分枝杆菌属分枝杆菌属 Mycobacterium是是一一类类细细长长略略弯弯的的杆杆菌菌，除除二二分分裂裂繁繁殖殖外外,尚有分枝生长的趋势，故名分枝杆菌。尚有分枝生长的趋势，故名分枝杆菌。 本属菌的共同特点：本属菌的共同特点： 1.无无芽芽胞胞，无无鞭鞭毛毛，某某些些菌菌株株有有荚荚膜膜，有有分分枝枝生长趋势生长趋势;2.细胞壁脂质含量高，主要为分枝菌酸；细胞壁脂质含量高，主要为分枝菌酸；3.为为G+b,但但不不易易着着色色，抗抗酸酸染染色色阳阳性性，故故又又名名抗酸杆菌（抗酸杆菌（ acid-fast-bacillus）；）；4.专性需氧，营养要求高，大多生长缓慢；专性需氧，营养要求高，大多生长缓慢；5.不不产产生生内内外外毒毒素素及及侵侵袭袭性性酶酶类类，其其致致病病性性与与菌菌体体成成分分以以及及机机体体对对菌菌体体成成分分所所产产生生的的免免疫疫损伤有关；损伤有关；6.所致疾病呈慢性过程所致疾病呈慢性过程。 分类分类 放线菌目放线菌目分枝杆菌科分枝杆菌科分枝杆菌属：分枝杆菌属： 种类繁多，已发现种类繁多，已发现8080多个种。国际分类研究组多个种。国际分类研究组（IWGMTIWGMT）分为三类）分为三类（表（表14-114-1）1.结核分枝杆菌群结核分枝杆菌群 （ 缓慢生长菌）缓慢生长菌）（1）人人结结核核分分枝枝杆杆菌菌 ：感感染染率率高高，占占90%，对对人致病，与牛结核分枝杆菌有交叉免疫。人致病，与牛结核分枝杆菌有交叉免疫。（2）牛结核分枝杆菌）牛结核分枝杆菌 ：感染率次之，对人致病。：感染率次之，对人致病。（3）非非洲洲结结核核分分枝枝杆杆菌菌：1968年年从从非非洲洲肺肺结结核核病人的痰中分离出病人的痰中分离出（4）田鼠分枝杆菌：对人一般不致病）田鼠分枝杆菌：对人一般不致病 2 2非典型分枝杆菌（缓慢生长或快速生长菌）非典型分枝杆菌（缓慢生长或快速生长菌） 除结核与麻风分枝杆菌以外的结核分枝杆菌除结核与麻风分枝杆菌以外的结核分枝杆菌（1）群（缓慢生长菌）：致机会肺部感染或游泳池肉芽肿群（缓慢生长菌）：致机会肺部感染或游泳池肉芽肿（2）群（缓慢生长菌）：致儿童淋巴腺炎或成人肺部感染群（缓慢生长菌）：致儿童淋巴腺炎或成人肺部感染（3）群（缓慢生长菌）：致群（缓慢生长菌）：致AIDS患者机会感染患者机会感染 或肺部类结核感染或肺部类结核感染（4）群（快速生长菌）：致局部和肺部类结核感染，群（快速生长菌）：致局部和肺部类结核感染， 软组织和手术后继发感染软组织和手术后继发感染 3 3麻风分枝杆菌（不能培养菌）麻风分枝杆菌（不能培养菌） 目前尚不能在人工培养基上生长，致人类麻风病，为目前尚不能在人工培养基上生长，致人类麻风病，为慢性传染病，主要侵犯深部组织和器官。目前对小鼠慢性传染病，主要侵犯深部组织和器官。目前对小鼠足垫接种成功，对犰狳易感足垫接种成功，对犰狳易感,可作为研究的动物模型。可作为研究的动物模型。微生物学诊断主要靠涂片，抗酸染色镜检，金胺微生物学诊断主要靠涂片，抗酸染色镜检，金胺O荧荧光染色镜检或病理活检。光染色镜检或病理活检。 分枝杆菌属其模式菌株为人结核分枝杆菌，其模式菌株为人结核分枝杆菌，标准菌株为标准菌株为ATCC27294。 结核分枝杆菌结核分枝杆菌 M.tuberculosis一微生物特性一微生物特性1. 形态染色形态染色 细细长长略略弯弯的的杆杆菌菌,有有时时可可见见分分枝枝状状，可可出出现现多多形形态态:球球形形、串串珠珠状状或或丝丝状状。革革兰兰染染色色阳阳性性,但但不不易易着着色色,抗抗酸酸染染色色阳阳性性,经经齐齐-尼尼(Ziehl-Neelsen)抗抗酸酸染染色色,菌菌体体呈呈红红色色,其其他他细细菌菌和和背背景景物物质质呈呈蓝蓝色色,用用金金胺胺O荧荧光光染染色色菌菌体呈金黄色荧光。体呈金黄色荧光。 