1898年后年后已正式命名的植物病毒已正式命名的植物病毒789种种(81属属)仅次于真菌病害仅次于真菌病害种类多、为害大、难防治种类多、为害大、难防治农作物水稻、油菜、小麦、大麦黄矮病、玉米病毒病、番茄农作物水稻、油菜、小麦、大麦黄矮病、玉米病毒病、番茄病毒病、葫芦科植物病毒病、病毒病、葫芦科植物病毒病、马铃薯退化病、白菜孤丁病、马铃薯退化病、白菜孤丁病、烟草花叶病、可可肿枝病等等烟草花叶病、可可肿枝病等等水稻条纹叶枯病、黑条矮缩病水稻条纹叶枯病、黑条矮缩病北方麦类黄矮病、簇矮病一般减产北方麦类黄矮病、簇矮病一般减产2030%，严重达，严重达60%第第1414章章 植植 物物 病病 毒毒2005年，第年，第8次次ICTV报告共收录报告共收录1569个植物病毒，归于个植物病毒，归于18个科、个科、81个属个属,以及亚病毒感染因子的类病毒和病毒卫星。以及亚病毒感染因子的类病毒和病毒卫星。其中确定种其中确定种763个个(含科内未归属种含科内未归属种23个，暂定种个，暂定种279个，科内个，科内未归属病毒未归属病毒64个，未分类的病毒个，未分类的病毒64个）。个）。另外有另外有28个类病毒个类病毒归归2个科、个科、7个属，科内未归属类病毒个属，科内未归属类病毒6个，个，还有还有4个植物卫星病毒个植物卫星病毒确定成员、确定成员、1个暂定成员，个暂定成员，17个单链卫星个单链卫星DNA和和25个单链卫星个单链卫星RNA确定成员、确定成员、4个暂定成员。个暂定成员。叶蝉叶蝉水稻水稻普通矮缩病普通矮缩病 Ricedwarf 小麦黄矮病小麦黄矮病Wheatyellowdwarf水稻黄萎病水稻黄萎病 玉米黑条矮缩病玉米黑条矮缩病灰稻虱灰稻虱番茄病毒病（卷叶）番茄病毒病（卷叶）豇豆病毒病豇豆病毒病西瓜病毒病西瓜病毒病马铃薯病毒病马铃薯病毒病白菜病毒病白菜病毒病植植 物物 病病 毒毒 经济作用：经济作用：绿菊花、郁金香、日本卫矛绿菊花、郁金香、日本卫矛 增增产产菊芋潜病毒菊芋潜病毒莴苣巨脉病毒莴苣巨脉病毒樱属环斑病毒樱属环斑病毒植植物物病病毒毒植物病毒的特殊性：植物病毒的特殊性：亚显微性亚显微性病毒粒子微小病毒粒子微小隐蔽性隐蔽性一般无肉眼可见的病症一般无肉眼可见的病症潜伏性潜伏性有隐症现象有隐症现象微量性微量性病株体内病毒浓度低，病株体内病毒浓度低，且分布不均且分布不均第八章第八章 植植 物物 病病 毒毒一、一、植物病毒病的症状植物病毒病的症状二、二、植物病毒的生态学植物病毒的生态学三、三、植物病毒的传播植物病毒的传播四、四、植物抗病毒防卫反应的原理植物抗病毒防卫反应的原理五、五、植物病毒病的防治植物病毒病的防治六、六、植物抗病毒基因工程植物抗病毒基因工程 七、七、植物病毒的检测植物病毒的检测八、植物病毒的纯化、提纯与八、植物病毒的纯化、提纯与保藏保藏本章要点本章要点u植物病毒病的症状及其特点植物病毒病的症状及其特点u植物病毒传播植物病毒传播u病害防治原理与方法病害防治原理与方法一、植物病毒病的症状一、植物病毒病的症状症状有诊断价值，区别生理性病害、遗传病害、症状有诊断价值，区别生理性病害、遗传病害、病毒病害病毒病害病毒性病害病毒性病害（1）田间发病一般）田间发病一般分散分散，少数土传的可小片发生，少数土传的可小片发生，但极少普遍发生但极少普遍发生与昆虫介体、接触传播有关与昆虫介体、接触传播有关（2）可）可传染性传染性，借助介体或其它传染方式传播，借助介体或其它传染方式传播植物病毒病研究中，一般进行生物学测定、传染植物病毒病研究中，一般进行生物学测定、传染试验，再做电镜观察试验，再做电镜观察一、植物病毒病的症状一、植物病毒病的症状1、宏观症状、宏观症状macroscopicsymptomu生长减缩生长减缩(Reductionofgrowth)u变变色色discoloration：叶、花、茎、果实及种子叶、花、茎、果实及种子u坏死坏死necrosisu畸形生长畸形生长malformationu失水失水2、微观症状、微观症状microscopicsymptom类型：症状类型：症状symptom与病象与病象syndrome(多种症状的总称）多种症状的总称）一、植物病毒病的症状一、植物病毒病的症状1、宏观症状、宏观症状macroscopicsymptom(1)生长减缩生长减缩(Reductionofgrowth)：矮缩：矮缩dwarfing、矮化、矮化stunting、小实、小实smallfruit、小叶、小叶littleleaf、缩根、缩根rootreduction大蒜病毒病大蒜病毒病矮化矮化Stunting矮缩矮缩Dwarfing一、植物病毒病的症状一、植物病毒病的症状1、宏观症状、宏观症状macroscopicsymptom(2)变变色色discoloration叶变色叶变色褪绿褪绿chlorosis、白化、白化blanching、紫紫