况下也具有较高的成株率。它们在不加包被的情况下也具有较高的成株率。 人工种皮包被的繁殖体人工种皮包被的繁殖体 一些体细胞胚、原球一些体细胞胚、原球茎等不能过度干燥，但只需要用人工种皮包被即茎等不能过度干燥，但只需要用人工种皮包被即可维持良好的发芽状态，如胡萝卜体细胞胚。可维持良好的发芽状态，如胡萝卜体细胞胚。 水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体 大多数大多数体细胞胚、不定芽、茎尖等均需要先包埋在半液体细胞胚、不定芽、茎尖等均需要先包埋在半液态凝胶中，再经人工种皮包裹才能避免失水，从态凝胶中，再经人工种皮包裹才能避免失水，从而维持良好的发芽能力。而维持良好的发芽能力。 四四. . 人工种子的意义人工种子的意义其一，在无性繁殖植物中，有可能建立一种高其一，在无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种效快速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种性，又可以使之具有实生苗的复壮效应；性，又可以使之具有实生苗的复壮效应；其二，可以对优异杂种种子不通过有性制种而其二，可以对优异杂种种子不通过有性制种而快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植物更具有主要的适用意义；的植物更具有主要的适用意义；其三，对于一些不能正常产生种子的特殊植物其三，对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍体、非整倍体、工程植物等，有可材料如三倍体、非整倍体、工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大繁殖应用；能通过人工种子在短期内加大繁殖应用；其四，与田间制种相比，可以节省制种用地，其四，与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的危险；还避免了种子携带病原菌的危险；其五，与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，其五，与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输。输。 五、人工种子的局限性 目前，绝大多数人工种子发芽需要无菌条件，所以，还不能实现广泛应用。另外，人工种子的制作费用过高，并且在应用上需要各个环节的配套，这些都限制了人工种子的推广。物种主要结果胡萝卜(Daucus carota)有菌土壤中发芽成苗苜蓿(Medicago sativas)有菌条件下发芽成苗芹菜(Apium graveolens)有菌条件下发芽成苗柑橘(C. sinensisC. reticulata)无菌条件下发芽成苗挪威云杉(Picea abies)无菌及有菌条件下发芽松树(Pinus lambertiana, P. aeda)无菌及有菌条件下发芽玉米(Zea mays)无菌条件下发芽成苗杂交水稻(O. sativaO. lalifolia)无菌条件下发芽橡胶树(Hevea brasiliensis)无菌条件下发芽西洋参(Panax quinquefolium)无菌条件下发芽刺五加(Acanthopanax senticosus)无菌及有菌条件下成苗黄连(Coptis chinensis)无菌及有菌条件下成苗表7.1 以体细胞胚为繁殖体的人工种子 物种繁殖体主要结果印度桑(Morus indica)芽无菌条件下发芽成苗檀香(Santalum ablum)芽无菌条件下发芽成苗花叶芋(Caladium