蛋白质检测研究进展蛋白质检测研究进展Contents1、蛋白质简介2、蛋白质的检测方法3、蛋白质与疾病的关系蛋白质简介 蛋白质是由氨基酸脱水缩合形成的空间结构复杂的大分子有机物，其主要化学元素为 C（约 50%）、O（约23%）、N（约16%）、H（约7%）、S（约 03%）。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，蛋白质既具有氨基酸的部分理化特性，也具有其它有机物的一些共性以及众多的自身独有特点与性质： 高分子、两性解离及等电点、水合作用、变性作用、显色反应（双缩脲反应、Folin-酚反应、茚三酮反应、米伦反应、黄蛋白反应、乙醛酸反应、坂口反应、偶氮反应、考马斯亮蓝反应、氨基酸的-氨基及-羧基反应、）蛋白质的异常表达与体内多种疾病的发生发展息息相关 蛋白质的检测方法传统蛋白质检测方法：免疫印迹法；酶联免疫吸附试验常规方法： 物理法：紫外吸收法 化学法：凯氏定氮法；比色法高效液相色谱法毛细管凝胶电泳法近红外光谱法质谱法荧光法免疫印迹法（ Western blot）原理：蛋白样品经过电泳分离后，转移并固定于膜上，然后应用抗原抗体反应进行特异性检测的方法。 Western 杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定相结合的特异性蛋白质的检测方法免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的定性方法，也可以作为确定同一种蛋白质在不同细胞或同一种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法。免疫印迹法检免疫印迹法检测样品中特异测样品中特异蛋白质的基本蛋白质的基本流程流程样品的凝胶电泳样品的凝胶电泳蛋白印迹蛋白印迹封闭反应封闭反应与特异性抗体（一抗）孵育与特异性抗体（一抗）孵育与酶耦联的二抗孵育与酶耦联的二抗孵育显色或化学发光显影显色或化学发光显影观察和记录结果观察和记录结果酶联免疫吸附试验原理：酶联免疫吸附试验（ enzyme linked immunosorbant assay，ELISA）是一种固相免疫测定技术，先将已知的抗原或抗体包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗原或抗体发生特异性反应。最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其光密度（OD）值的大小进行定性或定量分析。优点：灵敏度高；特异性好；简便；重复性好。ELISA 和 Western 杂交都利用抗原抗体间的分子识别作用，借助不同的抗体分子标记实现蛋白质的检测。紫外吸收法 理论基础：蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在 280 nm 处具有紫外吸收， 其吸光度与蛋白质含量成正比。 此外，蛋白质溶液在 238 nm 的吸光度值与肽键含量成正比。 利用一定波长下蛋白质溶液的吸光度值与蛋白质浓度的正比关系可以测定蛋白质含量。优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收缺点:准确度较差、专一性差、干扰物质多，若样品中含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰凯氏定氮法理论基础：1.各种蛋白质的含氮量很接近，通常占其总重量的16左右。2.蛋白质样品用浓硫酸消化后，可以转变为硫酸铵，硫酸铵中的NH4+与NaOH反应又可转变为NH3，用硼酸液吸收后，可由标准盐酸滴定并定量。