ABioCellABioCell第三章第三章 细胞融合与单克隆抗体细胞融合与单克隆抗体ABioCellABioCell3.1 细胞融合细胞融合(cell fusion)定义定义: :在离体条件下用人工的方法把在离体条件下用人工的方法把 不同种的细胞通过无性方式融不同种的细胞通过无性方式融 合成一个杂合细胞的技术合成一个杂合细胞的技术。ABioCellABioCell3.1.1细胞融合的发展历史“自发自发”细胞融合现象：细胞融合现象：1838年年 Muller 多核的肿瘤细胞多核的肿瘤细胞1858年年 Virchow 正常组织、发炎组织及肿正常组织、发炎组织及肿 瘤组织瘤组织多核细胞多核细胞1873年年 Luginbuhl 天花病人天花病人多核体血细胞多核体血细胞1875年年 Lange 蛙类血液细胞发生合并蛙类血液细胞发生合并ABioCellABioCellABioCellABioCellABioCellABioCell重要事件重要事件v19621962年年,(,(日日) )冈田善雄冈田善雄 仙台病毒促细胞融合仙台病毒促细胞融合v 7070年代年代,(,(华裔加籍华裔加籍) )高国楠高国楠 PEGPEG促植物原生促植物原生 质体的融合质体的融合v 8080年代，电融合年代，电融合ABioCellABioCell植物细胞融合：植物细胞融合：1972年（美）年（美）P.S.Carlson杂种烟草杂种烟草现代植物细胞融合的开始现代植物细胞融合的开始1978年（德）梅歇尔斯年（德）梅歇尔斯“potomo”ABioCellABioCell“Pomoto ”ABioCellABioCell 3.1.2 植物原生质体培养与细胞融合植物原生质体培养与细胞融合 (Protoplast and Cell fusion)植物原生质体培养植物细胞融合ABioCellABioCell3.1.3 3.1.3 动物细胞融合动物细胞融合 动物细胞融合是研动物细胞融合是研究细胞遗传信息转究细胞遗传信息转移，基因在染色体移，基因在染色体上的定位以及创造上的定位以及创造新细胞株的有效途新细胞株的有效途径。径。肿肿瘤瘤细细胞胞与与树树突突状状细细胞胞的的融融合合ABioCellABioCell人纤维肉瘤细胞与小鼠畸胎瘤细胞融合人纤维肉瘤细胞与小鼠畸胎瘤细胞融合1978年年(瑞士瑞士)埃勒门埃勒门斯斯 (美国美国)柯路斯柯路斯ABioCellABioCellABioCellABioCell3.1.4 细胞融合的诱导细胞融合的诱导诱导融合的方法诱导融合的方法: :物理法物理法:电场刺激电场刺激 激光激光 显微操作显微操作 化学法化学法:聚乙二醇聚乙二醇(PEG)结合高结合高pH、 高钙离子法高钙离子法生物法生物法:仙台病毒仙台病毒ABioCellABioCell不同细胞融合的条件及其主要应用不同细胞融合的条件及其主要应用来来 源源前前处理处理融合方法融合方法主要应用主要应用动物细胞动物细胞不需不需仙仙台台病病毒毒、PEGPEG、电融合电融合生生产产单单克克隆隆抗体抗体植物细胞植物细胞脱壁脱壁PEGPEG、电融合电融合创创造造植植物物新新品种品种微生物细胞微生物细胞脱壁脱壁PEGPEG高产优质新高产优质新菌种菌种ABioCellABioCell仙台病毒诱导仙台病毒诱导仙台病毒仙台病毒(Sendal virus)也称日本血凝病毒也称日本血凝病毒HVJHVJ，属粘病毒副流感类，属粘病毒副流感类群，是群，是RNARNA病毒，多型颗粒状，易在小鼠中病毒，多型颗粒状，易在小鼠中蔓延。蔓延。 ABioCellABioCell融合的可能机制：融合的可能机制： 病毒被膜含有糖蛋白，其表面还分布有许多具有神经氨酸酶和凝血活性的突起，神经氨酸酶可降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集，再通过膜上蛋白质分子的重新分布，使膜中的脂类分子重排，而打开质膜，导致细胞融合。仙台病毒诱导仙台病毒诱导ABioCellABioCell融合过程：融合过程：1. 病毒颗粒附着细胞膜上起搭桥作用，使细胞 粘着成堆，在4冰浴中细胞紧密靠近，但不 发生融合。2. 37 温浴后，粘结部位的细胞膜破坏，形成 通道，细胞质流通、融汇。3. 病毒颗粒进入细胞质，此时两个细胞合并、 变圆，完成融合，全过程约1530分钟。4. 细胞核也相互合并,完成细胞融合仙台病毒诱导仙台病毒诱导ABioCellABioCell仙台病毒诱导仙台病毒诱导ABioCellABioCellPEG诱导诱导PEG聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol) 商品名：卡波蜡商品名：卡波蜡(carbowax)多聚化合物，分子式多聚化合物，分子式H(OCH2CH2)nOH实验室用实验室用PEG平均分子量在平均分子量在20020,000一般：一般：1,000固体固体常用分子量：常用分子量：40006000PEG诱导诱导ABioCellABioCell融合的可能机制融合的可能机制？