肉毒毒素基本知识肉毒毒素基本知识肉毒毒素基本知识肉毒毒素基本知识主要内容主要内容肉毒毒素介绍历史发展结构作用机理药理 毒理 免疫原性目前商用的肉毒素及保妥适的特点保妥适配制注意事项什么是肉毒毒素什么是肉毒毒素? ?( (肉毒神经毒素肉毒神经毒素, ,肉毒杆菌神经毒素，肉毒梭菌毒素肉毒杆菌神经毒素，肉毒梭菌毒素 ) )是肉毒梭菌( Clostridium botulinum)在生长繁殖过程中产生的一种细菌外毒素一种厌氧菌，其孢子常规在土壤中，与产生破伤风毒素的细菌属同一科在合适的条件下（10oC，无氧，合适的酸度）孢子生长为梭菌细菌继续产生大量的孢子或自溶将毒素释放出来不同的菌株(如Hall株,Bean株)产生不同亚型的神经毒素(分为 A、B、C、D、E、F、G等7个抗原型), 其中A型毒力最强是导致肉毒中毒(Botulism)的原因生物制品的特定生物制品的特定没有仿制品的概念肉毒毒素是一类产品名，而非通用名与疫苗接近产品本身没有专利，生产工艺专利用单位（Unit）衡量，单位之间不能换算很容易得到，很难提纯，很难恒定FDA 最新通告：最新通告： 历史和发展（历史和发展（1 1）1920s19441946首次沉淀纯化首次沉淀纯化A型肉毒毒素型肉毒毒素（H.Sommer)Schantz 开始研究开始研究其特性和应用其特性和应用Lammanna首次分离出首次分离出A型肉毒素结晶型肉毒素结晶18201895Justinus Kerner 推推测测“腊肠毒腊肠毒” 作用作用原理，并提出应用于原理，并提出应用于治疗的可能性治疗的可能性E Van Ermengem 分分离肉毒梭状芽胞杆菌离肉毒梭状芽胞杆菌历史和发展（历史和发展（2 2）1960s 1970s19781984Schantz 和和Scott 继续研究继续研究Scott在猴子身上进在猴子身上进行行A型肉毒毒素治疗型肉毒毒素治疗斜视的试验斜视的试验Scott 获得获得FDA批准在批准在人身上进行试验（眼睑人身上进行试验（眼睑痉挛，半面肌痉挛）痉挛，半面肌痉挛）1950s1950s 1960sV Brook 证实证实A型肉毒毒素阻断型肉毒毒素阻断乙酰胆碱释放乙酰胆碱释放纯化过程优化纯化过程优化 (Duff and Schantz)MF Brint 用于治疗眼用于治疗眼睑痉挛，半面肌痉挛睑痉挛，半面肌痉挛 斜颈，喉部肌张力障斜颈，喉部肌张力障碍，书写痉挛等碍，书写痉挛等历史和发展（历史和发展（3 3）199820062009FDA 批准低批准低蛋白剂型蛋白剂型 每每100单位单位 5ng19891997Allergan获得获得FDA批批准以准以 BOTOX 商品名商品名上市；用于治疗眼睑上市；用于治疗眼睑痉挛，斜视和第痉挛，斜视和第VII神神经功能紊乱经功能紊乱Allergan 公司公司获得对获得对A型肉型肉毒素的所用权毒素的所用权1998年年6月中国药品监月中国药品监督管理局批准保妥适督管理局批准保妥适用于治疗眼睑痉挛、面用于治疗眼睑痉挛、面肌痉挛及相关病灶肌张肌痉挛及相关病灶肌张力障碍。力障碍。 2006年年6月月GSK在中国在中国上市保妥适上市保妥适2002FDA批准美批准美容适应症容适应症83个国家个国家22个适应症个适应症2月月11日获中日获中国国SFDA批准批准用于皱眉纹用于皱眉纹不是个合适的生化武器不是个合适的生化武器温度、湿度，空气和光照都会使毒素降解雾状的毒素，很不稳定常规的消毒方法既能使其灭活 氯， 加热85C5分钟人与人不能传播存在肉毒素抗毒素 （但对已经存在的症状无效）高纯度的保妥适高纯度的保妥适 治疗不会导致肉毒中毒治疗不会导致肉毒中毒肉毒中毒: 肉毒毒素导致的一种全身性全身性的反应保妥适是高度纯化的肉毒素局部局部注射治疗,直接注射在相关肌肉或腺体上如剂量合适,很少弥散到其它肌肉治疗剂量与中毒剂量相差很远皱眉纹标准剂量： 20U致死剂量致死剂量 (70kg 人人)静脉注射静脉注射 3,000 单位单位要导致死亡要导致死亡,需需静脉静脉注射注射30瓶以上保妥适瓶以上保妥适 每瓶保妥适每瓶保妥适 只含只含100单位单位纯化的肉毒素纯化的肉毒素每瓶保妥适含蛋白每瓶保妥适含蛋白5ng1ng = 10-9 g保妥适保妥适 是局部用药是局部用药BOTOX 弥散弥散效应效应剂量剂量Aoki, Neurology 2003; 60(5 Suppl 1):A212-A213 ABS-P03. 