本菌无鞭毛本菌无鞭毛,无芽胞无芽胞,有荚膜有荚膜,但因制片破坏不易看到但因制片破坏不易看到。2.培养特性培养特性 本菌为专性需氧菌本菌为专性需氧菌,3%-5%的的CO2可促进其生长可促进其生长。最适最适PH6.5-6.8,最适生长温度为最适生长温度为370C。 营养要求高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、营养要求高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油、无机盐和孔雀绿等的甘油、无机盐和孔雀绿等的罗罗- -琴（琴（Lowenstein-Jensen,L-J）固体培养基）固体培养基 才能生长良好，因蛋清含才能生长良好，因蛋清含脂质生长因子，能刺激结核分枝杆菌生长，孔雀绿脂质生长因子，能刺激结核分枝杆菌生长，孔雀绿能抑制杂菌生长，故有利于本菌的分离培养与保存。能抑制杂菌生长，故有利于本菌的分离培养与保存。 该该菌菌生生长长缓缓慢慢（18h/代代）一一般般2-5周周方方长长出出菌菌落落，菌菌落落呈呈R型型：表表面面粗粗糙糙、干干燥燥、隆隆起起、坚坚硬硬、呈呈颗颗粒粒状状、结结节节状状或花菜状，乳白色或淡黄色，不透明。或花菜状，乳白色或淡黄色，不透明。 在在液液体体培培养养基基中中生生长长较较为为迅迅速速，一一般般1-2周周即即可可生生长长，呈呈菌菌膜膜生生长长，有有毒毒力力的的菌菌株株呈呈索索状状生生长长。若若液液体体培培养养基基中中加加入入0.2%吐温吐温-80（Tween-80）则可呈均匀生长。）则可呈均匀生长。 3.菌体成分菌体成分脂质、多糖和蛋白质脂质、多糖和蛋白质 1) 脂脂质质 此此菌菌含含有有大大量量脂脂质质，占占CW干干重重的的60%,包包括括磷磷脂脂、脂脂肪肪酸酸和和蜡蜡质质。其其中中蜡蜡质质所所占占比比例例最最大大,由分枝菌酸、索状因子、蜡质由分枝菌酸、索状因子、蜡质D组成组成. 2) 蛋蛋白白质质 本本菌菌含含有有多多种种蛋蛋白白质质, 结结核核菌菌素素(tuberculin)就就是是其其中中之之一一,与与蜡蜡质质结结合合能能使使机机体体致致敏敏,产产生生超超敏敏反反应应,引引起起组组织织坏坏死死和和全全身身中中毒毒症症状状,并并与与结结核核结结节节的的形形成成相相关关蛋蛋白白质质也也可可刺刺激机体产生非保护性抗体激机体产生非保护性抗体.3）多糖）多糖 TB含有各种多糖含有各种多糖,其致病作用不清其致病作用不清. 荚膜荚膜主要成分为多糖及部分脂质和蛋白质它能主要成分为多糖及部分脂质和蛋白质它能与吞噬细胞表面的补体受体与吞噬细胞表面的补体受体3(CR3)3(CR3)结合结合, ,有助于粘附与有助于粘附与入侵入侵; ;荚膜中的多种酶可降解宿主组织中的大分子物质荚膜中的多种酶可降解宿主组织中的大分子物质, ,为本菌生长繁殖提供所需的营养物质为本菌生长繁殖提供所需的营养物质; ; 荚膜能防止宿主的有害物质进入本菌荚膜能防止宿主的有害物质进入本菌;荚膜尚可抑荚膜尚可抑制巨噬细胞中的吞噬体与溶酶体的融合制巨噬细胞中的吞噬体与溶酶体的融合,故与致病性密故与致病性密切相关切相关 4.生化反应生化反应 本菌生化反应不活泼本菌生化反应不活泼,不发酵糖类多数菌株触酶不发酵糖类多数菌株触酶试验阳性试验阳性,但热触酶试验阴性但热触酶试验阴性,而非典型分枝杆菌热而非典型分枝杆菌热触酶试验大多阳性结核分枝杆菌烟酸试验及硝酸触酶试验大多阳性结核分枝杆菌烟酸试验及硝酸盐还原试验均呈阳性盐还原试验均呈阳性,而牛分枝杆菌均为阴性而牛分枝杆菌均为阴性,有助有助于鉴别于鉴别 人结核分枝杆菌人结核分枝杆菌非典型分枝杆菌非典型分枝杆菌 牛结核分枝杆菌牛结核分枝杆菌触酶试验触酶试验 +热触酶试验热触酶试验 - +烟酸试验烟酸试验 + -硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验 + -5.