/红红/黄化黄化purpling/reddening/yellowing、褐褐/黑黑/古铜化古铜化browning/blackening/bronzing脉明症脉明症vein-clearing、杂色、杂色variegation、花叶花叶mosaic、斑驳斑驳mottling、斑点、斑点spoting/doting、线纹、线纹linepattern、环纹环纹ringstripe、条纹、条纹stripe、环斑、环斑ringspot、条斑、条斑streak沿脉变色沿脉变色vein-blanding、脉间花叶、脉间花叶interveinalmosaic叶绿素、胡萝卜素、花青素（叶绿素、胡萝卜素、花青素（红红到到紫紫）TobamovirusMosaicsymptomsontobaccocausedbyTMV斑驳斑驳MottleTMV transmission by an Apis sp. A severe mosaic symptom on tomato leaf (TMV)腿色斑腿色斑Chloroticspoting黄化黄化Yellowing斑驳斑驳Mottle脉明症脉明症Vein-clearing条斑条斑Leafstreak腿色斑驳腿色斑驳Chloroticmottleviroidyellowdwarf变色变色变色变色seedcoatmottling郁郁金金香香碎碎锦锦花花叶叶病病花变色花变色碎色症碎色症colorbreaking、花瓣变绿、花瓣变绿virescence杂色花郁金香、香石竹、紫罗杂色花郁金香、香石竹、紫罗兰兰、虞美人、唐菖蒲、虞美人、唐菖蒲(3)(3)坏死坏死necrosis枯斑枯斑necroticspot、线条坏死、线条坏死streaknecrosis、死顶、死顶topnecrosis、蚀纹、蚀纹etch(不规则的线纹不规则的线纹)一、植物病毒病的症状一、植物病毒病的症状辣椒辣椒病毒病病毒病马铃薯病毒病马铃薯病毒病necrosissymptomsontomatocausedbyTMVLocallesionsintobaccooneweekafterinoculationwithTMV 一、植物病毒病的症状一、植物病毒病的症状(4)(4)畸形生长畸形生长畸形生长畸形生长malformationmalformation：耳突耳突enation溃疡性肿瘤溃疡性肿瘤cankerous肿枝肿枝shootswelling扁枝症扁枝症branchflattening蕨叶症蕨叶症fernleaf线叶症线叶症leafnarrowing皱缩皱缩crinkling曲叶曲叶leafcurl花束症花束症boguet束顶症束顶症bunchytop叶片偏上性叶片偏上性epinasty卷叶卷叶leafrolling丛枝症丛枝症witchsbroom拐节症拐节症zigzaggrowth花器变态花器变态antholysis绿花绿花virescence变叶变叶phyllody缩节缩节apostasis不孕性不孕性sterility卷叶卷叶Leafrolling芹菜芹菜耳突耳突Enation畸形畸形畸形畸形脉明症脉明症vein-clearing茎瘤茎瘤畸形畸形畸形畸形Healthy(left)andnaturallymop-topaffected(right)plantsofpotato蕨叶症蕨叶症fernleaf西葫芦疱斑畸形西葫芦疱斑畸形西葫芦疱斑畸形西葫芦疱斑畸形畸形畸形畸形畸形丛枝症丛枝症拐节症拐节症witchsbroomzigzaggrowth畸形畸形畸形畸形Peach leafdistortion畸形畸形畸形畸形萎蔫萎蔫wilting(5)失水：失水：萎蔫萎蔫wilting过量蒸腾过量蒸腾overtranspiration病毒本身阻塞导管、胶质、病毒本身阻塞导管、胶质、形成侵填体堵塞导管形成侵填体堵塞导管一、植物病毒病的症状一、植物病毒病的症状2、微观症状、微观症状microscopicsymptom组织病变：组织病变：callose、侵填体、侵填体tylose、流胶、流胶gummosis正常组织增生正常组织增生hyperplasia增大增大hypertrophy可染色检查可染色检查抑制木质素形成抑制木质素形成(inhibitionofligninformation)内含体内含体inclusion:柱状、风轮状柱状、风轮状pinwheel、卷筒状卷筒状scroll、晶状等、晶状等局部症状局部症状localsymptom系统症状系统症状systemicsymptom外表症状的隐潜外表症状的隐潜masking ：无症侵染无症侵染symptomlessinfection高温隐潜高温隐潜hightemperaturemasking获得免疫获得免疫acquiredimmunityhypersensitiveresponseHR砧木的作用砧木的作用Stockeffect一、植物病毒病的症状一、植物病毒病的症状二、植物病毒的生态学二、植物病毒的生态学Viruspathoecosystem二、植物病毒的生态学二、植物病毒的生态学(一一)、生物因素、生物因素1、病毒及其寄主植物、病毒及其寄主植物栽培植物的种及品种改变 野生植物及杂草是病毒的贮源2、传播介体与病毒的扩展、传播介体与病毒的扩展3、人和动物的传播、人和动物的传播4、栽培措施与病毒病的关系、栽培措施与病毒病的关系u生态系统中，各种因素相互制约，维系着生态系统中，各种因素相互制约，维系着平衡状态，不要随意打破。