凯氏定氮法由于蛋白质是体内的主要含氮物，因此，通过测定生物样品的含氮量便可估算出样品中的总蛋白质含量。 蛋白质含量含氮量 6.25此方法的测定范围为0.21.0 mg氮。优点：应用范围广，重现性好、准确度高缺点：局限于样品中总蛋白的检测，破坏蛋白质结构，易受到被测样品中其它有机含氮化合物的干扰比色法-双缩脲法原理：蛋白质含有两个以上的肽键，故有双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）反应。在碱性条件下，肽键的质子被解离，Cu2+和失去质子的多肽链的氮相结合产生稳定的紫色络合物，在540560 nm的光吸收值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。由于与双缩脲试剂与不同种类的蛋白质反应产物的颜色差别极小，使得该方法比较适合总蛋白质的检测。优点：操作简单、测量速度快缺点：灵敏度较差，精度不高比色法-Folin-酚试剂/Lowry法原理：1、蛋白质在碱性条件下与试剂甲（双缩脲试剂）中的Cu2+形成络合物。 2、由于蛋白质含芳香族氨基酸残基（如Tyr和Trp），生成的络合物可还原试剂乙（Folin-酚试剂）中的磷钼酸和磷钨酸而产生钼蓝和钨蓝复合物，该复合物显蓝色，其颜色深浅与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系，可用于定量分析。优点：反应灵敏，检测限低，比较适合微量蛋白质的测量缺点：Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定因而要求精确控制操作时间，且容易受去酚类、糖类、尿素等多种物质的干扰。此外，而不同的蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，导致在不知道蛋白质种类的情况下测量结果存在部分偏差。比色法-BCA法BCA （Bicinchoninic acid) 试剂的主要成分为二喹啉甲酸钠。BCA并不能直接与蛋白质发生化学或是物理上的反应，而是对双缩脲反应的强化。BCA 极易与 Cu+结合形成紫色的复合物，该复合物在 562 nm 处有最大吸收峰，对入射光的吸收程度与 Cu+的浓度成正比。比色法-BCA法优点：稳定性好、显色灵敏度高，显色灵敏度与 Folin-酚法相当，且不受去垢剂、变性剂的影响缺点：反应速度慢，易受糖类、尿素、B2 巯基乙醇等物质的干扰，比Folin-酚法对糖类更加敏感比色法-考马斯亮蓝法理论基础：1、考马斯亮蓝属于三苯甲烷类染料，分为 G-250 和 R-250 两种，是目前使用最为广泛的一种蛋白质染色剂。2、考马斯亮蓝 G-250 在游离状态下呈红色，吸收峰位置为 488 nm 左右，容易与蛋白质中的精氨酰和赖氨酰残基结合，结合后颜色变为蓝色，最大吸收峰的位置转移到 595nm。优点：结合稳定、反应速度快、显色灵敏度高，操作简便，不受酚类、游离氨基酸、络合剂等成分干扰缺点：不同蛋白质中的精氨酰和赖氨酰残基的含量不同，因此其与不同的蛋白质结合有强有弱，导致测量不同的蛋白质时存在较大偏差比色法-茚三酮法茚三酮，又名苯并戊三酮，溶于水后与水分子结合形成水合茚三酮，进而可与氨、一级胺、二级胺发生化学反应生成紫蓝色或黄色缩合物。茚三酮法可用于水解蛋白质的检测。比色法-茚三酮法 以氨基酸为例，首先在弱酸性加热条件下氨基酸与水合茚酸酮发生氧化反应，氨基酸脱去氨基和羟基变成醛类化合物，水合茚三酮吸收氨基并脱去分水子变成胺合茚三酮。随后胺合茚三酮与茚三酮反应生成席夫碱，并最终形成紫蓝色或黄、棕色化合物，产物颜色的深浅与蛋白质的浓度相关，最大吸收波长为 570 nm 左右。