bicolor)芽无菌条件下发芽成苗百合(Lilium)小鳞茎无菌条件下发芽成苗直杆桉树(Eucalyptus maideni)侧芽无菌条件下发芽成苗莴苣(Lacyuca sativa)芽无菌及有菌条件下发芽成苗华腺萼木(Mycetia sienensis)微芽有菌土壤中发芽成苗大花蕙兰(Cytobium)原球茎无菌条件下发芽石槲兰(Dendrobium)原球茎无菌条件下发芽唐菖蒲(Gladiolus hortalans)球茎无菌条件下发芽香蕉(Musa acuminata)微芽无菌条件下发芽杨树(Populus beijingy)芽无菌条件下发芽表7.2 以器官为繁殖体的人工种子 植物种类繁殖体类型培养程序及培养天数培养基及蔗糖浓度激素浓度（mg./L）其它成分(mg/L)2,4-DNAAZeatinBAKin芥菜型油菜体细胞胚Step I, 21MS, 3%2.01.01.0LH(100)Step II, 21MS, 3%0.11.00.5LH(100), 谷氨酰胺(500)微芽21MS, 3%0.05-0.25.0桉树体细胞胚Step I, 20B5, 4-5%2.0-4.01.0Step II, 28-56改良H, 3%0.2-0.50.5ADE(40)微芽25改良H, 3%0.2-0.50.5-2.0ADE(40)茶树体细胞胚Step I, 28MS, 4%0.5-1.01.00.5Step II, 30MS, 2-3%1.00.5GA(0.3), IAA(0.3-0.5)不定芽25MS, 2-3%1.01.0IAA(0.3)华腺萼木体细胞胚Step I, 25MS, 3%1.00.21.0Step II, 20MS, 0.2-0.3%0.21.0不定芽25MS, 2-3%0.010.2IAA(0.3), GA(0.1)兰花原球茎25MS, 2%0.1椰子汁(10%)表7.3 部分植物繁殖体诱导培养条件 2.人工种子制备的技术要点人工种子的基本制作流程人工种子的基本制作流程外植体的选择和消毒外植体的选择和消毒 愈伤组织的诱愈伤组织的诱导导体细胞胚的诱导体细胞胚的诱导 体细胞胚的体细胞胚的同步化同步化体细胞胚的分选体细胞胚的分选体细胞胚体细胞胚的包裹的包裹( (人工胚乳人工胚乳)包裹外膜包裹外膜发芽发芽成苗试验成苗试验体细胞胚变异程度与农艺研体细胞胚变异程度与农艺研究。究。一繁殖体的处理体细胞胚形成后，需要在无激素培养基上经过体细胞胚形成后，需要在无激素培养基上经过一定阶段的后熟培养，然后进行脱水干燥，再一定阶段的后熟培养，然后进行脱水干燥，再将畸形胚选出后才能进行包埋。在脱水之前用将畸形胚选出后才能进行包埋。在脱水之前用ABAABA处理体细胞胚强迫其进入休眠，更有利于长处理体细胞胚强迫其进入休眠，更有利于长期贮存。期贮存。微型变态器官繁殖体不能过度脱水，但亦需要微型变态器官繁殖体不能过度脱水，但亦需要适当干燥，除去表面及多余的水分，同时要进适当干燥，除去表面及多余的水分，同时要进行表面消毒处理以防止包被后的感染。为了延行表面消毒处理以防止包被后的感染。为了延长贮存时间，亦需根据使用季节进行适当的休长贮存时间，亦需根据使用季节进行适当的休眠处理。眠处理。芽为繁殖体的类型，则不能进行脱水处理，但芽为繁殖体的类型，则不能进行脱水处理，但必需筛选生长健壮、组织充实的芽进行包埋。必需筛选生长健壮、组织充实的芽进行包埋。 二繁殖体的包埋二繁殖体的包埋1、包埋介质的要求：首先必需是对繁殖体及其它生物是无毒的，并具有一定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输和种植操作中的安全。同时，它最好能够提供类似于胚乳的营养物质，以供繁殖体发芽的需要。此外由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到微生物感染危害，因此介质中还应含有适当的杀菌剂。 