平衡状态，不要随意打破。澳大利亚包心莴苣坏死黄化病毒，其毒澳大利亚包心莴苣坏死黄化病毒，其毒源植物是野生的苦苣菜源植物是野生的苦苣菜(sonchus)野兔多，引进粘液瘤病毒控制野兔野兔多，引进粘液瘤病毒控制野兔苦苣菜过多苦苣菜过多包心莴苣坏死黄化病毒包心莴苣坏死黄化病毒毒源多毒源多莴苣病毒病大发生莴苣病毒病大发生二、植物病毒的生态学二、植物病毒的生态学(二二)、环境因素、环境因素土壤状况土壤状况：N、P、K含量与比例、土壤温含量与比例、土壤温度、湿度、土壤类型度、湿度、土壤类型气象因素气象因素：降雨、气温、风等影响气传和：降雨、气温、风等影响气传和土传病毒介体的繁殖、传播速度等土传病毒介体的繁殖、传播速度等二、植物病毒的二、植物病毒的生态学生态学三、植物病毒的传播三、植物病毒的传播transmission(betweenplants)三、植物病毒的传播三、植物病毒的传播三、植物病毒的传播三、植物病毒的传播非介体传播：非介体传播：植物病毒从寄主体上，由于伤植物病毒从寄主体上，由于伤残或分泌而达到体外，与另一寄主体通过微残或分泌而达到体外，与另一寄主体通过微伤口接触而传染，或通过寄主细胞间的有机伤口接触而传染，或通过寄主细胞间的有机结合而传染。结合而传染。介体传播：介体传播：病毒依附在其它生物体上，借其病毒依附在其它生物体上，借其它生物体的活动而进行传播、感染。它生物体的活动而进行传播、感染。（一）、（一）、非介体传播非介体传播1、机械或汁液擦伤传染、机械或汁液擦伤传染2、种子传染、种子传染(1/10)3、无性繁殖材料、无性繁殖材料4、土壤传播、土壤传播5、菟丝子、菟丝子(Cuscuta)传染传染6、嫁接传染、嫁接传染（一）、非介体传播（一）、非介体传播2、种子传染、种子传染(1/10)病毒在种子中病毒在种子中的分布：的分布：（1）病毒不能进入胚，在胚外，种子污染；）病毒不能进入胚，在胚外，种子污染；（2）病毒可进入胚，但进入后是否被寄主）病毒可进入胚，但进入后是否被寄主消消灭决定是否种传灭决定是否种传病毒能否进入胚受病毒基因控制病毒能否进入胚受病毒基因控制病毒种传机理：病毒种传机理：（1）由带毒母体直接侵入种胚）由带毒母体直接侵入种胚（2）间接从生长点、茎尖侵入胚）间接从生长点、茎尖侵入胚（3）通过异花授粉使带毒花粉从外部经柱头）通过异花授粉使带毒花粉从外部经柱头侵入健株的胚侵入健株的胚在胚外在胚外outsidetheembryo,传播率低：传播率低：种子成熟经过脱水、收获、贮藏；有些接触不到幼苗；种子成熟经过脱水、收获、贮藏；有些接触不到幼苗；有些存在于胚乳内。有些存在于胚乳内。在胚内在胚内withintheembryo：真正意义上的种传：真正意义上的种传（一）、非介体传播（一）、非介体传播2、种子传染、种子传染seed-transmission病毒种传的重要性病毒种传的重要性（1）早期提供）早期提供毒源毒源，引起病毒病流行，引起病毒病流行种子带毒后，直接使幼苗发病，种子带毒后，直接使幼苗发病，为大田侵染提供了初侵染源为大田侵染提供了初侵染源（2）远程传播远程传播通过种子进出口、种子通过种子进出口、种子调拨使病区扩大调拨使病区扩大花粉能传毒，种子一定能传毒花粉能传毒，种子一定能传毒（一）、非介体传播（一）、非介体传播3、土壤传播、土壤传播soil-transmission病毒进入土壤的途径：病毒进入土壤的途径：（1）病残体带入）病残体带入（2）病株根部渗入土壤）病株根部渗入土壤土传病毒病害的特点：土传病毒病害的特点：（1）病害开始往往局限于小块发病中心）病害开始往往局限于小块发病中心（2）传播速度慢）传播速度慢（3）土壤传染性可长期保持）土壤传染性可长期保持（4）干燥丧失传染性）干燥丧失传染性-线虫传，否则真菌传线虫传，否则真菌传（一）、（一）、非介体传播非介体传播4、菟丝子传染、菟丝子传染Cuscuta可将复合感染的病毒分开可将复合感染的病毒分开5、嫁接传染、嫁接传染顶接、侧接、靠接、套接顶接、侧接、靠接、套接受接穗和砧木亲和力影响受接穗和砧木亲和力影响会将病株中其它病毒也同时传播会将病株中其它病毒也同时传播(二二)介体介体vectors传播传播1、虫毒为害和真正的病毒病害的区别：、虫