变异性变异性1）形态变异：形态变异： 细长杆菌细长杆菌 L L型（型（MuchMuch颗粒）颗粒）: : 颗粒状或者丝状形颗粒状或者丝状形, ,抗酸性下降或消失抗酸性下降或消失 2 2）菌落变异）菌落变异: : R R型菌落型菌落( (有毒菌株有毒菌株) S) S型型( (无毒菌株无毒菌株) ) 不良环境不良环境不良环境不良环境药物影响药物影响药物影响药物影响不良环境不良环境不良环境不良环境药物影响药物影响药物影响药物影响3）毒力变异）毒力变异: 有毒牛型结核分枝杆菌有毒牛型结核分枝杆菌 减毒活疫苗减毒活疫苗( (毒力大大下降毒力大大下降, ,抗原抗原 性不变性不变),1908),1908年由年由B Bacille acille C Calmette-almette-G Guerinuerin发现发现BCGBCG( (卡介苗卡介苗) )4 4）耐药性变异）耐药性变异: : 结核分枝杆菌结核分枝杆菌 耐药性变异（耐药性变异（MDRTBMDRTB） 耐耐药药菌菌株株毒毒力力明明显显减减弱弱, ,但但近近年年来来多多重重耐耐药药菌菌株株逐逐渐渐增增多多, ,其其TBTB病病的的死死亡亡率率高高达达（US US CDCCDC），甚甚至至引引起起爆爆发发流流行行, ,给给结结核核病病的防治带来巨大困难的防治带来巨大困难. . 药物选择药物选择药物选择药物选择( ( ( (继发耐药继发耐药继发耐药继发耐药) ) ) )基因突变基因突变基因突变基因突变( ( ( (原发耐药原发耐药原发耐药原发耐药) ) ) )13131313年年年年230230230230代代代代L-JL-J培养基培养基培养基培养基6.6.抵抗力抵抗力( (三耐五敏三耐五敏) )n耐耐干干燥燥: :在在干干燥燥痰痰中中可可存存活活6-86-8个个月月, ,在在含含痰痰液液的的尘尘埃中可存活埃中可存活8-108-10天天, ,故不能随便吐痰。故不能随便吐痰。n耐耐酸酸碱碱: :在在3%HCI3%HCI、6%H6%H2 2SOSO4 4、4%NaOH4%NaOH中中30min30min其其活活力力不受影响不受影响, ,故常用此法来处理被杂菌污染的标本。故常用此法来处理被杂菌污染的标本。n耐某些染料及抗生素耐某些染料及抗生素: :对对1:130001:13000孔雀绿、孔雀绿、1:75001:7500结晶紫、青霉素等有一定抵抗力结晶紫、青霉素等有一定抵抗力, ,故在培养基中可故在培养基中可加入这些物质抑制标本中的杂菌生长加入这些物质抑制标本中的杂菌生长, ,而不影响结而不影响结核分枝杆菌生长核分枝杆菌生长, ,从而有利于初代分离培养。从而有利于初代分离培养。n对对75%的酒精的酒精敏感敏感,常用于消毒病人口温表常用于消毒病人口温表;n对对湿湿热热敏敏感感,湿湿热热62-630C 15min或或者者煮煮沸沸即即被被杀杀灭灭,故故常用巴氏法消毒牛奶或用煮沸法消毒结核病人的餐具常用巴氏法消毒牛奶或用煮沸法消毒结核病人的餐具;n对对紫紫外外线线(日日光光)敏敏感感:常常用用于于消消毒毒结结核核病病房房空空气气和和病病人人衣衣物等物等;n对对某某些些化化学学消消毒毒剂剂敏敏感感,但但需需延延长长消消毒毒时时间间:如如5%石石炭炭酸酸24小时小时,3%来苏尔来苏尔1-2小时小时,方能杀灭痰内的结核杆菌方能杀灭痰内的结核杆菌;n对对抗抗痨痨药药物物敏敏感感:异异烟烟肼肼、链链霉霉素素、对对氨氨基基水水杨杨酸酸(PAS)、利福平、乙胺丁醇、卡那霉素等利福平、乙胺丁醇、卡那霉素等,常用于结核病的治疗常用于结核病的治疗.二二. 临床意义临床意义1.致致病病物物质质-CW上上荚荚膜膜、蛋蛋白白质质、脂脂质质与与致致病病性密切相关性密切相关2.