2、常用的人工胚乳液配方有两种：MS（或SH、White）培养基加入1.5%的马铃薯淀粉水解物；SH（0.5）培养基加入1.5%的麦芽糖。 3 3、包埋的方法、包埋的方法主要有主要有液胶包埋法液胶包埋法、干燥包埋法干燥包埋法 和和水凝胶法水凝胶法 等。液胶包埋法是将胚状体或小植株悬等。液胶包埋法是将胚状体或小植株悬浮在浮在”一种黏滞流体胶中直接播入土壤的方法。干一种黏滞流体胶中直接播入土壤的方法。干燥包埋法是将体细胞胚经干燥后再用聚氧乙烯燥包埋法是将体细胞胚经干燥后再用聚氧乙烯等聚合物进行包埋的方法。水凝胶法是指用通等聚合物进行包埋的方法。水凝胶法是指用通过离子交换或温度突变形成的凝胶包裹材料进过离子交换或温度突变形成的凝胶包裹材料进行包埋的方法。行包埋的方法。4、以海藻酸钠作包埋剂的操作程序是：在配制好的海藻酸钠溶液中，按一定比例加入繁殖体并混匀。（添加糖、防腐剂、抗生素、农药等，防止病虫害侵染。）将其逐滴滴入2.0%-2.5%的CaCl2溶液中，经2030min.的离子交换作用即形成含有繁殖体具有一定刚性的人工种子，用无菌水漂洗20min.以终止反应。 海藻酸钠易失水干缩，为克海藻酸钠易失水干缩，为克服此弱点，采用二重结构，即在服此弱点，采用二重结构，即在胶囊中包埋培养液、保水剂，使胶囊中包埋培养液、保水剂，使体胚悬浮于培养基中，为防止发体胚悬浮于培养基中，为防止发芽时杂菌感染，添加抗菌剂等。芽时杂菌感染，添加抗菌剂等。 三人工种皮的装配三人工种皮的装配理想的人工种皮应该是：具有一定的封闭性以保证人工胚乳的各种成分不易流失，同时又具有良好的透气性。具有一定的坚硬度，以加强人工种子的耐储运性和适于机械化操作。无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽。配制简单易行，成本低。 常用的人工种皮材料常用的人工种皮材料早期使用早期使用ElvaxElvax 4260 4260涂膜，价格昂贵，操作复杂、包裹效果涂膜，价格昂贵，操作复杂、包裹效果不尽人意。不尽人意。新近试验使用的二氧化硅化合物材料包括疏水的新近试验使用的二氧化硅化合物材料包括疏水的TullanoxTullanox和和微亲水的微亲水的Cab-O-Cab-O-SilSil，二者均可以粉末状包裹在人工种子胶囊，二者均可以粉末状包裹在人工种子胶囊外层，操作时只需将胶囊在上述材料中滚动即可完成包被过外层，操作时只需将胶囊在上述材料中滚动即可完成包被过程，操作简单易行，大量生产还可以机械化操作。程，操作简单易行，大量生产还可以机械化操作。最近还报道一种硅酮种衣，它不仅可以抗真菌，而且可渗入最近还报道一种硅酮种衣，它不仅可以抗真菌，而且可渗入水蒸气和氧气，这些材料均还处于试验之中。水蒸气和氧气，这些材料均还处于试验之中。 人工种子还在继续研究中，目前还不能大面积用于生产，因为还存在着难题：体细胞胚诱导及其可能发生变异；人工种皮还存在缺陷；贮藏、发芽技术尚待解决；人工种子工厂化生产配套设施、及种子成本过高等。这些问题一旦解决，人工种子的应用将会展现广阔前景。人工种子长人工种子长出的芹菜味出的芹菜味道非常鲜美道非常鲜美黄连黄连西洋参西洋参莴苣甘薯橡胶树苜蓿檀香 植物种质资源的保存植物种质资源的保存一、概念及保存类型 植物种质资源保存是指利用天然或人工创造的适宜环境保存种质资源，使个体中所包含的遗传物质保持其遗传完整性和活力，并能通过繁殖将其遗传特性传递下去。 保存类型有两种，即原生境保存和非原生境保存。1、原生境保存 将植物的遗传材料保存在它们的自然环境中。原生境保存的地方多是植物保护区，另一种方法为农田种植保存。珍宝岛国家级自然保护区美国、马里兰、农田 2、非原生境保存将植物的遗传材料保存在不是它们的自然生境的地方。