毒为害和真正的病毒病害的区别：虫虫毒毒病毒病害病毒病害01、昆虫分泌的对植物有毒物质、昆虫分泌的对植物有毒物质病毒所致病毒所致2、毒素在植物体内不能增殖毒素在植物体内不能增殖病毒可在植物体内增殖病毒可在植物体内增殖3、中毒植物在一定情况下可恢复、中毒植物在一定情况下可恢复极少能恢复极少能恢复4、受害程度与昆虫饲食时间虫数受害程度与昆虫饲食时间虫数不成正比不成正比5、产毒能力有遗传性、产毒能力有遗传性只有少数能通过卵传只有少数能通过卵传6、无性繁殖材料或嫁接不传无性繁殖材料或嫁接不传可嫁接、无性繁殖材料传可嫁接、无性繁殖材料传7、防治与控制昆虫效果成正比、防治与控制昆虫效果成正比常不成比例常不成比例主要介体有：主要介体有：昆虫、真菌、螨类、线虫类昆虫、真菌、螨类、线虫类昆虫介体有：昆虫介体有：蚜虫、叶蝉、飞虱、甲虫、蓟马、粉蚧、蝽象等蚜虫、叶蝉、飞虱、甲虫、蓟马、粉蚧、蝽象等昆虫的传毒过程分为：昆虫的传毒过程分为：获毒、潜育、传毒获毒、潜育、传毒三个时期三个时期获毒饲育期（获毒饲育期（acquisitionfeedingperiod）指无毒昆虫开始取食指无毒昆虫开始取食至已获得传毒能力所需的时间至已获得传毒能力所需的时间接毒饲育期（接毒饲育期（inoculationfeedingperiod）指带毒昆虫在健康指带毒昆虫在健康植株上引起发病的取食时间。植株上引起发病的取食时间。潜育期（潜育期（latentfeedingperiod）指昆虫从获得病毒起到能传播指昆虫从获得病毒起到能传播给植物所需的时间。给植物所需的时间。(二二)介体介体vectors传播传播按昆虫获毒后能保持传毒的时间可分为按昆虫获毒后能保持传毒的时间可分为：非持久性传播非持久性传播(nonpersistent)：口针传播，病口针传播，病毒在体内短期存在，几秒毒在体内短期存在，几秒几分钟即可获毒几分钟即可获毒并立即传毒，也易丧失传毒能力并立即传毒，也易丧失传毒能力持久性传播持久性传播(persistent):昆虫保持相对较长的昆虫保持相对较长的传毒时间，数周传毒时间，数周数月，其病毒可分为：数月，其病毒可分为：循回病毒循回病毒circulativevirus增殖病毒增殖病毒propagativevirus半持久性传播（半持久性传播（semipersistent）蚜虫传播（蚜虫传播（aphidtransmission)在测定过的传病毒的在测定过的传病毒的242种昆虫介体中，已种昆虫介体中，已证明的介体有证明的介体有192种，其中蚜虫占种，其中蚜虫占173种。种。自然条件下多。可传自然条件下多。可传CMV的有的有75种，桃蚜种，桃蚜能传能传100多种病毒多种病毒为害农作物，难防治。蚜虫传有：为害农作物，难防治。蚜虫传有：非持久性非持久性花叶、斑驳症状花叶、斑驳症状口针被动的机械污染口针被动的机械污染主动吸食和回吐病毒主动吸食和回吐病毒半持久性半持久性持久性持久性病毒多在韧皮部增殖，不能经汁病毒多在韧皮部增殖，不能经汁液摩擦接种液摩擦接种aphidtransmissionApterous(wingless)lettuceaphidAnalate(winged)greenpeachaphidWhiteflyTrialeurodesabutilonea粉虱粉虱PresenceofbeanleafbeetlescanindicatevirusriskLeafhoppers2、线虫传播、线虫传播nematodetransmission长针线虫属长针线虫属Longidorus剑针线虫属剑针线虫属Xiphenema毛刺针线虫属毛刺针线虫属Trichodorus拟毛刺针线虫属拟毛刺针线虫属Paratrichodorus有十多种病毒可线虫传，有十多种病毒可线虫传，有：有：番茄环斑病毒、雀麦花叶病毒、葡萄扇叶番茄环斑病毒、雀麦花叶病毒、葡萄扇叶病毒、烟草环斑病毒、烟草脆裂病毒等病毒、烟草环斑病毒、烟草脆裂病毒等一般都可经种子传一般都可经种子传线虫与病毒的特殊关系由线虫食道线虫与病毒的特殊关系由线虫食道表皮膜蛋白表皮膜蛋白与与病毒的病毒的外壳蛋白外壳蛋白之间的亲和性决定之间的亲和性决定3、真菌传播、真菌传播fungitransmission低等真菌：壶菌、根肿菌低等真菌：壶菌、根肿菌二种方式：二种方式：(1)病毒粒子附着在游动孢子周身，鞭毛病毒粒子附着在游动孢子周身，鞭毛(2)病毒在休眠孢子中与休眠孢子共存病毒在休眠孢子中与休眠孢子共存但都无证据表明病毒在菌体内增殖但都无证据表明病毒在菌体内增殖禾谷多粘菌禾谷多粘菌Polymyxa graminisLightmicrographshowingrestingsporesofOlpidium