优点：极高的显色灵敏度和良好的检出限缺点：水合茚三酮和不同的氨基酸显色程度有所差异，蛋白质水解程度的不同容易对测量结果造成较大误差。此外，茚三酮显色剂的稳定性较差，不利于长期存储高效液相色谱法原理：1、利用组分在两相中的热力学分配系数和动力学扩散系数差异来实现混合组分分离 2、由于不同的物质的溶解度、蒸汽压、吸附能力等物理化学性质存在差异，它们在流动相和固定相之间的分配系数有所不同，当两相做相对运动时样品组分在两相之间进行多次连续分配，最终实现各组分的彼此分离优点：其分离柱寿命长、分离效率高、分析时间短、进样量小、检测灵敏度高 缺点：对组成单位相似、分子极性相近、分子大小不同的动植物蛋白组分分离效果不佳近红外光谱法原理：当红外光照射样品分子时，极性共价键选择性地吸收某些波长的光后产生振动能级跃迁，吸收光子的频率与跃迁前后的能量差相关，吸收的强度取决于化学键振动的非谐性。分子的基频振动产生的吸收谱带位于波长2500-25000nm 的中红外区域，发生780-1100nm 的短波近红外区1100-2500nm 的长波近红外区的吸收谱带对应着基频振动的倍频和组合频。含氢基团（X-H）的振动跃迁非谐性常数最高，其在有机物的近红外吸收光谱中占主导地位。优点：绝大多数的有机物都有吸收响应，所以测量时几乎无需进行样品前处理缺点：吸收系数小，其检测限通常不到 0.1%，不利于对蛋白质的衡量分析质谱法原理：质谱分析法是将化合物形成母离子和碎片离子, 根据离子的质荷比(m/z)进行分离, 从而对化合物的成分和结构进行分析的方法质谱分析的一般过程是: 样品由合适的进样装置引入并进行气化, 气化后的样品进入离子源后被电离, 电离后的离子经过适当加速后进入质量分析器, 根据不同的 m/z 进行分离, 到达检测器, 产生不同的信号, 利用专业的生物软件进行后续分析。优点：准确性高，灵敏度高，与传统的生物学技术手段相比, 基于质谱的蛋白质组学技术更适合于临床疾病的研究缺点：技术发展不够完善毛细管凝胶电泳法原理：电泳也称作电迁移，是指溶液中带电粒子在电场中所发生的迁移运动，运动的迁移率与组分分子的大小、极性、亲和能力、等电点、相分配系数以及所带电荷的多少等多个因素有关。毛细管电泳又称为毛细管电分离，是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力、根据带电粒子迁移率的不同来实现组分分离的一种液相分离技术。 在毛细管内充满凝胶介质的电泳称为毛细管凝胶电泳。电泳过程中，不同分子在电场作用下发生电泳迁移时受到网状凝胶的阻碍作用不同，使其迁移速度不同，最终被分离。优点：分离度极高，分离速度较快、样品消耗量少（进样量为 nL 级）缺点：分离检测成本高，大分子容易积留、清洗困难，重现性差荧光法荧光探针具有灵敏度高，选择性好，体积小，受生物体内活性小分子及金属离子干扰小等优点基于小分子荧光探针检测蛋白质 小分子与蛋白质相互作用后可引起小分子荧光光谱和蛋白质自身荧光内源荧光光谱以及同步荧光光谱的变化,如荧光强度和偏振度的改变、新荧光峰的出现等,这些均可以提供小分子与蛋白质结合的信息。小分子与蛋白质作用引起体系荧光性质改变有两种情况：小分子无荧光,在蛋白质溶液中加入小分子后,蛋白质的内源荧光淬灭小分子有荧光,蛋白质与小分子作用后,内源荧光被淬灭,而小分子的荧光被敏化增强基于蛋白质疏水作用： 在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水性残基包埋在分子内部而形成疏水空腔。疏水作用及亲水和疏水平衡在蛋白质结构与功能方面起着关键作用。 利用极性敏感有机小分子荧光探针与蛋白质结合前后基于其疏水空腔提供了一个非极性环境从而导致探针荧光性质的改变基于蛋白质与有机染料结合作用 蛋白质与荧光染料结合后,能使溶液荧光强度增强或淬灭,并且其变化量与蛋白质浓度成正比。