脱水作用能使细胞凝聚，并使膜结构发生脱水作用能使细胞凝聚，并使膜结构发生 变化变化？改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋 白质颗粒聚集及膜脂分子随之发生重排之白质颗粒聚集及膜脂分子随之发生重排之 故。故。 ？PEG诱导诱导ABioCellABioCell初步分析初步分析 可能是由于带有大量负电荷的可能是由于带有大量负电荷的PEGPEG分子和原分子和原生质体表面的负电荷间，在钙离子的连接生质体表面的负电荷间，在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高粘着和结合，在高pHpH、高钙离子溶液的作、高钙离子溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的用下，将钙离子和与质膜结合的PEGPEG分子洗分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。形成具有共同质膜的融合体。PEG诱导诱导ABioCellABioCellPEGPEG诱导过程注意事项：诱导过程注意事项：PEG诱导诱导悬浮法：将细胞悬于悬浮法：将细胞悬于40405050的的PEG4000PEG4000进行进行 溶，处理溶，处理1 12 2分钟为宜。分钟为宜。离心法离心法：先将细胞混合物悬于先将细胞混合物悬于30304040的的 PEG4000PEG4000，再离心进行融合，则可适，再离心进行融合，则可适 当延长融合时间，以当延长融合时间，以5 58 8分钟为宜。分钟为宜。 控制与分子量、浓度和处理时间控制与分子量、浓度和处理时间ABioCellABioCellPEGPEG诱导注意事项：诱导注意事项：l 辅以辅以515的的DMSO或在融合前用或在融合前用 PHA处理一下，效果更好。处理一下，效果更好。lpH值以值以pH7.48.0为宜，或略偏碱性为宜，或略偏碱性 pH8.08.2。PEG诱导诱导ABioCellABioCellPEG融合法优点融合法优点 效率高 材料方便，操作简易 效果稳定PEG诱导诱导PEG融合法缺点融合法缺点 对细胞有毒性ABioCellABioCellPEG诱导诱导ABioCellABioCell物理电融合诱导物理电融合诱导电融合诱导电融合诱导机制机制在直流电脉冲的诱导下在直流电脉冲的诱导下, , 原生质体质膜表面原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位变化的电荷和氧化还原电位变化, , 使原生质体粘使原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂合并发生质膜瞬间破裂, ,进而质膜开始连接进而质膜开始连接, ,直到闭合成完整的细胞融合体直到闭合成完整的细胞融合体ABioCellABioCell电融合诱导法原理示意图电融合诱导法原理示意图电融合诱导电融合诱导ABioCellABioCell电融合优点：电融合优点：u融合效率高，可达融合效率高，可达5080u产生杂交细胞的频率高，是产生杂交细胞的频率高，是PEG法的法的100倍。倍。 u操作简便、稳定，但需设备。操作简便、稳定，但需设备。u对细胞无毒害作用。对细胞无毒害作用。u可在显微镜下观察操作。可在显微镜下观察操作。电融合诱导电融合诱导ABioCellABioCell融合率融合率融合细胞的细胞核总数融合细胞的细胞核总数视野内全部细胞的细胞核总数视野内全部细胞的细胞核总数 100融合率融合率=ABioCellABioCell植物细胞融合基本过程植物细胞融合基本过程1.去除细胞壁以获得大量的原生质体去除细胞壁以获得大量的原生质体2.诱导细胞融合形成杂种细胞诱导细胞融合形成杂种细胞 细胞相互靠近细胞相互靠近 形成细胞桥形成细胞桥 最关键的一步最关键的一步 胞质渗透胞质渗透 细胞核融合细胞核融合3.筛选筛选,培养培养,促进细胞分裂促进细胞分裂,分化分化,4.