brassicae三、植物病毒的传播三、植物病毒的传播transmissionVirustransportMovementinplant四、植物抗病毒防卫反应的原理四、植物抗病毒防卫反应的原理（一）、防卫过程（一）、防卫过程植物对病原微生物的抗性反应大致分为：植物对病原微生物的抗性反应大致分为：组成型抗性组成型抗性组成型抗性组成型抗性 如表皮角质层、气孔大小等如表皮角质层、气孔大小等诱发型抗性诱发型抗性诱发型抗性诱发型抗性根据寄主和病毒的相互作用，可将防卫反根据寄主和病毒的相互作用，可将防卫反应分为三个阶段：应分为三个阶段：侵染识别侵染识别防卫反应基因活化表达防卫反应基因活化表达枯斑产生枯斑产生hypersensitivereaction(HR)systematicacquiredresistance(SAR)广谱抗病性（可抗病毒、真菌、细菌等）广谱抗病性（可抗病毒、真菌、细菌等）Inducinginoculation诱发接种诱发接种challengeinoculation挑战接种挑战接种四、植物抗病毒防卫反应的原理四、植物抗病毒防卫反应的原理防卫反应类型防卫反应类型1、免疫、免疫immune非寄主抗病性（非寄主抗病性（non-hostresistance)利用利用远缘杂交远缘杂交2、侵染性、侵染性infectible局部坏死反应，同时诱发非专化寄主防局部坏死反应，同时诱发非专化寄主防卫反应、产生卫反应、产生PR蛋白，之后寄主表现局蛋白，之后寄主表现局部或系统获得抗病性部或系统获得抗病性在防卫反应中被诱导的在防卫反应中被诱导的与抗病有关的物质与抗病有关的物质1、PR蛋白蛋白2、植物次生代谢产物：、植物次生代谢产物：酚类、类黄酮、生物碱、抗生素类酚类、类黄酮、生物碱、抗生素类3、植保素、植保素(phytoalexin,PA)广谱性、非特异性，异黄酮类广谱性、非特异性，异黄酮类isoflavonoid4、多酚类化合物多酚类化合物5、其它寄主蛋白和酶活性变化、其它寄主蛋白和酶活性变化过氧化物酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶过氧化物酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶等等PR蛋白蛋白病程相关蛋白病程相关蛋白(pathogenesis-relatedproteins)1、低分子量（、低分子量（1245KD）2、抗蛋白酶水解、抗蛋白酶水解3、酸溶性、酸溶性4、局部分布、局部分布5、诱导产生、诱导产生大多数属于水解酶类，如大多数属于水解酶类，如chitinase,-1,3-glucanase等等返回酚类化合物在植物抗病中的作用酚类化合物在植物抗病中的作用1 1、多酚氧化酶多酚氧化酶多酚氧化酶多酚氧化酶和和和和过氧化物酶过氧化物酶过氧化物酶过氧化物酶等使多酚化合物等使多酚化合物等使多酚化合物等使多酚化合物氧化，氧化产物对菌丝生长有抑制作用氧化，氧化产物对菌丝生长有抑制作用氧化，氧化产物对菌丝生长有抑制作用氧化，氧化产物对菌丝生长有抑制作用2 2、病原菌分泌细胞壁多糖降解酶，酚类可抑、病原菌分泌细胞壁多糖降解酶，酚类可抑、病原菌分泌细胞壁多糖降解酶，酚类可抑、病原菌分泌细胞壁多糖降解酶，酚类可抑制该酶类制该酶类制该酶类制该酶类3 3、酚类是木质素的前体，酚类物质积累促进、酚类是木质素的前体，酚类物质积累促进、酚类是木质素的前体，酚类物质积累促进、酚类是木质素的前体，酚类物质积累促进木质素合成，使寄主细胞壁加固木质素合成，使寄主细胞壁加固木质素合成，使寄主细胞壁加固木质素合成，使寄主细胞壁加固返回返回返回返回植物防卫反应的激发植物防卫反应的激发两类植物基因在起作用：两类植物基因在起作用：植物抗病基因植物抗病基因决定预先形成的抗病能力或使病决定预先形成的抗病能力或使病毒失活的蛋白质、酶等多种因子毒失活的蛋白质、酶等多种因子植物防卫反应基因植物防卫反应基因植物抗病基因产物与病毒基植物抗病基因产物与病毒基因产物互作，诱导防卫基因表达因产物互作，诱导防卫基因表达植物抗病基因的克隆、抗病基因产物及其作植物抗病基因的克隆、抗病基因产物及其作用方式、植物防卫反应表达的调控等问题是用方式、植物防卫反应表达的调控等问题是当前植物抗病性分子生物学研究的热点当前植物抗病性分子生物学研究的热点植物防卫反应的激发植物防卫反应的激发病毒的外壳蛋白病毒的外壳蛋白(CP)被认为是诱导寄主被认为是诱导寄主HR反应的反应的激发激发子子(elicitor)植物病原细菌的毒性基因主要有植物病原细菌的毒性基因主要有hrp和和dsp基因基因hrp(hypersensitivereactionandpathogenicitygene)控制在非寄主植物上诱导过敏性反应和在寄主植物上控制在非寄主植物上诱导过敏性反应和在寄主植物上决定致病的基因，决定致病的基因，hrp基因编码的产物基因编码的产物harpin可诱导非可诱导非寄主植物产生寄主植物产生HR，也是一类激发子。