所致疾病所致疾病-结核病结核病,以肺结核最为多见以肺结核最为多见.1)传传染染源源:开开放放性性肺肺结结核核病病人人,病病灶灶与与外外界界相相通通,不不断断向向体体外外排排出出结结核核分分枝枝杆杆菌菌,经经过过尘尘埃埃或或飞飞沫沫吸吸入入肺肺泡泡,被巨噬细胞吞噬被巨噬细胞吞噬,在其中发育繁殖在其中发育繁殖,导致病变产生导致病变产生.2)传传染染途途径径:主主要要通通过过呼呼吸吸道道、消消化化道道和和受受损损的的皮肤粘膜等途径皮肤粘膜等途径易感机体易感机体. . 部部分分结结核核分分枝枝杆杆菌菌血血液液肺肺内内、外外播播散散肺肺内内外外感感染染：肺肺结结核核、结结核核性性脑脑膜膜炎炎、肾肾结结核核、骨骨结结核核、关关节节结结核核、生生殖殖道道结结核核等等多多种种脏脏器器组组织织的的结结核核病病( (粟粟粒粒性性结结核核),),但但有有不不少少学学者者认为沿血液播散的结核分枝杆菌为该菌的认为沿血液播散的结核分枝杆菌为该菌的L L型型. .3)3)易感机体易感机体: : 未接种过卡介苗或机体免疫功能低下者未接种过卡介苗或机体免疫功能低下者. . 初初次次感感染染TBTB原原发发性性结结核核, ,多多见见于于儿儿童童, ,病病灶灶多多位位于于肺肺门门部部, ,且多为外源性感染且多为外源性感染, ,易形成原发综合症易形成原发综合症. . 再再次次感感染染TBTB继继发发性性结结核核, ,多多见见于于成成年年人人, ,病病灶灶多多位位于于肺肺尖尖部部, ,既既可可内内源源性性感感染染复复发发, ,也也可可为为外外源源性性新新侵侵入入的的结结核引起核引起. . 结结核核病病至至今今仍仍为为重重要要的的传传染染病病, ,据据WHOWHO估估计计, ,目目前前全全球球约约1/31/3的的人人口口感感染染过过结结核核分分枝枝杆杆菌菌, ,每每年年约约有有800800万万-1000-1000万万新新发发病病例例, ,每每年年至至少少有有300300万万人人死死于于结结核核病病, ,相相当当于于每每天天有有80008000人人死死于于结结核核病病, ,其其中中98%98%的的病病死死率率在在发发展展中中国国家家. . 2020世世纪纪8080年年代代以以来来, ,随随着着AIDSAIDS发发病病率率的的增增加加, ,耐耐药药性性TBTB的的不不断断增增加加, ,以以及及吸吸毒毒、免免疫疫抑抑制制剂剂的的应应用用等等原原因因, ,结结核核病病的的发发病病率率出出现现了了世世界界范范围围的的回升。回升。 如如果果不不加加强强结结核核病病的的防防治治, ,从从2000-20202000-2020年年, ,全全球球有有1010亿亿新新结结核核感感染染者者, ,其其中中约约有有2 2亿亿人人发发病病,7000,7000万万人人死死亡亡. .结结核核病病已已成成为为传传染染病病中中的的头头号号杀杀手手和和最最大大死死亡亡原原因因之之一一, ,被被称称为为“白白色色瘟瘟疫疫”, ,全球目前已处于结核病的紧急状态全球目前已处于结核病的紧急状态. . n新中国成立后随着人民生活水平的提高新中国成立后随着人民生活水平的提高, ,卫生卫生状况的改善状况的改善, ,特别是开展了群防群治特别是开展了群防群治, ,儿童普遍儿童普遍接种卡介苗接种卡介苗, ,结核病的发病率和死亡率也大为结核病的发病率和死亡率也大为降低降低, ,但近但近2020年以来结核病的发病率又普遍增年以来结核病的发病率又普遍增高高, ,应引起我们高度的重视。应引起我们高度的重视。3.免疫性免疫性以以CMI为主（为主（ cell-mediated immunity ）n 结核的感染率高（结核的感染率高（80%-90%），但发病率低），但发病率低（4%），多为隐性感染。说明人体对），多为隐性感染。说明人体对TB有相当有相当强的免疫力。