DNA的粗提取和鉴定1优选课堂目的要求目的要求1 1、了解从细胞中提取、了解从细胞中提取DNADNA的基本原的基本原理理2 2、初步掌握、初步掌握DNADNA的粗提取和鉴定的的粗提取和鉴定的方法方法3 3、观察提取出来的、观察提取出来的DNADNA2优选课堂实验思路实验思路1、DNA从哪提取？从哪提取？2、怎样将、怎样将DNA与细胞中的其他物质分与细胞中的其他物质分离？离？3、怎样鉴定我们提取的、怎样鉴定我们提取的DNA？3优选课堂实验原理实验原理1. DNA1. DNA在在NaClNaCl溶液中的溶解度，是随着溶液中的溶解度，是随着NaClNaCl的浓度的的浓度的变化而改变的。当变化而改变的。当NaClNaCl的物质的量浓度为的物质的量浓度为0.14 mol0.14 molL L时时,DNA,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在在NaClNaCl溶液中的溶液中的DNADNA析出。析出。 2.DNA2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的含杂质较少的DNADNA。 3.DNA3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定胺可以作为鉴定DNADNA的试剂的试剂4优选课堂5优选课堂实验用具：实验用具：铁架台；铁环；镊子；三角铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（滤纸；滴管；量筒（100ml100ml，一个）；烧杯；，一个）；烧杯；（100ml100ml，一个，一个，50ml50ml、500ml500ml各二个）；各二个）；试管（试管（20ml20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱，二个）；漏斗；试管夹；纱布。布。 7优选课堂二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计（一）实验材料的选取 材料：新鲜的鸡血注意： 本实验中，要往鸡血中加入抗凝剂（柠檬酸钠溶液）原则上只要含DNA的生物材料都可以，但是选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。8优选课堂(1)先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞(2)在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、破碎细胞讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 利用了什么原理？2、过滤，获取含DNA的滤液9优选课堂（三）去除滤液中的杂质为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白和RNA等杂质10优选课堂讨论：为什么反复地溶解与析出讨论：为什么反复地溶解与析出DNADNA，能够去除杂质，能够去除杂质答：用高盐浓度的溶液溶解答：用高盐浓度的溶液溶解DNADNA，能除去在高盐中，能除去在高盐中不不能能溶解溶解的杂质；用低盐浓度使的杂质；用低盐浓度使DNADNA析出，能除去析出，能除去溶解溶解在低在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNADNA，就，就能够除去与能够除去与DNADNA溶解度不同的多种杂质溶解度不同的多种杂质11优选课堂（四） DNA的析出与鉴定DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95），静置2-3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水1、DNA的析出12优选课堂13优选课堂2、 DNA的鉴定鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色14优选课堂（一）案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取三、实验案例用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长1、鸡血细胞做实验材料的原因鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得15优选课堂4、课前准备鸡血细胞液取质量浓度为01g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）过程16优选课堂17优选课堂柠檬酸钠作用防止血液凝固作用机理柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液就不会凝固鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液注意事项18优选课堂讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆5、方法步骤 将制备好的鸡血细胞液5 mL10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。提取鸡血细胞的细胞核物质19优选课堂20优选课堂讨论：答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA21优选课堂溶解细胞核内的DNA将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol的溶40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 molL）析出含DNA的粘稠物22优选课堂讨论：加入蒸馏水的目的？降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕注意事项：23优选课堂滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在纱布上将DNA的粘稠物再溶解取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 molL的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中24优选课堂过滤含有DNA的氯化钠溶液取1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为 95的溶液 50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA25优选课堂答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中讨论：（2）观察丝状物呈什么颜色？答：白色（1）为什么要加50mL的冷酒精？26优选课堂取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0015 molL的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化 DNA的鉴定27优选课堂28优选课堂30优选课堂答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”6、讨论：两次蒸馏水第一次：细胞吸水胀破 第一步第二次：使 DNA黏稠物析出 第三步（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？31优选课堂过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为12层三次过滤第一次： DNA存在于滤液里 第一步第二次： DNA被留在纱布上 第四步第三次： DNA存在于滤液里 第六步32优选课堂两次析出第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液含杂质多第三步第二次：用冷却的95的酒精第七步六次搅拌：第一、二、三、五、七步其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA33优选课堂讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离 方案二利用了酶的专一性；方案三利用了DNA的稳定性。34优选课堂35优选课堂5分鐘內做出自己的DNA 材料： 萃取出DNA的材料（人） 含有SDS的清潔劑（幾乎大部分都有） 食鹽 水 嫩精（木瓜酵素papain） 筷子 吸管 透明杯子 95%酒精 36优选课堂5分鐘內做出自己的DNA 方法： 1. 95%酒精放在冰箱備用。 2. 緩衝液：120ml的水+1又1/4茶匙的鹽+一點點洗髮精+一點點嫩精，輕輕攪拌後放在冰箱備用。 3. 準備萃取DNA的材料：取10ml的水漱口1分鐘，吐在杯子裡，加入20ml的緩衝液，以筷子輕輕攪拌2分鐘。 4. 用吸管吸取95%的酒精從杯壁慢慢加入杯中。酒精會浮在上層，接著就會出現絲狀物，那就是你的DNA。 準備小罐子裡頭加上70%的酒精，再把DNA放進去，你就會擁有特別的禮物囉！拿自己的DNA送人，不錯喔！(情人節送雙套，不要送單套）37优选课堂