088本研究的临床相关性有待明确本研究的临床相关性有待明确靶肌肉靶肌肉邻近邻近肌肉肌肉全身全身作用作用在治疗剂量内，在治疗剂量内，血液中检测不到肉毒素血液中检测不到肉毒素前体毒素前体毒素900 KD 复合体复合体HA (Haemagglutinin) ,血凝素血凝素NTNH non-toxic non-haemagglutinins 非血凝素蛋非血凝素蛋白白COOHNH2NH2COOHS-SSSHeavyChain重链重链LC轻链轻链肉毒素结构肉毒素结构150 KD100 KD50 KD与靶位受体与靶位受体结合，促轻结合，促轻链内转链内转以锌肽链内切以锌肽链内切酶实施毒效酶实施毒效血凝素维持毒素三维结构稳定血凝素维持毒素三维结构稳定影响结构因素：影响结构因素：热变性，碱性条件热变性，碱性条件空气空气/液体介面形成的气泡改变毒素液体介面形成的气泡改变毒素形态，氮气形态，氮气/二氧化碳二氧化碳稀释至过低浓度稀释至过低浓度作用机理作用机理(1)(1)正常神经递质释放过程正常神经递质释放过程神经肌肉接头神经肌肉接头神经末梢神经末梢肌肉细胞肌肉细胞肌肉细胞肌肉细胞肌肉纤维收缩肌肉纤维收缩突触间隙突触间隙乙酰胆碱乙酰胆碱乙酰胆碱受体乙酰胆碱受体神经终点神经终点SNARE蛋白蛋白突触囊泡蛋白突触囊泡蛋白 突触融合蛋白突触融合蛋白 突触相关蛋白突触相关蛋白 突触囊泡突触囊泡SNARE 蛋白蛋白形成复合体形成复合体突触融合突触融合复合体复合体囊泡和终板囊泡和终板膜融合膜融合神经递质释放神经递质释放作用机理作用机理(2)(2)当有神经肉毒素时当有神经肉毒素时肌肉细胞肌肉细胞肌肉纤维瘫痪肌肉纤维瘫痪肉毒素肉毒素轻链水解特异轻链水解特异SNARE蛋白蛋白轻链轻链SNARE 复合复合体不能形成体不能形成膜没有膜没有融合融合神经递质神经递质不能释放不能释放肉毒素以肉毒素以胞饮方胞饮方式进入式进入重链重链B,D,F,G型型A,C,E 型型C 型型尚有其它作用机理尚有其它作用机理 如疼痛如疼痛作用机理录像作用机理录像作用过程作用过程主要步骤：结合（Binding） ： A型肉毒素的重链与运动神经终板上的乙酰胆碱受体高亲和结合摄入（Internalization)：毒素通过受体介导的胞饮作用进入细胞内。这一过程中神经末端细胞膜将毒素包裹，在神经末梢内形成毒素囊泡。摄入后，肉毒素的轻链从囊泡中被释放到胞浆内，现在已非常明确轻链具有阻断神经递质的功能结构。阻断 （Blocking)A型肉毒素通过裂解胆碱能神经末梢突触前膜内SNAP-25而阻滞乙酰胆碱的释放。SNAP-25是一种在细胞膜上促使神经末梢内囊泡与突触前膜顺利融合并释放乙酰胆碱的必需蛋白质。这过程阻止肌肉收缩，但并不影响神经递质的分泌和储存，也不影响电信号沿神经纤维传导。神经芽生 (Sprouting)充分证据表明肉毒素介导的神经肌肉接头的化学去神经化作用并没有影响终板区域，也没有影响轴突的生长，芽神经与终板结合连接释放神经递质神经再生“芽生”是暂时的，会逐渐消退，原始的神经肌肉接头恢复功能。