强的免疫力。n 结核分枝杆菌是细胞内感染菌，结核分枝杆菌是细胞内感染菌，主要以主要以TL为主为主的细胞免疫的细胞免疫。致敏。致敏TL+TB淋巴因子：淋巴因子：IL-2、IL-6、IFN-、TNF-.共同作用共同作用杀死病灶中的死病灶中的结核分枝核分枝杆菌。杆菌。n 结核的免疫属于核的免疫属于传染性免疫染性免疫（infective immunity）,又称有菌免疫，即只有在体内存在结又称有菌免疫，即只有在体内存在结核分枝杆菌或菌体成分时，机体才对再次入侵的核分枝杆菌或菌体成分时，机体才对再次入侵的TBTB有免疫力，反之则无免疫力。有免疫力，反之则无免疫力。 机体对机体对TBTB的传染、免疫和迟发型超敏反应同时存在，可测其的传染、免疫和迟发型超敏反应同时存在，可测其一而知其二。常用结核菌素（一而知其二。常用结核菌素（tuberculintuberculin）皮肤试验来检测）皮肤试验来检测机体对机体对TBTB是否有免疫力。是否有免疫力。 郭霍现象（郭霍现象（Koch phenomenonKoch phenomenon）: :有毒有毒TBTB初次感染初次感染GPGP，10101414天后注射局部溃烂、坏死，附近天后注射局部溃烂、坏死，附近LNLN肿大，细菌肿大，细菌扩散漫延至全身，甚至死亡。有毒扩散漫延至全身，甚至死亡。有毒TBTB再次感染再次感染GPGP，1 12 2天内注射局部迅速溃烂，但很快愈合，且不扩散天内注射局部迅速溃烂，但很快愈合，且不扩散至附近至附近LNLN和全身。说明机体对结核分枝杆菌所产生的和全身。说明机体对结核分枝杆菌所产生的CMICMI和超敏反应是同时存在的，是由不同的菌体成分和超敏反应是同时存在的，是由不同的菌体成分激活不同的激活不同的T T细胞亚群释放出不同的细胞因子所引起细胞亚群释放出不同的细胞因子所引起的。的。 现一般认为超敏反应是由结核菌素蛋白和腊质现一般认为超敏反应是由结核菌素蛋白和腊质D D共同共同引起的，而引起的，而CMICMI是由结核分枝杆菌核糖体是由结核分枝杆菌核糖体RNA(rRAN)RNA(rRAN)引引起。起。三三. .微生物学检验微生物学检验（一（一) )检验程序检验程序 图图14-114-1 ( (二二) )标本采集标本采集 根据感染部位不同分别采取痰液根据感染部位不同分别采取痰液(晨痰晨痰)、支气管灌洗液、支气管灌洗液、胸腹水、脑脊液胸腹水、脑脊液(静置后，试管表面可有细薄凝块静置后，试管表面可有细薄凝块)、尿、尿(晨晨尿或尿或24小时尿取沉淀物小时尿取沉淀物1015ml,诊断尿路结核需采集诊断尿路结核需采集35份标本份标本)、粪便（国外一般不做）、分泌物与组织等。、粪便（国外一般不做）、分泌物与组织等。 (三三)检验方法检验方法 1.显微镜检查 直接涂片染色镜检：是一种常用的简易快速检查法。标直接涂片染色镜检：是一种常用的简易快速检查法。标本直接涂片本直接涂片(一接种环或一接种环或0.01ml)或浓缩集菌或浓缩集菌(漂浮法、漂浮法、沉淀法沉淀法)后厚涂片后厚涂片(3-4接种环，约接种环，约0.1ml，面积，面积1.5cm2)，经干燥固定后做齐，经干燥固定后做齐-尼抗酸染色尼抗酸染色(热染法热染法)或金胺或金胺O荧光染色。抗酸染色，用油镜观察，结核分枝杆菌呈荧光染色。抗酸染色，用油镜观察，结核分枝杆菌呈红红色色。金胺。金胺O染色后用荧光显微镜染色后用荧光显微镜HP镜观察，结核分镜观察，结核分枝杆菌呈枝杆菌呈金黄色荧光金黄色荧光。每张涂片至少观察。每张涂片至少观察300个视野个视野。 This is an acid fast stain of Mycobacterium tuberculosis (MTB). Note the red rods-hence the terminology for MTB in histologic sections or smears: acid fast bacilli.