，也是一类激发子。其它的激发子有：寡糖、多肽、水杨酸、茉莉酮酸等其它的激发子有：寡糖、多肽、水杨酸、茉莉酮酸等dsp(diseasespecificgene)只与致病性有关的基因只与致病性有关的基因五、植物病毒病的防治五、植物病毒病的防治病害三角：病害三角：1、消灭侵染来源和传染介体、消灭侵染来源和传染介体2、改进植物品种的抗病及耐病性、改进植物品种的抗病及耐病性3、对已得病的作物寻找理化治疗方法、对已得病的作物寻找理化治疗方法PathogenEnvironmentHost原原理理（一）、清除传染来源（一）、清除传染来源种子：种子：豆科、葫芦科、菊科等、留健种豆科、葫芦科、菊科等、留健种繁殖材料：繁殖材料：苗木、接穗、砧木、块根等苗木、接穗、砧木、块根等杂草、桥梁寄主杂草、桥梁寄主污染病毒的土壤、病残体污染病毒的土壤、病残体(如如TNV,TMV)（二）、防止病毒传播（二）、防止病毒传播 1 1、治虫：治虫：测报、大田诱杀、物理避虫、隔测报、大田诱杀、物理避虫、隔离栽培、调节播期、杀虫剂等离栽培、调节播期、杀虫剂等五、植物病毒病的防治五、植物病毒病的防治(二二)、防止病毒传播、防止病毒传播2、预防接触传播：预防接触传播：农事操作、工具等农事操作、工具等3、根靠接根靠接(果树果树)、花粉传播预防、花粉传播预防(三三)、选用脱毒种苗或无病毒种苗、选用脱毒种苗或无病毒种苗1、繁殖材料检验的、繁殖材料检验的索引法索引法（indexing)2、病毒在植株体内的分布和组织培养、病毒在植株体内的分布和组织培养(四四)、化学防治化学防治(五五)、交叉保护：、交叉保护：弱毒株、弱毒株、卫星卫星RNA等等(六六)、热处理、热处理(七七)、抗病品种抗病品种五、植物病毒病的防治五、植物病毒病的防治马马铃铃薯薯病病毒毒病病防防治治优点：优点：优点：优点：1、一旦相应病毒侵入，其卫星、一旦相应病毒侵入，其卫星RNA就被激活、放大，植物细就被激活、放大，植物细胞中只要有低浓度的胞中只要有低浓度的RNA转录就行；转录就行；2、卫星、卫星RNA给植物的抗性不会因为病毒接种量而克服；给植物的抗性不会因为病毒接种量而克服；3、抗性的获得不产生新的异源蛋白，提高了转基因植物的生、抗性的获得不产生新的异源蛋白，提高了转基因植物的生物安全性。物安全性。缺点：缺点：缺点：缺点：1、只有少数病毒具有卫星、只有少数病毒具有卫星RNA，大大限制了其应用范围；，大大限制了其应用范围；2、卫星、卫星RNA有可能被自然的病毒载体包装并释放到环境中；有可能被自然的病毒载体包装并释放到环境中；3、有些卫星、有些卫星RNA可能突变增强病毒致病力或者和植物可能突变增强病毒致病力或者和植物RNA重组，产生难以预料的病症，限制该技术路线的运用。重组，产生难以预料的病症，限制该技术路线的运用。利用病毒卫星利用病毒卫星RNA使植物抗病毒使植物抗病毒 返回选育抗病品种的一般程序选育抗病品种的一般程序确定选育对象确定选育对象品种抗性测定（与病毒株系分化结合）品种抗性测定（与病毒株系分化结合）根据本地品种和分离物的研究收集外地根据本地品种和分离物的研究收集外地品种和病毒的分离物，比较反应差异品种和病毒的分离物，比较反应差异引进该病毒国外所用的鉴别品种引进该病毒国外所用的鉴别品种（四）、化学防治（四）、化学防治化学物质：化学物质：化学物质：化学物质：金属盐类金属盐类:ZnSO4CaCl2有机酸类有机酸类:类黄酮、水杨酸、清洁剂（类黄酮、水杨酸、清洁剂（Tw80、Triton-100）嘌呤嘧啶类：嘌呤嘧啶类：三嗪类、三嗪类、8-偶氮鸟嘌呤偶氮鸟嘌呤维生素类：维生素类：VB2；植物激素类：赤霉素、激动素；植物激素类：赤霉素、激动素蛋白质类蛋白质类氨基酸类氨基酸类:牛奶、原亮氨基酸牛奶、原亮氨基酸天然物质：天然物质：天然物质：天然物质：多糖类多糖类蛋白质类蛋白质类糖蛋白类糖蛋白类蛋白多糖类蛋白多糖类返回返回抑制病毒侵染、病毒蛋白的合成抑制病毒侵染、病毒蛋白的合成 分子量在分子量在1000055000Da从微生物代谢产物中提取抗病毒抑制剂从微生物代谢产物中提取抗病毒抑制剂六六 植物抗病毒基因工程植物抗病毒基因工程 复制酶介导的保护作用 (Replicase Mediated Protection，RPMP) 外壳蛋白介导的保护作用 (Coat Protein Mediated Protection, CPMP) 移动蛋白介导的保护作用 (Movement Protein Mediated Protection, MPMP) 病毒基因相关的其它序列介导的抗性 非病毒来源的基因介导的抗性 P315-319(一一)、复制酶介导的保护作用、复制酶介导的保护作用(ReplicaseMediatedProtection，RPMP)复制酶复制酶(RP)是指由病毒编码的，能特异合成病毒是指由病毒编码的，能特异合成病毒+RNA、-RNA的的RNA聚合酶聚合酶，其核心功能是合成全，其核心功能是合成全长的病毒基因组长的病毒基因组RNA。