抗氧化活性研究方法以酶标法清除以酶标法清除DPPHDPPH自由基为主自由基为主目录v一一. .检测抗氧化活性的原因检测抗氧化活性的原因v二二. .自由基的产生及抗氧化的重要性自由基的产生及抗氧化的重要性v三三. .检测方法检测方法v四四.DPPH.DPPH法（原理，一般方法，酶标法）法（原理，一般方法，酶标法）v五五.ABTS.ABTS法法 v六六.TBARS.TBARS法法v七七. .铁离子还原能力铁离子还原能力(FRAP)(FRAP)一.检测抗氧化活性的原因 1.1.天然植物中许多化学物质具有抗氧化活性天然植物中许多化学物质具有抗氧化活性2.2.抗氧化剂有延缓衰老等功效，越来越受到人们关注抗氧化剂有延缓衰老等功效，越来越受到人们关注3.3.据文献记齐墩果酸型三萜有较好的抗氧化活性据文献记齐墩果酸型三萜有较好的抗氧化活性4.4.抗氧化活性测试简单，快捷，经济抗氧化活性测试简单，快捷，经济 二.自由基的产生及抗氧化的重要性抗氧化剂抗氧化剂自由基对人体造成的伤害自由基对人体造成的伤害天然植物天然植物三.检测方法v目前常用的抗氧化活性检测方法主要基于以下机理：目前常用的抗氧化活性检测方法主要基于以下机理：v(1)(1)在特定条件下，样品对检测体系中在特定条件下，样品对检测体系中脂类物质的氧化抑脂类物质的氧化抑制能力制能力反映被测物的抗氧化活性；反映被测物的抗氧化活性；（TBARSTBARS法）法）v(2)(2)在特定条件下，样品对检测体系中在特定条件下，样品对检测体系中自由基的清除能力自由基的清除能力反映被测物的抗氧化活性；反映被测物的抗氧化活性；（DPPHDPPH自由基的清除）自由基的清除）v(3)(3)在特定条件下，测定样品的在特定条件下，测定样品的还原能力还原能力反映被测物的抗反映被测物的抗氧化活性。氧化活性。（还原还原FeFe3 3+ +） 四.DPPH法 1. 1.原理原理 DPPH(DPPH(二苯代苦味酰基自由基二苯代苦味酰基自由基) ) 是一种以氮为中心的是一种以氮为中心的稳定稳定自由基自由基。 特点：特点：醇溶液呈紫色醇溶液呈紫色，波长为波长为517nm517nm下具有最大吸收。下具有最大吸收。 具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，有自由基有自由基清除剂存在时，清除剂存在时，DPPHDPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降在最大光吸收波长处的吸光值下降, ,吸光度水平的降低表吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧化能力。明抗氧化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧化能力。此抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化性此抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化性越强。越强。实验步骤 2. 2.实验步骤实验步骤 （1 1）酶标法检测）酶标法检测酶标仪酶标仪v取取9696孔细胞培养板，各孔分别加入孔细胞培养板，各孔分别加入150150molmolL L- 1- 1的的DPPHDPPH溶液溶液180L180L, ,各浓度梯度各浓度梯度样品样品溶液溶液2 20 0LL, ,终浓度分别为终浓度分别为3 3. .9 9 5 50000molmolL L- 1- 1，反应总体积，反应总体积200L200L, ,以溶剂作对照。加以溶剂作对照。加样后样后，振荡混匀。封板胶封板后，室温下避光静置振荡混匀。封板胶封板后，室温下避光静置。分别分别在在1010 120min120min时间范围内时间范围内于于517nm517nm处测定各孔吸光度值处测定各孔吸光度值。观观察察样品样品抗抗DPDPP PH H的时效量效变化过程，确定实验的稳定性和的时效量效变化过程，确定实验的稳定性和最佳实验反应时间。最佳实验反应时间。v计算公式为计算公式为: :清除率清除率( ()=A)=A( (溶剂溶剂) )- A- A( (样品样品) )/A/A（溶剂溶剂）x x100100 VitEVitE清除清除DPPHDPPH自由基抗氧化量效曲线自由基抗氧化量效曲线1 10 0- -120m120mi in n内内, ,随着随着作作用时间的延长用时间的延长VitEVitE抗抗DPPHDPPH作用作用增增强强，但在但在3 3. .9 9- - 3131. .2mol2molL L- 1- 1范范围内，各时间点的围内，各时间点的药效变化不药效变化不明明显显，6262. .5 5- -500mol500molL L- -1 1浓度范围，随着浓浓度范围，随着浓度增加度增加，各时间点各时间点的药物作用曲线逐的药物作用曲线逐渐分离渐分离，并在，并在500500molmolL L- -1 1，各各时间点量效趋于平时间点量效趋于平稳。从稳。从图图中可以看中可以看出，在这些时间点出，在这些时间点中，中，30min30min的量效曲的量效曲线基本呈斜线上升。