组织中结核分枝杆菌(抗酸染色)结核分枝杆菌金胺O染色后用荧光显微镜HP镜观察Mycobacteria can also be stained with auramine and viewed with fluorescence microscopy, in which acid fast bacilli now appear as glowing yellow rods. This method is easier to use to screen for mycobacteria and is the method routinely used in sputum specimens sent to the laboratory.报告方式：“找到抗酸性杆菌”或“未找到抗酸性杆菌”。具体报告方式可用1984年国内统一暂定的厚涂片法填写报告单：表14-3染色方法 镜检结果 报告方式 抗酸染色(1000) 未发现抗酸菌(至少00个oil视野) 1-2个抗酸菌/300个oil视野 3-9个抗酸菌/100个oil视野 + 19个抗酸菌/10个oil视野 + 19个抗酸菌/1个oil视野 + 10个抗酸菌/1个oil视野 +荧光染色(450) 未发现抗酸菌(至少00个视野) 1-2个抗酸菌/70个视野 2-18个抗酸菌/50个视野 + 436个抗酸菌/10个视野 + 436个抗酸菌/1个视野 + 36个抗酸菌/1个视野 +染色方法 镜检结果 报告方式 另直接涂片法也可用 全视野发现1-4个 GGaffky报告法(G-G) 数视野发现1个 G oil视野 平均每视野内有1个 G 平均每视野内有2-3个 G 平均每视野内有4-6个 G 平均每视野内有7-12个 G 平均每视野内有13-25个 G 平均每视野内有26-50个 G 平均每视野内有100个 G 平均每视野内有100个以上 G2.核酸检测核酸检测 用用PCRPCR法法( (尤其是定量尤其是定量PCRPCR法法) )或核酸探针可快速诊断结核分枝或核酸探针可快速诊断结核分枝杆菌感染。其特异性与敏感性均杆菌感染。其特异性与敏感性均95%(95%(可达可达100100) )。3.3.色谱分析技术色谱分析技术 因不同分枝杆菌的细胞壁中的分枝菌酸含量不同，故可利用因不同分枝杆菌的细胞壁中的分枝菌酸含量不同，故可利用气液相色谱气液相色谱(HPLC)(HPLC)分析不同分枝杆菌的脂肪酸，可进行菌种分析不同分枝杆菌的脂肪酸，可进行菌种鉴定，具有快速、微量、敏感性高等特点。鉴定，具有快速、微量、敏感性高等特点。4.免疫学诊断免疫学诊断 (1)(1)抗抗PPDIgGPPDIgG检测：用检测：用PPD(PPD(纯蛋白衍生物纯蛋白衍生物) )为抗原，用为抗原，用ELISAELISA法检测结核病人血清中的抗法检测结核病人血清中的抗PPDIgGPPDIgG，可作为活动性结核分枝，可作为活动性结核分枝杆菌感染的快速诊断，其敏感性为杆菌感染的快速诊断，其敏感性为6060-80-80，特异性约，特异性约9090，肺结核病人的血清阳性率为，肺结核病人的血清阳性率为8080-90%. -90%. (2)(2)结核菌素试验结核菌素试验(tuberculin test):(tuberculin test): 是利用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆是利用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆菌是否产生迟发性变态反应的一种试验。结核菌素是结菌是否产生迟发性变态反应的一种试验。