非原生境保存方式有植物园、种子库、种质圃、试管苗库、超低温库等。具体保存方法有四种：种植保存、贮藏保存、离体保存和基因文库保存。华南植物园 超低温库二、种质资源离体保存 离体保存方法： 低温保存超低温保存生长抑制剂保存（一）低温保存 一种缓慢生长保存方法，是通过控制培养温度来限制培养物各种生长因子的作用，使培养物生长减少到最低限度。 低温保存的基本特征是保存材料的定期继代培养，不断繁殖更新；基本措施是控制保存材料所处的温度和光照。延缓保存材料生长速度的另一项措施是改变培养基的成分。种质库要定期检查，保持清洁，及时清除污染材料，并注意积累资料。（二）超低温保存 即冷冻保存，一般以液N2为冷源，使保存温度维持在-196。1、保存原理低温冰冻过程中，如果生物细胞内水分结冰，细胞结构就遭到不可逆的破坏，导致细胞和组织死亡。植物材料在超低温条件下，冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分次生结冰而达到植物材料保存目的。 植物细胞含水量大，冰冻保存难度大，投放液N2中易引起组织和细胞死亡，故须借助于冷冻防护剂，防止细胞冰冻或解冻时引起过度脱水而遭到破坏，保护细胞。超低温冰箱2、基本程序 超低温保存的基本程序包括预处理、冷冻处理、冷冻贮存、解冻和再培养。（1）预处理为保证茎尖在液N2处理后具有稳定且高的存活率，需进行一定的预处理，或在冷冻防护剂存在下进行预培养，或直接进行低温（-310）预处理。（2）冷冻处理 冷冻处理的方法有快速冷冻法、慢速冷冻法、预冷冻法和干燥冷冻法。a、快速冷冻法指将植物材料从0或者其他预处理温度直接投入液氮中保存的方法，降温速度为1000/min。要求细胞体积小、细胞质浓厚、含水量低、液泡化程度低的材料。b、慢速冷冻法 将处于0或其他预处理温度的材料以12/min的降温速度从起始温度降到-100，稳定1h后，投入到液氮保存或以此降温速度连续降温至-196的方法。 适宜保存的材料有成熟的、含有大液泡和含水量高的细胞，对于保存在悬浮培养中的细胞特别有效。c、预冷冻法 指将植物保存材料放入液氮前，需经过短暂时间的低温锻炼的方法。可分为两步冷冻法和逐级冷冻法。 可使保存材料细胞内充分脱水，避免因细胞内结冰而导致不可逆伤害的出现。d、干燥冷冻法 将材料置于2729烘箱内降低植物含水量，再投入液氮中保存的方法。可防止材料冻死。（3）冷冻贮存 适宜温度下贮存冷冻材料也很重要。长期内贮存在液氮内的材料，需合适的液氮容器。冷冻贮存的茎尖随保存时间的延长，其生活力可能下降。（4）解冻 植物材料在超低温贮存过程中所发生的冻害是在冷冻和解冻过程中产生的。 解冻过程中发生的冻害是由细胞内次生结冰造成的。 解冻过程中水的渗透冲击对细胞膜体系造成破坏。a、快速解冻法 是指将液氮中保存的材料直接投入到3740温水浴中进行解冻的方法。解冻的升温速度为500750/min，大多数植物材料可采用此种方法。解冻方法有快速解冻和慢速解冻两种。b、慢速解冻法 将液氮中保存的材料先置于0低温下解冻，再逐渐升至室温下进行解冻的方法。适宜细胞含水量较低的材料。 如木本植物的冬芽。（5）再培养 指将已解冻的材料重新置于培养基上使其恢复生长的过程。再培养是检验冷冻保存效果或确定保存方法是否合适的最根本方法。3、影响因素预处理冷冻解冻方法植物材料的性质冷冻保护剂的使用所使用的冷冻保护剂应具有以下特性：分子质量较小易于与溶剂混合快速渗入细胞无毒或毒性小易洗脱常用的是DMSO。