基因工程药物 -干扰素的制备 1b1 什么是干扰素u概念(interferon,IFN)：机体免疫细胞产生的一类细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。u根据分子结构和抗原性的差异分为、等4个类型。2b1.1天然干扰素的分类天然干扰素的分类 1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素：IFN、IFN、IFN 、IFN 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 、免疫调节(较弱） 其中IFN-为多基因产物，有23种以上的亚型。 II 型干扰素：干扰素（IFN) 来源：活化的T细胞和NK细胞产生 功能：免疫调节 3b 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要） 2.2. 根据动物来源确定分类 人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。4bv不同来源的干扰素5b1.2 重组干扰素的临床应用重组干扰素的临床应用v广谱抗病毒活性（rhuIFN） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。v直接抗肿瘤活性（rhuIFN） 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。v免疫调节活性治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFN）v多发性硬化症 rhuIFN6b2 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺基因工程大肠杆菌发酵生产工艺7b干扰素生产工艺路线干扰素生产工艺路线上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFN-2a， rhuIFN-2b； 1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b； 20012002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。基因工程大肠杆菌发酵生产工艺基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:8bv目的基因的分离目的基因的分离克隆载体克隆载体目的基因与克隆目的基因与克隆载体的体外重组载体的体外重组重组体导入大肠杆菌重组体导入大肠杆菌K12K12受体菌的培养及筛选受体菌的培养及筛选从受体菌中获取目的基因从受体菌中获取目的基因表达载体表达载体重组质粒重组质粒导入大肠杆菌导入大肠杆菌受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测工工程菌程菌 基因工程菌的制备9b一、目的基因的分离与扩增v1. 破碎细胞，用Trizol法提取总的RNAv2. 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶电泳切取目的基因片段v3. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNAv4. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干扰素基因的PCR产物v5.人工加尾形成“粘性末端”10b二、构建重组质粒v1. 提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因的PCR产物用相应的酶酶切，用连接酶连接E EcocoR IR IB BamamH IH IE EcocoR IR IB BamamH IH I 2.连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。 3.鉴定序列无误后，导入受体细胞，筛选11b三、重组体引入宿主细胞 将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。12b四、受体菌的筛选 由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况 13b五、分析保存 对基因工程大肠杆菌进行评价分析，并保存菌种。14b干扰素的发酵工艺过程启开种子启开种子 制备种子液制备种子液 发酵培养发酵培养 粗提粗提 精提精提 半成品制备半成品制备 半成品检定半成品检定 分装分装 冻干冻干 成品检定成品检定 成品包装成品包装15bv1 1菌种培养菌种培养 取70下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30，pH7.0，250 r/min活化培养182小时后，进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。v2 2种子罐培养种子罐培养 将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%，培养温度30，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养34小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂菌 16bv3.3.发酵罐培养发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20，pH6.0，溶解氧60%，继续培养56.5小时。同时进行发酵液杂菌检查，当OD值达9.01.0后，用5冷却水快速降温至15以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10以下。v4. 4. 菌体收集菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000 r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于20冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个月，检查一次活性。17b3. 干扰素的分离纯化工艺过程干扰素的分离纯化工艺过程 3.1、干扰素分离工艺过程 3.2、干扰素的纯化工艺过程18b3.1 干扰素分离工艺过程v菌体裂解v预处理v初级分离19b(1)菌体裂解菌体裂解v裂解缓冲液：纯化水配制，210（pH7.5）v使用保护剂：EDTA，PMSF。v破碎菌体：2厘米以下的碎块v搅拌：加裂解缓冲液，210，2hrv冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。20b(2)预处理预处理-沉淀沉淀v加絮凝剂聚乙烯亚胺: 210，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。v加凝聚剂醋酸钙溶液: 210,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。21b(3)离心离心v连续流离心机：210，16000 r/minv收集上清液：含有重组干扰素蛋白质v杂质沉淀：121、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。22b（4）初级分离）初级分离v盐析: 硫酸铵，210，搅匀,静置过夜。v离心：连续流离心机，16000 r/minv保存：收集沉淀，粗干扰素，4保存。23b3. 2、干扰素纯化工艺过程v溶解粗干扰素v沉淀与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析v无菌过滤分装24b(1) 溶解粗干扰素溶解粗干扰素v配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 m滤器和10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至210。v检查: 缓冲液的pH值和电导值。v溶解：210，匀浆，完全溶解。25b(2) 沉淀与疏水层析沉淀与疏水层析v等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。v疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中 除非疏水性蛋白 洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）26bv等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 ms/cm，210，静置过夜v超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。v透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku超滤膜，0.005 M缓冲液。27b(3)无菌过滤分装无菌过滤分装0.22 m滤膜过滤干扰素溶液v分装v20以下的冰箱中保存。28b(4)检测项目检测项目v干扰素鉴别试验v干扰素效价测定v蛋白质含量，纯度测定，分子量v宿主残余蛋白、残余DNAv干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列v其他：热原，内毒素，残留抗生素29b半成品检定v（1）效价测定效价测定 用细胞病变抑制法，以Wish细胞、VSV病毒为基本检测系统，测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。v（2）蛋白质含量测定蛋白质含量测定v 福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋白为标准。v（3）比活性比活性v 效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。v（4）纯度纯度v 电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，银染显色应为单一区带，经扫描仪测定纯度应在95%以上。30bv（5 5）相对分子量测定）相对分子量测定v 还原型SDS-PAGE，加样量不地域微克，同时用已知相对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比较，误差不得高于10%。v（6 6）残余外源性）残余外源性DNADNA含量测定含量测定v 用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。v（7 7）残余血清）残余血清IgGIgG含量测定含量测定v 在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项检定。v（8 8）残余抗生素活性测定）残余抗生素活性测定v 半成品中不应有抗生素活性存在。31bv（9）紫外光谱扫描紫外光谱扫描v 检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在2802纳米。v（10）肽图测定肽图测定v 用CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批与批之间应一致。v（11）等电点测定等电点测定 等电聚焦电泳。v（12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质试验。试验。32b成品检定v（1）物理性状物理性状v 冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后不得含有肉眼可见不溶物。v（2）鉴别试验鉴别试验v 应用ELISA或中和试验检定。v（3）水分测定水分测定v 用卡氏法，应低于3%。v（4）无菌试验无菌试验v 同半成品。33bv（5）热原质试验热原质试验v 同半成品检定。v v（6）干扰素效价测定干扰素效价测定v 同半成品检定，效价不应低于标示量。v（7）安全试验安全试验v 取体重为350-400克豚鼠3只，每只腹侧皮下注射量为成人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明成品合格。 取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存活，说明成品合格。34b4 国内基因工程药物产业发展状况 我国的生物技术药物却一直苦于缺乏自主创新的产品，绝大多数上市药物为仿制药，创新药物的开发一直未能打开局面。 一种新药从研发到投放市场，投入大约为30亿60亿美元。35b存在的问题：（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞争， 严重影响产业的健康发展。（2）融资渠道单一、产业发展资金不足。（3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。（4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮乏。36b37b