乙酰胆碱的作用乙酰胆碱的作用颅神经 骶神经 胸腰神经 节前节前 神经节神经节 节后节后CNS副交感神经副交感神经交感神经交感神经交感神经交感神经交感神经交感神经躯体运动神经躯体运动神经AchAchAchAchAchAchAchNM交感神经交感神经NE NNNNAchMDNEpiAch胆碱能性神经：运动神经全部植物神经节前纤维大多数副交感神经节后纤维支配小汗腺和血管肌肉的交感神经节后纤维SNAP-25Ca+ ChannelsSyntaxinVAMP/ synaptobrevin还阻滞其它物质的释放还阻滞其它物质的释放对疼痛的作用GlutameatcGRPSubstance P躯体运动神经元躯体运动神经元 -梭外肌-收缩减少 梭内肌-传入信号减弱 内脏运动内脏运动神神经经元元- -内脏平滑肌收缩减少内脏平滑肌收缩减少腺体分泌减少腺体分泌减少痛觉感受器痛觉感受器肉肉毒毒毒毒素阻素阻滞滞位点位点作用机理的临床意义作用机理的临床意义BOTOXBOTOX 临床应用范围临床应用范围日日益益扩扩大大失失驰驰缓缓症症多汗多汗症症*偏头偏头痛痛斜斜视视*痉痉挛挛性性斜斜颈颈*脑瘫脑瘫眼眼睑睑痉痉挛挛*神神经经肌肌肉肉自自主主神神经经感感觉觉神神经经膀膀胱胱美容美容* 保妥适保妥适 全球被批准情况全球被批准情况83个国家，个国家，22个适应症个适应症保妥适保妥适 在中国的适应症在中国的适应症1998： 眼睑痉挛、面肌痉挛及相关 局灶性肌张力障碍。2009年2月：暂时改善65岁及65岁以下成人因皱眉肌/或降眉间肌活动引起的中度至重度皱眉纹。基本药理基本药理单位的定义有效性安全性抗原性单位的定义单位的定义生物制品用单位(Unit),而不用mg衡量肉毒素单位定义:1 Unit (单位) = i.p. LD50小鼠腹膜内注射配制后的本品溶液的半数致死量(LD50) 不同厂家的肉毒素单位（不同厂家的肉毒素单位（Unit）彼此不能互换）彼此不能互换有各自的实验和检测方法说明书：说明书：本品的推荐剂量不可与其他肉毒梭菌毒素制剂的剂量互换。文献上关于保妥适的推荐剂量只适用于保妥适，对其他A型肉毒毒素不一定适用。有效性的判断有效性的判断局部有效性：用DAS 评估Digit Abduction Score 小鼠后趾外展评分方法测试去神经化程度局部肌肉注射的 ED50 半数有效量DAS =2 时剂量DAS DAS 评分方法评分方法注射前注射前注射后注射后4 4分分 严重弱化严重弱化0 0分分 没变化没变化1 1分分2 2分分3 3分分用用DASDAS测试小鼠肌肉弱化程度测试小鼠肌肉弱化程度012340481216200.5% BSA/Saline.5u/kg (BoTx-A)1u/kg5u/kg10u/kg30u/kgDigit Abduction ScoreMean SEM (n=10)注射后天数注射后天数严重严重正常正常DAS DAS 量效关系量效关系 （对数值）（对数值）平平 均均 DAS 峰峰 值值毒素剂量毒素剂量, U/kg此图可用来比较不同产品的效力此图可用来比较不同产品的效力J. Francis Poster #51, Toxins 2005ToxinsED50 SEM (U/kg)保妥适保妥适X (n=6)3.4 0.3兰州兰州BTX-A (n=6)5.7 0.3Dysport (n=3)16.2 1.1Myobloc (n=5)23.4 1.4平均平均DAS (DAS (小鼠后趾外展肌评分方法测试去神经化程度小鼠后趾外展肌评分方法测试去神经化程度) )峰值效应曲线峰值效应曲线保妥适保妥适 效力最高的肉毒素效力最高的肉毒素*p 0.05 one-way ANOVA and post hoc Tukey t-test* *注意：注意： 非线性关系非线性关系 局部和全身效应：弥散系数局部和全身效应：弥散系数全全 身身 效效 应应弥弥散散平平 均均 DAS 峰峰 值值毒素剂量毒素剂量, U/kg达到最大达到最大局部效果局部效果弥散系数弥散系数 (Diffusion Margin)=Atr threshED50Atr thresh: 注射腓肠肌后引起注射腓肠肌后引起同侧四头肌萎缩的最低剂量同侧四头肌萎缩的最低剂量作为局部注射药，肉毒素一般作为局部注射药，肉毒素一般没有口服药所具有的全身作用没有口服药所具有的全身作用在临床使用中，很多副反应是在临床使用中，很多副反应是由于药物不适当弥散造成的由于药物不适当弥散造成的临近肌肉临近肌肉全身全身K. Roger