结核菌素是结核分枝杆菌的菌体成分，可分为两种：一种是旧结核菌核分枝杆菌的菌体成分，可分为两种：一种是旧结核菌素素(old tuberculin,OT),(old tuberculin,OT),另一种是纯蛋白衍生物另一种是纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)(purified protein derivative,PPD)包括：结核分枝包括：结核分枝杆菌制成的杆菌制成的PPD-CPPD-C和卡介苗制成的和卡介苗制成的BCG-PPDBCG-PPD两种，两种，每每0.1ml0.1ml含含5 5个单位，目前均用个单位，目前均用PPD.PPD. 原理：原理：结核分枝杆菌的传染、免疫、变态反应三者同时结核分枝杆菌的传染、免疫、变态反应三者同时存在，所以可用存在，所以可用PPDPPD来做皮肤试验，看局部皮肤有无变来做皮肤试验，看局部皮肤有无变态反应，从而推测机体是否有传染和免疫态反应，从而推测机体是否有传染和免疫。 方法与结果判断：方法与结果判断： 取取0.1mlPPD(含含5u)前臂皮内注射，前臂皮内注射，4872小时后小时后.局部红肿硬结局部红肿硬结5mm者为阳性者为阳性。表明机体可能感染过结核分枝。表明机体可能感染过结核分枝杆菌或接种过卡介苗，但不一定患结核病；杆菌或接种过卡介苗，但不一定患结核病；局部红肿硬结局部红肿硬结15mm为强阳性为强阳性，表明机体可能有活动性结核，表明机体可能有活动性结核，应进一步检查；应进一步检查；局部红肿硬结局部红肿硬结5mm为阴性为阴性，表明未感染过结核分枝杆菌，但，表明未感染过结核分枝杆菌，但应排除原发性结核病的早期、老年人、严重结核病应排除原发性结核病的早期、老年人、严重结核病(如粟粒如粟粒性性TB、结脑、结脑)或有其它严重疾病或有其它严重疾病(如麻疹、淋巴瘤、白血病、如麻疹、淋巴瘤、白血病、AIDS)以及免疫抑制剂应用者。以及免疫抑制剂应用者。 用途：用途： 可作流行病学调查可作流行病学调查, ,了解人群对结核分枝杆菌的感了解人群对结核分枝杆菌的感染率。染率。 选择选择BCGBCG接种的对象及接种的效果。接种的对象及接种的效果。 可作为婴幼儿可作为婴幼儿(3(3岁岁) )结核病诊断的参考指标。结核病诊断的参考指标。 可测定肿瘤病人的细胞免疫功能。可测定肿瘤病人的细胞免疫功能。结核菌素试验结核菌素试验阳性(3)(3)全血干扰素测定法：全血干扰素测定法： 当全血当全血PPDPPD/ /植物血凝素共同孵育后，致植物血凝素共同孵育后，致敏敏LCLC可分泌可分泌IFN-IFN-，通过检测，通过检测IFN-IFN-的含量来的含量来鉴定菌种。本试验的结果与结核菌素试验相当，鉴定菌种。本试验的结果与结核菌素试验相当，且受且受BCGBCG接种史影响小，又能与非结核分枝杆接种史影响小，又能与非结核分枝杆菌进行区分，同时尚可避免结核菌素试验在操菌进行区分，同时尚可避免结核菌素试验在操作上与结果判断上存在的多种主观或人为因素作上与结果判断上存在的多种主观或人为因素的影响。的影响。 5.5.分离培养分离培养 (1) (1)标本前处理：结核病人的痰或其它标本大多标本前处理：结核病人的痰或其它标本大多含有杂菌，在培养前可用含有杂菌，在培养前可用4 4NaOHNaOH、4 4H H2 2SOSO4 4、胰酶胰酶- -新洁尔灭法等对标本进行处理，以达到新洁尔灭法等对标本进行处理，以达到杀灭杂菌或减少杂菌和液化痰标本的目的。杀灭杂菌或减少杂菌和液化痰标本的目的。(2)(2)细菌接种：细菌接种： 取取0.1ml0.1ml处理后的各种标本接种处理后的各种标本接种L-JL-J斜面培养基，在斜面培养基，在5 5-10-10COCO2 2下，下，3737培养培养1-81-8周。第一周内每天观察一次，以后每周观周。