冷冻保护剂的作用：冷冻保护剂的作用：降低冰点，促进过冷却和降低冰点，促进过冷却和“玻璃化玻璃化”状态形状态形成成提高溶液黏滞性，阻止冰晶形成提高溶液黏滞性，阻止冰晶形成增加细胞膜透性，加速胞内水分向外渗出增加细胞膜透性，加速胞内水分向外渗出稳定细胞内大分子正常结构，阻止低温对膜稳定细胞内大分子正常结构，阻止低温对膜的伤害的伤害4、超低温保存后细胞或组织活力检测、超低温保存后细胞或组织活力检测根本方法是再培养根本方法是再培养染色法：染色法：FDA、伊凡蓝法、伊凡蓝法、TTC等等存活率公式存活率公式存活率（存活率（%）=100%重新生长的细胞（组织）数重新生长的细胞（组织）数解冻的细胞（组织）数解冻的细胞（组织）数（三）生长抑制剂保存 主要包括高渗保存法、生长抑制剂保存法、饥饿法、矿物油覆盖法、低光照培养法及低压保存法。1、高渗保存法、高渗保存法利用培养基的高渗透压来抑制离体培养材料生长的利用培养基的高渗透压来抑制离体培养材料生长的种质保存方法。种质保存方法。高渗物质：甘露醇、蔗糖、高渗物质：甘露醇、蔗糖、PEG等等高渗保存配合低温效果更明显高渗保存配合低温效果更明显如：如：610低温下，培养基中加低温下，培养基中加4%甘露醇，可保存马甘露醇，可保存马铃薯铃薯12年，存活率最高可达年，存活率最高可达90%以上。以上。2、生长抑制剂保存法、生长抑制剂保存法在培养基中加入生长抑制剂以减缓培养材料的在培养基中加入生长抑制剂以减缓培养材料的生长，达到长期保存种质材料的保存方法。生长，达到长期保存种质材料的保存方法。生长调节剂：生长调节剂：ABA、青鲜素、青鲜素、CCC、多效唑、多效唑、B9等等使试管苗生长缓慢，生长健壮、叶色浓绿、移使试管苗生长缓慢，生长健壮、叶色浓绿、移栽成活率高。栽成活率高。3、饥饿法、饥饿法从培养基中减去从培养基中减去12种营养元素，使植株缺乏相种营养元素，使植株缺乏相关营养而处于最小生长量关营养而处于最小生长量4、矿物油覆盖法、矿物油覆盖法使培养材料与空气隔绝，延缓生长使培养材料与空气隔绝，延缓生长5、低光照培养、低光照培养适当减弱光照强度，缩短光照时间，进而减缓试适当减弱光照强度，缩短光照时间，进而减缓试管苗生长管苗生长6、低压保存、低压保存降低培养材料周围气压，达到抑制生长的目的降低培养材料周围气压，达到抑制生长的目的分为低气压与低氧压两种，保存原理相似分为低气压与低氧压两种，保存原理相似王乔春：王乔春：1999-2008年间，主要研究园艺植物与薯类植物的超年间，主要研究园艺植物与薯类植物的超低温冷冻机理与技术，转基因技术和分子生物学技术。对国际低温冷冻机理与技术，转基因技术和分子生物学技术。对国际该领域的主要学术贡献包括：该领域的主要学术贡献包括：a.成功地建立了葡萄、柑桔、马成功地建立了葡萄、柑桔、马铃薯、甘薯、树梅等植物的茎尖和细胞的超低温冷冻保存技术；铃薯、甘薯、树梅等植物的茎尖和细胞的超低温冷冻保存技术；b.把超低温冷冻技术与转基因技术结合，显著提高葡萄转基因把超低温冷冻技术与转基因技术结合，显著提高葡萄转基因细胞的转化率与成苗率；细胞的转化率与成苗率；c.成功地建立了葡萄、马铃薯、甘薯成功地建立了葡萄、马铃薯、甘薯等植物的茎尖超低温冷冻脱毒技术和脱除甘薯植原体技术；等植物的茎尖超低温冷冻脱毒技术和脱除甘薯植原体技术；d.成功地创立了热处理加茎尖超低温冷冻脱毒技术，有效地脱除成功地创立了热处理加茎尖超低温冷冻脱毒技术，有效地脱除了树莓丛状矮化病毒了树莓丛状矮化病毒;e.利用生物技术、分子生物学技术、组利用生物技术、分子生物学技术、组培技术、超低温冷冻技术、病毒定位技术、电镜技术、解剖技培技术、超低温冷冻技术、病毒定位技术、电镜技术、解剖技术等揭示了茎尖超低温冷冻脱除病原菌的机理。成为国际上茎术等揭示了茎尖超低温冷冻脱除病原菌的机理。成为国际上茎尖超低温冷冻脱除病原菌研究的奠基人之一。上述研究在国际尖超低温冷冻脱除病原菌研究的奠基人之一。上述研究在国际刊物上（刊物上（SCI）发表）发表14篇论文。主编专著章节篇论文。主编专著章节5章。应邀参加国章。应邀参加国际学术会议三次，并作大会发言。际学术会议三次，并作大会发言。种质保存种质保存