Aoki, PhD, Pharmacology of Botulinum Toxins不同产品的弥散性不一样不同产品的弥散性不一样保妥适保妥适 弥散弥散其它肉毒毒素其它肉毒毒素 弥散弥散效应效应剂量剂量在达到最大局部在达到最大局部效应前就从注射效应前就从注射部位弥散出去了部位弥散出去了Aoki, Neurology 2003; 60(5 Suppl 1):A212-A213 ABS-P03. 088本研究的临床相关性有待明确本研究的临床相关性有待明确抗原性抗原性抗原: 能触发抗体产生的外来分子，抗原表面有非常特异性的抗体结合部位，这称为抗原决定簇。抗体: 抗体（也称为免疫球蛋白Ig）是针对抗原而产生的。只有相对应的抗原决定簇出现时，抗体才被激活。免疫应答反应具有记忆和强化功能中和抗体使毒素失去作用中和抗体使毒素失去作用中和中和抗体抗体中和中和抗体抗体非中和非中和抗体抗体非中和非中和抗体抗体抗原测试方法（抗原测试方法（I I）WBA （Western Blot Analysis 蛋白印迹分析） 不能区分中和抗体和非中和抗体ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验)分析血标本中有无保妥适抗体及其含量的敏感的体外方法。 ELISA不能区分保妥适的中和抗体与非中和抗体 抗原测试方法（抗原测试方法（IIII）MPA (Mouse-Protection Assay 小鼠保护试验)是目前测试抗体的金标准唯一能准确测试中和抗体的方法价格昂贵、费时, 只有阴性和阳性之分FTAT (Frontalis Antibody Test 前额抗体试验)简便,很快有结果与其它方法相关性好= 7.5 U= 15 U效果不佳不都是因为抗体效果不佳不都是因为抗体注射技术不正确如剂量过低或注射在错误的肌肉上对所注射的肌肉功能了解不全没有注射所有引起症状的肌肉要达到功能效果还需控制拮抗肌肌肉挛缩已到固定程度减少抗体产生的危险减少抗体产生的危险每次使用最低剂量也就是降低接触神经毒素蛋白(ng)的可能延长使用间隙由产品的作用时间决定使用高纯度，性质稳定/均一的产品 新配方大大降低抗体的产生率*Jankovic et al. (2003)Yablon et al. (2005):保妥适的特点保妥适的特点目前商用肉毒素目前商用肉毒素纯度高,质量恒定肉毒毒素是一种生物产品，其生产工艺远比化学药品复杂。很难做到批与批，瓶与瓶之间的质量恒定。 生产过程中不慎被灭活的肉毒毒素无治疗作用，但具有免疫原性，可激发肌体产生抗体，令使用者产生继发性无应答。 使使用用保保妥妥适适，医医生生可可精精确确知知道道所所注注射射的的剂剂量量，无无需需担担心心其其他他杂杂质质注注入入使用者体内。使用者体内。J. Francis Poster #51, Toxins 2005ToxinsED50 SEM (U/kg)BOTOX (n=6)3.4 0.3BTX-A (n=6)5.7 0.3Dysport (n=3)16.2 1.1Myobloc (n=5)23.4 1.4平均平均DAS (DAS (小鼠后趾外展肌评分方法测试去神经化程度小鼠后趾外展肌评分方法测试去神经化程度) )峰值效应曲线。峰值效应曲线。保妥适保妥适 效力最高的肉毒素效力最高的肉毒素*p 0.05 one-way ANOVA and post hoc Tukey t-test* *注意：注意： 非线性关系非线性关系 肉毒素彼此不等价！