1988年年Vanan等开始尝试等开始尝试将病毒的将病毒的RP基因转入基因转入植物植物，目前，目前RPMP已在至少已在至少13种病毒种病毒(分属分属10个植个植物病毒属物病毒属)中进行研究。中进行研究。1）RPRP介导的抗性强介导的抗性强介导的抗性强介导的抗性强若产生抗性，能使转基因植物若产生抗性，能使转基因植物产生免疫或高抗。产生免疫或高抗。2)持续时间长持续时间长持续时间长持续时间长一般一般RPMP呈现持续抗性。呈现持续抗性。六六 植物抗病毒基因工程植物抗病毒基因工程 ( (一一一一) )、复制酶介导的保护作用、复制酶介导的保护作用、复制酶介导的保护作用、复制酶介导的保护作用 (RPMP)(RPMP) 3)作用范围相对较窄作用范围相对较窄作用范围相对较窄作用范围相对较窄RPMP一般对提供一般对提供RP基因的亲本基因的亲本病毒株系有抗性，而对那些与亲本株系显示一定序病毒株系有抗性，而对那些与亲本株系显示一定序列差别的同种不同株病毒不表现抗性。列差别的同种不同株病毒不表现抗性。4)可诱导的抗性可诱导的抗性可诱导的抗性可诱导的抗性组成型表达的组成型表达的RP基因介导的抗性绝基因介导的抗性绝大多数是预先建立的，一旦接种病毒就会表现。但大多数是预先建立的，一旦接种病毒就会表现。但也有些表现为可诱导的抗性。也有些表现为可诱导的抗性。5)抗性表现复杂抗性表现复杂抗性表现复杂抗性表现复杂表现表现RPMP的转基因植株的原生质体的转基因植株的原生质体均表现抗性，这种单细胞水平的抗性说明均表现抗性，这种单细胞水平的抗性说明RPMP抑抑制了病毒在宿主细胞中的制了病毒在宿主细胞中的复制复制。有些限制病毒在细。有些限制病毒在细胞间的胞间的移动移动或通过维管束系统或通过维管束系统长距离迁移长距离迁移。六六植物抗病毒基因工程植物抗病毒基因工程( (一一一一) )、复制酶介导的保护作用、复制酶介导的保护作用、复制酶介导的保护作用、复制酶介导的保护作用 (RPMP)(RPMP) RPMP的抗性机理：的抗性机理：(推测的机理推测的机理)依赖于基因沉默依赖于基因沉默(genesilencing)的抗性机制的抗性机制位置效应、转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默位置效应、转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默蛋白质介导的抗性蛋白质介导的抗性：转基因表达的转基因表达的RP干扰了病毒复制和移动干扰了病毒复制和移动形成形成RNA-RNA抑制双体抑制双体：转基因转录产物和接种的病毒转基因转录产物和接种的病毒RNA间形成间形成RNA-RNA复合体，影响了病毒复合体，影响了病毒RNA与各种蛋白与各种蛋白间的互作，从而干扰病毒侵染。间的互作，从而干扰病毒侵染。转基因产物复制酶作为激发子引发宿主的防御系统反应转基因产物复制酶作为激发子引发宿主的防御系统反应情况可能更复杂，涉及多种抗性机理同时起作用情况可能更复杂，涉及多种抗性机理同时起作用六六植物抗病毒基因工程植物抗病毒基因工程(二二)、外壳蛋白介导的保护作用外壳蛋白介导的保护作用(CoatProteinMediatedProtection,CPMP)研究最早、应用最多的植物抗病毒基因工程策略研究最早、应用最多的植物抗病毒基因工程策略 自自1986年成功获得年成功获得TMVCP介导的抗介导的抗TMV的烟草，到目前为的烟草，到目前为止，已针对止，已针对10多个属多个属30余种病毒进行了余种病毒进行了CPMP试验，转基因试验，转基因受体植物多达十几种，其中大多数转入受体植物多达十几种，其中大多数转入CP基因的植株对同源基因的植株对同源性较高的同属大多数病毒有一定程度的抗病性，表现为性较高的同属大多数病毒有一定程度的抗病性，表现为症状症状症状症状减轻或延迟出现减轻或延迟出现减轻或延迟出现减轻或延迟出现，或症状限于接种叶片，或症状限于接种叶片不扩展不扩展不扩展不扩展到新生叶片，到新生叶片，病毒含量低或测不到。病毒含量低或测不到。局限性：局限性：局限性：局限性：CPMP一般只是推迟发病一般只是推迟发病，抗性主要表现在，抗性主要表现在病毒侵染早期，一旦提高病毒接种量或重复接种则病毒侵染早期，一旦提高病毒接种量或重复接种则抗性破坏。抗性破坏。目前倾向于把目前倾向于把CPMP与其它抗性基因策略相结合。与其它抗性基因策略相结合。六六植物抗病毒基因工程植物抗病毒基因工程(二二)、外壳蛋白介导的保护作用外壳蛋白介导的保护作用(CoatProteinMediatedProtection,CPMP)CPMPCPMP机理：机理：机理：机理：以前认为是以前认为是CP干扰了病毒粒子侵染早期的脱衣壳过程，干扰了病毒粒子侵染早期的脱衣壳过程，使其无法暴露出内部核酸，进而抑制在宿主体内的复制和使其无法暴露出内部核酸，进而抑制在宿主体内的复制和增殖，故增殖，故CPMP对接种病毒对接种病毒RNA无效。