有机染料包括：血管黄素，曙红Y，铬天青S，溴酚蓝，四羧基苯基卟啉，Evans blue，偶氮染料，方酸菁染料，酞菁染料等 曙红Y 铬天青S溴酚蓝四羧基苯基卟啉Evans blue偶氮染料 方酸菁染料酞菁染料基于AIE机理检测蛋白质此外，小分子荧光探针还可基于荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET),光诱导电子转移 (photo-induced electron transfer PET）, 分子内电荷转移( Intramolecular charge transfer , ICT)等效应对蛋白质进行选择性识别基于自组装机理检测蛋白质 超分子化学：分子聚集体结构和功能为研究对象, 旨在研究分子基于弱相互作用的组装、自组装和自组织行为,并研究这些行为可能带来的结构和功能的改变,以期建立结构和功能之间的关系。超分子的组装的实现依赖于分子间键. 它包括氢键、范德华力、亲脂-疏水作用、金属离子的配位键、-堆积作用等Palapuravan Anees, et al. J. Am. Chem. Soc. 2014, 136,1323313239比色/比率型荧光探针检测蛋白质 利用催化消除氨基甲酸酯保护基团合成了反应型探针，BSA的存在使得氨基萘二甲酰亚胺的绿色荧光增强，根据溶液颜色变化和荧光强度比值识别并定量检测。X. Zhang. et al. Analyst, 2011,136(19):4008-4012.基于荧光有机纳米材料检测蛋白质 纳米材料，是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围（100 nm）或由该尺度范围的物质作为基本单元构成的材料。纳米材料的特殊结构，使其具有不同于常规材料和单个分子的一些特性，主要包括比表面积大、高化学活性、特殊的光、电、磁性质等。而荧光纳米材料，由于其特殊的结构与光学特性，为化学、物理、医学和生物领域的发展带来了新的机遇。半导体量子点 量子点是主要由-族及-族元素构成的半导体纳米颗粒。量子点在研究蛋白质方面具有许多优势。首先，可以用同一激发波长的光源同时激发多种不同荧光的量子点，并且由于其发射谱带窄而对称，多种颜色的发射峰不易出现重叠与红移拖尾，荧光光谱易于区分和识别。另外，量子点的斯托克斯位移较大，可以有效避免激发峰与发射峰的重叠，减少干扰。此外，量子点的光学特征可以通过控制反应条件有效控制 量子点荧光可调的光学特征为蛋白质多色标记及同步检测奠定了基础。嵌入式核壳荧光纳米颗粒嵌入式核壳荧光纳米颗粒是指一些负载有机荧光染料分子的无机纳米颗粒或多聚生物大分子包被型纳米颗粒。这种材料在蛋白质标记成像中有固有优点。 首先，纳米颗粒对内部所包裹的荧光染料有保护作用，使其荧光稳定性增强，可以克服外界环境对荧光材料的影响。 其次，一个纳米颗粒内所包裹的荧光分子往往多达几千甚至几万个，因此，更多的荧光分子可以连接在生物分子上，当产生信号响应时，很多荧光分子同时产生荧光信号，起到了信号放大的作用，从而提高检测灵敏度碳点碳点是一种近似球型且直径小于10 nm的零维半导体纳米晶体，是由极少分子或是原子组成的纳米团簇。荧光性能是碳点最突出的性能，碳点具有荧光稳定性高、荧光波长可调、抗光漂白能力强、激发光宽且连续、能够实现一元激发、多元发射等特点。制备碳点的碳源来源丰富且价廉、毒性低。利用碳点表面的NH2和OH，在碳点表面接上对生物分子有特异性识别作用的核酸适体或分子印迹聚合物，可提高分析的灵敏度和选择性。在蛋白质研究中，碳点通过与蛋白质的作用，改变了表面电子空穴对之间的复合效率，从而发生荧光的增强或猝灭，实现对蛋白质的标记和分析。