100U 100U 得到均一得到均一900KD900KD大大分子量分子量900 kDa500 kDa均一的均一的900KD900KD分子量分子量不容易弥散不容易弥散到周围肌肉到周围肌肉保妥适保妥适: 900,000 Dalton 水18 Dalton （50,000倍） 青霉素388.48 Dalton (2,317倍）分子量比较分子量比较弥散系数比较弥散系数比较Atr thresh: 注射腓肠肌后引起同侧四头肌萎缩的最低剂量在达到相同的疗效时, 保妥适比其它肉毒素更不容易弥散到远端肌肉J. Francis Poster #51, Toxins 2005 Presented at Toxins 2005, Denver, CO, June 22-25, 2005.良好的弥散系数良好的弥散系数全全 身身 效效 应应弥散系数弥散系数 (Diffusion Margin)=Atr threshED50Atr thresh: 注射腓肠肌后引起注射腓肠肌后引起同侧四头肌萎缩的最低剂量同侧四头肌萎缩的最低剂量作为局部注射药，肉毒素一般作为局部注射药，肉毒素一般没有口服药所具有的全身作用没有口服药所具有的全身作用在临床使用中，很多副反应是在临床使用中，很多副反应是由于药物不适当弥散造成的由于药物不适当弥散造成的临近肌肉临近肌肉全身全身BOTOX 弥散弥散 其它肉毒素其它肉毒素弥散弥散 效应效应剂量剂量在达到最大局部在达到最大局部效应前就从注射效应前就从注射部位弥散出去了部位弥散出去了 Atr thresh: 注射腓肠肌后引起同侧四头肌萎缩的最低剂量临床相关性需进一步确认临床相关性需进一步确认保妥适保妥适 能更好地集中在靶肌肉上能更好地集中在靶肌肉上保妥适保妥适 使用真空干燥法使用真空干燥法真空干燥法真空干燥法Vacuum Dried液体 固体冰冻干燥法冰冻干燥法Lyophilized固体 固体保妥适保妥适 其它其它A型肉毒素型肉毒素冻干易形成类毒素冻干易形成类毒素无活性，但有免疫原性无活性，但有免疫原性需要明胶作为稳定剂需要明胶作为稳定剂来降低冻干损失量来降低冻干损失量明胶是强致敏剂明胶是强致敏剂明胶可对冻干中的蛋白质起保护作用可能会引起疯牛病是强过敏源，国际上已不推荐为敷料国内的临床实验也显示， CBTX-A 组 5 例出现皮疹； BOTOX组无一例发生。 Blair et al. J Clin Neurosci 2004;22(Suppl 1):S103-4 ABS-POS3R NOT porcine汤晓芙万新华A 型肉毒毒素治疗局限性肌张力障碍和肌肉痉挛中华神经科杂志中华神经科杂志19991999年年6 6月第月第3232卷第卷第3 3期期含有明胶的肉毒素是强致敏剂反复暴露会增加皮肤过敏率图示为动物实验中的结果图示为动物实验中的结果保妥适始终是市场的领导者Source: AGN Global Mkt Research 2007 WW BoNT Market Sales $1.4 BAsia PacificMiddle EastMediterraneanEuropeJapanCanadaOutgoing SAENotificationMexicoBrazilSouth AmericaAndean & Central AmericaCarribean我们更关心产品销售出去后的问题我们更关心产品销售出去后的问题持续性地在全球收集安全性数据持续性地在全球收集安全性数据不良反应维持在较低水平不良反应维持在较低水平大量的文献支持保妥适大量的文献支持保妥适有效性和安全性有效性和安全性近4,000份资料宽度：100多个用法时间： Mejia N et al平均15.8年 Mejia N et al. Long-term botulinum toxin efficacy, safety and immunogenicity. Mov Disord 2005; 20(5):592597.我们力求提供给医生最有价值的服务我们力求提供给医生最有价值的服务www.botox.com我们力求提供给医生最有价值的服务我们力求提供给医生最有价值的服务注射软件注射软件注射记录表注射记录表外科记号笔外科记号笔保妥适保妥适 配制方法配制方法包装和防伪包装和防伪包装规格：包装规格：1支支/盒盒容器：带橡胶塞并用铝箔密封的容器：带橡胶塞并用铝箔密封的10ml容量容量的的I型无色玻璃瓶。