第一周内每天观察一次，以后每周观察察1 1次，据初生长时间、菌落形成以及是否产生色素等特点加以次，据初生长时间、菌落形成以及是否产生色素等特点加以判定。判定。 如生长缓慢如生长缓慢(2(2周以上周以上) )、干燥、粗糙呈颗粒状、乳白色或淡、干燥、粗糙呈颗粒状、乳白色或淡黄色菌落，且抗酸阳性，则多数为结核分枝杆菌，应进一步做黄色菌落，且抗酸阳性，则多数为结核分枝杆菌，应进一步做鉴定试验鉴定试验( (生长速度、色素产生、生化试验生长速度、色素产生、生化试验) )与其它抗酸菌鉴别。与其它抗酸菌鉴别。血液应破坏血液应破坏RBCRBC离心后再接种。离心后再接种。n(3)BACTEC(3)BACTEC分枝杆菌鉴定系统：分枝杆菌鉴定系统：有有BACTEC460BACTEC460半半自动和自动和BACTEC9000BACTEC9000全自动分枝杆菌快速培养系统。全自动分枝杆菌快速培养系统。其特点是灵敏度高、速度快、准确性高，自动或其特点是灵敏度高、速度快、准确性高，自动或半自动，可为临床提供快速阳性报告。半自动，可为临床提供快速阳性报告。6.6.动物接种动物接种 常用的接种动物为豚鼠和小鼠，一般用浓缩标本常用的接种动物为豚鼠和小鼠，一般用浓缩标本1ml1ml接种腹股沟皮下，经接种腹股沟皮下，经3-43-4周后出现局部淋巴结肿大、周后出现局部淋巴结肿大、身体消瘦，结核菌素试验阳转。解剖时可看到淋巴结、身体消瘦，结核菌素试验阳转。解剖时可看到淋巴结、肝、脾、肾、肺等脏器的典型结核病变，也可做病理肝、脾、肾、肺等脏器的典型结核病变，也可做病理检验，从病变处可查到抗酸杆菌或培养出结核分枝杆检验，从病变处可查到抗酸杆菌或培养出结核分枝杆菌。该法可用于结核分枝杆菌的分离与毒力测定。菌。该法可用于结核分枝杆菌的分离与毒力测定。 四四. .药物敏感试验药物敏感试验( (耐药性耐药性) ) 结核分枝杆菌对异烟肼、链霉素、利福平、吡结核分枝杆菌对异烟肼、链霉素、利福平、吡嗪酰胺、异胺丁醇、环丝氨酸、卡拉霉素和对嗪酰胺、异胺丁醇、环丝氨酸、卡拉霉素和对氨基水杨酸等抗痨药物敏感，但长期应用易产氨基水杨酸等抗痨药物敏感，但长期应用易产生耐药性。生耐药性。 目前结核分枝杆菌的耐药性问题日趋严重，目前结核分枝杆菌的耐药性问题日趋严重，据据WHOWHO的调查显示，其耐药率为的调查显示，其耐药率为2020-50-50，多，多重耐药率为重耐药率为5%-20%5%-20%。耐药菌感染者病死率高达。耐药菌感染者病死率高达5050-80%-80%。 该菌的耐药机制主要是其药物作用的该菌的耐药机制主要是其药物作用的靶基因变靶基因变异异，导致基因编码产物改变，从而产生耐药性。结，导致基因编码产物改变，从而产生耐药性。结核分枝杆菌对不同药物具有不同的耐药基因。所以核分枝杆菌对不同药物具有不同的耐药基因。所以临床治疗多主张联合用药，以减少耐药性的产生和临床治疗多主张联合用药，以减少耐药性的产生和增强疗效。目前多采用异烟肼和利福平或吡嗪酰胺增强疗效。目前多采用异烟肼和利福平或吡嗪酰胺联合用药。联合用药。 结核分枝杆菌的结核分枝杆菌的L L型对高浓度的异烟肼、型对高浓度的异烟肼、链霉素及异胺丁醇等不敏感，故对链霉素及异胺丁醇等不敏感，故对L L型培养阳型培养阳性者也应做药敏试验，以提高化疗效果。另外性者也应做药敏试验，以提高化疗效果。另外L L型变异也是结核分枝杆菌感染持续存在的重型变异也是结核分枝杆菌感染持续存在的重要因素之一。要因素之一。 早期，规律，全程，适量，联合。早期，规律，全程，适量，联合。思考题思考题1.1.名词解释名词解释 抗酸染色抗酸染色 结核菌素试验结核菌素试验 BCG BCG 郭霍现象郭霍现象( (包括概念、原理、方法与结果、用途包括概念、原理、方法与结果、用途) )2.2.试述开放性肺结核病人的微生物学诊断方法。试述开放性肺结核病人的微生物学诊断方法。