从细胞团从细胞团,愈伤组织到最后成株愈伤组织到最后成株ABioCellABioCell动物单个细胞的获得动物单个细胞的获得动物细胞融合基本过程动物细胞融合基本过程组织的获得组织的获得组织的消化组织的消化诱导细胞融合形成杂种细胞诱导细胞融合形成杂种细胞 筛选，培养筛选，培养ABioCellABioCellABioCellABioCell植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合的原理细胞融合的原理细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞融合的方法细胞融合的方法去处细胞壁后诱去处细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合诱导方法诱导方法物理（显微操作、物理（显微操作、电融合电融合）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒用途用途获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗体制备单克隆抗体ABioCellABioCell影响细胞融合的因素影响细胞融合的因素 (1) 亲本细胞表面性质，表面覆盖绒毛而不规则 者较易融合；表面光滑者较难融合。(2) 细胞种类不同，融合效果不同，如腹水癌及 株化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞 几乎不融合。 (3) 细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙 台病毒诱导欧利希氏腹水癌细胞融合时，于 37 振摇时易于融合，且融合效率与病毒量 呈正比。但在34 振摇则融合率下降。在 37时不振摇则几乎不融合。 影响细胞融合的因素影响细胞融合的因素ABioCellABioCell(4)细胞融合过程中，通常耗氧量较大缺氧时经常 不融合。空气中含氧量大于20时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件下也可融合。(5)有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，细胞蛋 白质亦发生变化。实验表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、 Mn2+等离子可代替Ca2+但有效浓度较Ca2+大 的多。融合时最适合的离子强度一般为0.1mol/L(6)最适合的pH为7478之间，在此范围之外， 融合率均较低。影响细胞融合的因素影响细胞融合的因素ABioCellABioCell融合细胞的特征及其意义融合细胞的特征及其意义染色体组不稳定，尤其种间杂交细胞,培养过程中染色体会逐渐丢失 ABioCellABioCell理论研究基因定位和绘制基因图工作中 十分有用应用价值单克隆抗体 植物育种ABioCellABioCell融合细胞类型融合细胞类型同核体（同核体（homokaryon）异核体异核体(heterokaryon）多核体（多核体（polykaryon）异胞质体异胞质体(heterocybrid)ABioCellABioCell 同核体同核体(homokaryon)同源细胞的融合体。由于是同源细同源细胞的融合体。由于是同源细胞，它们的基因型及表现型完全一胞，它们的基因型及表现型完全一样。样。ABioCellABioCell异核体异核体(heterokaryon) 非同源细胞的融合体。一般是亲源非同源细胞的融合体。一般是亲源关系较近的细胞，这种亲和杂种细关系较近的细胞，这种亲和杂种细胞含有双亲全部细胞核和细胞质物胞含有双亲全部细胞核和细胞质物质，其发育的个体也是可育的，如质，其发育的个体也是可育的，如烟草属种间的细胞杂种。烟草属种间的细胞杂种。ABioCellABioCell多核体多核体(polykaryon) 含有双亲不同比例核物质的融合体。亲含有双亲不同比例核物质的融合体。亲源关系较远的细胞间融合，融合体以一源关系较远的细胞间融合，融合体以一个细胞的核物质为主，只加入另一细胞个细胞的核物质为主，只加入另一细胞少量遗传物质，如胡萝卜与羊角芹形成少量遗传物质，如胡萝卜与羊角芹形成部分亲和的杂种细胞。部分亲和的杂种细胞。ABioCellABioCell异胞质体异胞质体(heterocybrid) 不同胞质来源。用射线或细胞松弛素不同胞质来源。用射线或细胞松弛素B处处理一亲本细胞，使其选择性地丢失核基理一亲本细胞，使其选择性地丢失核基因形成一个无核的亚原生质体，再与一因形成一个无核的亚原生质体，再与一个有核的原生质体融合，获得一个完整个有核的原生质体融合，获得一个完整的原生质体与另一亲本的细胞质融和的的原生质体与另一亲本的细胞质融和的异胞质体。异胞质体。ABioCellABioCell杂种细胞筛选方法（1）遗传互补筛选法（2）抗性互补筛选法（3）生长特性筛选法（4）物理特性筛选法