型无色玻璃瓶。小瓶的标签上印有小瓶的标签上印有“Allergan”字样的全息字样的全息胶皮胶皮,上有平行的彩虹条文上有平行的彩虹条文为了能看到全息图片为了能看到全息图片,需要在台灯或荧光灯需要在台灯或荧光灯下前后旋转小瓶下前后旋转小瓶在生长日期在生长日期/批号地方没有全息图片批号地方没有全息图片配制步骤配制步骤: 1: 1最好在塑料布上进行配制，以防止液体的外溅。选用21Gauge（ 0.813mm）, 约1.5英寸（3.8cm）长的针头抽取适量(参见稀释表)的 不含防腐剂的生理盐水 (0.9% 氯化钠液)以45的角度将针插入保妥适瓶内，瓶内真空会将生理盐水自动吸入,为避免产生过多泡沫,请稍用力持住筒芯,使生理盐水缓慢进入。这一过程能检验瓶内是否真空，若为非真空则弃用。配制步骤配制步骤: 2: 2将注射筒从针头上拔下，让空气通过针头进入瓶内，中和负压。轻轻地旋转小瓶，使保妥适在生理盐水中溶解，不要翻转震动瓶子。配制步骤配制步骤: 3: 3用另一新的无菌注射筒接上针头，从瓶底一角抽出稀释液，勿将小瓶翻转。配制步骤配制步骤: 4: 4将用于配制的21Gauge( 0.813mm）针头拔下，换上与所注射适应症相应的针头：眼睑痉挛、面肌痉挛使用30Gauge（ 0.305mm）针头；如需肌电图引导定位，使用涂有特氟隆的针头.配制步骤配制步骤: 5: 5稀释表稀释表配制好的溶液应是无色至淡黄色的液体，不含任何颗粒使用配制溶液之前应肉眼检查澄明度及有无杂质，本品只能单次使用，剩余溶液应丢弃。附件针头度量附件针头度量ISO 9626: Stainless steel needle tubing for the manufacture of medical devices, Amendment 1. Geneva: International Organization for Standardization, 2001: 12. 废弃物处置废弃物处置未用过的药瓶:应用少量水稀释，然后高压灭菌所有用过的药瓶、注射器和沾有溅出液的器具高压灭菌消毒0.5% 或 1%次氯酸盐溶液消毒5分钟，灭活残留物主要参考资料主要参考资料Allergan Foundation Training ManualBotox Product InformationDas Gupla BR,Toxin,1984;22:415-42 Duff JT,JBacteriol, 1956;72:455-460J. Francis,et al. Poster #51, Toxins 2005 Presented at Toxins 2005，Denver，CO,June 22-25，2005Aoki KR, Toxin,2002; 40(7):923-928Edward J.Schantz,et al.Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine. Microbiological reviews.1992;56(1):80-99Foster AF et al. Botulinum neurotoxin from laboratory to bedside. Neurotoxicity Research 2006; 9(2,3): 133-40.汤晓芙等.A型肉毒毒素治疗局限性肌张力障碍和肌肉痉挛.1999；32（3）：135-138J. Jankovic,et al. Comparison of efficacy and immunogenicity of original versus current botulinum toxin in cervical dystonia. Neurology. 2003;60:11861188