贵金属元素纳米簇贵金属元素纳米簇的尺寸通常小于2 nm，具有强的可见-近红外荧光。同其他荧光纳米材料相比，贵金属元素纳米簇更加稳定，分散性更好。近几年来，贵金属纳米簇分子桥的研究是一大热点。由于金属纳米簇的低毒性，近红外光谱特征，超小尺寸及优良的荧光性质，它们已广泛用于蛋白质检测、标记成像及蛋白质间相互作用的研究领域。磁性荧光纳米颗粒磁性荧光纳米颗粒是一种结合了磁性和发光性能的纳米材料。磁性荧光纳米材料集合了磁性纳米颗粒的快速磁响应性以及荧光材料的光致发光能力，在分离的同时还能进行光学检测。蛋白质与疾病的关系妊娠期高血压疾病 妊娠期特有的疾病，发生率为 9. 4% 10. 4% ，可导致脑出血、脑水肿、心力衰竭、肺水肿、新生儿死亡等不良妊娠结局，尤其是早发型重度子痫前期，是导致产妇及新生儿死亡的主要原因之一，严重危害母婴健康。该疾病以“妊娠20周后高血压、蛋白尿、水肿”为主要表现。（正常人每日自尿中排出约40-80mg蛋白，上限不超过150mg，其中主要为白蛋白，其次为糖蛋白和糖肽。）通过检测尿蛋白含量，可以有效预防妊娠期高血压疾病的发生。慢性肾脏病及糖尿病 慢性肾脏病(CKD)的进展是一个不可逆转的过程,其发展是以肾功能进行性下降,细胞外基质(ECM)在细胞外大量聚集而致的广泛肾纤维化为特征,最终出现终末期肾功能衰竭。 非选择性蛋白尿是大多数肾脏病共有的表现之一,其中存在的大量毒性/炎性物质。大量蛋白尿,特别是大量非选择性蛋白尿出现时,能够通过一系列不同的机制表现出肾脏毒性加速肾脏病的进展。 蛋白尿不仅仅是肾脏病进行性发展过程中的表现,又是其重要危险因素之一。冠心病 指由于脂质代谢不正常，血液中的脂质沉着在原本光滑的动脉内膜上，在动脉内膜一些类似粥样的脂类物质堆积而成白色斑块，称为动脉粥样硬化病变。这些斑块渐渐增多造成动脉腔狭窄，使血流受阻，导致心脏缺血，产生心绞痛。高密度脂蛋白(HDL) 富含大量结构、功能、代谢特点异质性的蛋白质成分，约占 55%，是蛋白质含量最高的脂蛋白 HDL 蛋白质成分包括载脂蛋白酶，脂质转移蛋白、急性期反应蛋白、补体成分、蛋白酶抑制剂等。 HDL 的异常表达与冠心病的发生密切相关。神经退行性疾病（AD） 又称早老性痴呆, 是最常见的神经退行性疾病, 以老年斑(senile plaque, SP)和神经纤维缠(neurofibrillary tangles, NFT) 为两大病理特征. AD 在老年人群中发病率极高, 具有致死性且通常伴有并发症, 是危害人类健康的重要杀手, 但目前尚无有效的治疗措施. 利用蛋白质组学技术研究 AD的发病机制, 寻找潜在的生物标志物和药物治疗的靶标, 对于 AD 的诊断和治疗具有重要价值. -淀粉样蛋白(amyloid-, A)是由淀粉样前体蛋白APP 经过分泌酶剪切加工而成，是老年斑的主要成分, 研究表明 A 肽段产生的神经毒性可以加剧 tau蛋白磷酸化和 NFT 的形成。癌症 G 蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs）是一类重要的细胞膜表面跨膜蛋白受体超家族，具有 7 个跨膜螺旋结构。GPCRs 能够将激素、神经递质、趋化因子等各种细胞外信号转导入胞内，从而在细胞功能的调节中起重要作用，包括恶性肿瘤的发生和转移 900 余种 G 蛋白中，1986 年首次发现癌症基因 MAS，可编码为 GPCR 功能性内源性配体 ANG1-7，由此得出 GPCR可能和肿瘤发生相关。随着研究的深入，发现 GPCR 过表达现象普遍存在于非小细胞性肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和黑色素瘤等多类癌症中。 此外，血浆纤维蛋白原高表达也是癌症有利证据Thank you!