线基本呈斜线上升。30min30minVitEVitE清除清除DPPHDPPH自由基抗氧化量效曲线自由基抗氧化量效曲线 反应时间反应时间t t为为30min30min的量效曲线的量效曲线（相关系数）（相关系数）实验步骤 （2 2）一般方法）一般方法紫外分光光度计法紫外分光光度计法 将样品用甲醇配制成一系列浓度，取将样品用甲醇配制成一系列浓度，取0.1mL0.1mL样品加入样品加入3.5 3.5 mL DPPHmL DPPH甲醇溶液甲醇溶液(0.06 mmol/L)(0.06 mmol/L)，混合，混合30min30min后测定后测定515 515 nmnm处吸光度。每份样品平行操作处吸光度。每份样品平行操作3 3次。次。 计算公式为计算公式为: :清除率清除率( ()=A)=A( (溶剂溶剂) )- A- A( (样品样品) )/A/A（溶剂溶剂）x x100100酶标法优势 3. 3.酶标法优势酶标法优势 抗氧化微孔板实验方法的优势：抗氧化微孔板实验方法的优势：耗材量少，试剂量以微耗材量少，试剂量以微升计；升计；试剂种类少，部分试剂配制可交互使用；试剂种类少，部分试剂配制可交互使用；方法方法简便，耗时短；简便，耗时短；可重复性强，可以广泛应用于药物筛选，可重复性强，可以广泛应用于药物筛选，特别是高通量药物筛选研究。特别是高通量药物筛选研究。五.ABTS法 1. 1.原理原理 以水溶性的以水溶性的ABTSABTS+ +自由基引发剂为显色剂。自由基引发剂为显色剂。 特点：特点：ABTSABTS与过硫酸钾反应生成稳定的蓝与过硫酸钾反应生成稳定的蓝/ /绿色阳离子自绿色阳离子自由基由基ABTSABTS+ +，最大吸光波长为最大吸光波长为734nm734nm。 向向ABTSABTS+ +其中加入被测物质，如果该物质中存在抗氧化成分，其中加入被测物质，如果该物质中存在抗氧化成分，则该物质会与则该物质会与ABTS+ABTS+发生反应而使反应体系发生反应而使反应体系褪色褪色，然后在，然后在ABTSABTS+ +这种自由基的这种自由基的734nm734nm吸光波长下检测吸光度的变化来吸光波长下检测吸光度的变化来反映物质的抗氧化能力。反映物质的抗氧化能力。实验步骤 2. 2.实验步骤实验步骤v将样品用甲醇配制成一系列浓度将样品用甲醇配制成一系列浓度, ,取取0 0. .15mL15mL样品加入样品加入2 2. .85mLABTS85mLABTS自由基工作液自由基工作液，混合，放置混合，放置10min10min后后, ,在在734nm734nm处测定吸光度处测定吸光度。每份样品平行操作每份样品平行操作3 3次次。v计算公式为计算公式为：清除率清除率( ()=A)=A( (溶剂溶剂) )- A- A( (样品样品) ) /A /A（溶剂溶剂） 100100 vA A（溶剂）（溶剂）为为2 2. .85 mLABTS85 mLABTS溶液与溶液与0 0. .15mL15mL甲醇混合后的吸度甲醇混合后的吸度，A A（样品）（样品）为为2 2. .85mLABTS85mLABTS溶液与溶液与0 0. .15mL15mL样品混合后的吸光度。样品混合后的吸光度。 ABTS法优缺点 3. 3.优缺点优缺点 简便，快速，简便，快速，适合于大量样品的检测适合于大量样品的检测。 ABTSABTS在与氢原子供体的反应中在与氢原子供体的反应中选择性差选择性差是此法的一个不足，是此法的一个不足，它它可与任何羟基化的芳香族化合物反应可与任何羟基化的芳香族化合物反应，这与它们的实际，这与它们的实际抗氧化能力关，因此抗氧化能力关，因此,T,TEACEAC值也包括对抗氧化不起作用的值也包括对抗氧化不起作用的羟基。羟基。六.TBARS法 简介简介 脂质体系中氧化反应抑制或中止的判断主要通过测量被氧脂质体系中氧化反应抑制或中止的判断主要通过测量被氧化物的浓度，氧的去除或氧化产物的形成。化物的浓度，氧的去除或氧化产物的形成。因此，反应物因此，反应物( (不饱和脂肪酸，自由基等不饱和脂肪酸，自由基等) )的消失，的消失，氧化产物的定量氧化产物的定量可能可能是判断氧化阶段的最合适方法。通过直接或者间接检测氧是判断氧化阶段的最合适方法。通过直接或者间接检测氧的消失和自由基的电子自旋光谱，适用于氧化过程的初始的消失和自由基的电子自旋光谱，适用于氧化过程的初始阶段。通常采用阶段。通常采用TBARSTBARS法来评价脂质的过氧化法来评价脂质的过氧化. .七.铁离子还原能力(FRAP) 原理原理 FRAPFRAP的原理是基于氧化还原反应的比色法的原理是基于氧化还原反应的比色法。在酸性条件下，在酸性条件下，FeFe3+3+一一TPTATPTA(Fe(Fe3+3+三吡啶三嗪三吡啶三嗪) )被抗氧化剂还原成被抗氧化剂还原成FeFe2+2+一一TPTTPTZFZF，溶液变成深蓝色，并且在溶液变成深蓝色，并且在593593nmnm处有强吸收。处有强吸收。FRAPFRAP法具有快速、简便、重复性好等优点法具有快速、简便、重复性好等优点。该法不仅用于检测。该法不仅用于检测食物及饮料的抗氧化活性。也可用于检测纯天然抗氧化剂食物及饮料的抗氧化活性。也可用于检测纯天然抗氧化剂的活性。的活性。