无效。但越来越多的实验结果使情况变得复杂，发现但越来越多的实验结果使情况变得复杂，发现CP可以影可以影响病毒通过响病毒通过胞间连丝胞间连丝的移动，可能参与抑制病毒的长距离的移动，可能参与抑制病毒的长距离迁移，迁移，抑制病毒复制抑制病毒复制或作为激发子识别宿主抗性基因，引或作为激发子识别宿主抗性基因，引发发HR(HypersensitiveResponse)。六六植物抗病毒基因工程植物抗病毒基因工程(三)、移动蛋白介导的保护作用 (Movement Protein Mediated Protection, MPMP) MP由病毒基因编码，负责参与病毒在寄主细胞之间由病毒基因编码，负责参与病毒在寄主细胞之间传递和通过植物维管组织长距离迁移，从而导致寄传递和通过植物维管组织长距离迁移，从而导致寄主整体发病。主整体发病。只有当转基因植物只有当转基因植物表达的是失去功能的表达的是失去功能的MP时，才能时，才能显示出抗性。而当转基因表达有功能的显示出抗性。而当转基因表达有功能的MP时，或者时，或者对病毒侵染无影响，或者反而提高植物感病性。对病毒侵染无影响，或者反而提高植物感病性。用有运动缺陷的同源或异源病毒接种这种转基因植用有运动缺陷的同源或异源病毒接种这种转基因植物，病毒能恢复正常的胞间转运甚至能在植物内长物，病毒能恢复正常的胞间转运甚至能在植物内长距离迁移，从而导致距离迁移，从而导致病害加重病害加重病害加重病害加重。它突出的优点在于它突出的优点在于广谱抗性广谱抗性广谱抗性广谱抗性。 六六植物抗病毒基因工程植物抗病毒基因工程(三)、移动蛋白介导的保护作用 (Movement Protein Mediated Protection, MPMP) MPMP机理属于属于蛋白质水平蛋白质水平介导的抗性介导的抗性转基因表达的失去功能的转基因表达的失去功能的MP与接种病毒的野生型与接种病毒的野生型MP竞竞争胞间连丝上的结合位点争胞间连丝上的结合位点许多不同病毒的许多不同病毒的MP可能与相同的胞间连丝成分起作用可能与相同的胞间连丝成分起作用( (广谱抗性的例子暗示广谱抗性的例子暗示) )也可能涉及病毒编码的蛋白、病毒基因组和寄主因子间也可能涉及病毒编码的蛋白、病毒基因组和寄主因子间的的相互作用相互作用 六六植物抗病毒基因工程植物抗病毒基因工程六六植物抗病毒基因工程植物抗病毒基因工程(四四)、病毒基因相关的其它序列介导的抗性病毒基因相关的其它序列介导的抗性核酶核酶(Ribozyme，Rz)和反义基因和反义基因核酶是一种能特异切割核酶是一种能特异切割RNA的的RNA，依据已知的病毒基因组的，依据已知的病毒基因组的特定区域序列设计特定区域序列设计Rz,使它能特异地识别、切割病毒的特定区使它能特异地识别、切割病毒的特定区域，从而切断病毒基因组，破坏其生物功能。域，从而切断病毒基因组，破坏其生物功能。蛋白酶基因蛋白酶基因马铃薯马铃薯Y病毒属的病毒编码的病毒属的病毒编码的NIa(NuclearInclusiona)具蛋白酶具蛋白酶性质，表达烟草脉斑驳病毒性质，表达烟草脉斑驳病毒(TVMV)NIa的烟草能抗的烟草能抗TVMV;表表达达PVYNIa的烟草能抗的烟草能抗PVY。卫星卫星RNA和缺损干扰和缺损干扰RNA(DefectiveInterfering，DI)Sat-RNA一般与辅助病毒没有序列同源性，而一般与辅助病毒没有序列同源性，而DI-RNA与辅助病与辅助病毒有序列同源性，利用毒有序列同源性，利用Sat-RNA和和DI-RNA均能达到干扰病毒均能达到干扰病毒复制、扩散及其它生物功能，从而减轻症状。复制、扩散及其它生物功能，从而减轻症状。反义基因是与目的核酸序列反义基因是与目的核酸序列(正链或负链正链或负链)互补的反义序列，它可以抑制或封闭目互补的反义序列，它可以抑制或封闭目的基因的复制、剪接和表达。的基因的复制、剪接和表达。表达表达PLRV、TEV、TGMVCP基因的反义基因的反义RNA的烟草对各自来源的病毒都显示的烟草对各自来源的病毒都显示了较强抗性。了较强抗性。核酶和反义基因相结合有望达到更高的抗病毒效果。核酶和反义基因相结合有望达到更高的抗病毒效果。六、植物抗病毒基因工程六、植物抗病毒基因工程(五五)、非病毒来源的基因介导的抗性非病毒来源的基因介导的抗性来源于植物本身的抗性基因来源于植物本身的抗性基因植物抗体植物抗体(Plantibody)基因基因核糖体钝化蛋白核糖体钝化蛋白(RibosomeInactivatingProtein，RIP)2-5寡聚腺苷寡聚腺苷(2-5-oligo-adenylate,2-5)系统系统2-5系统是高等脊椎动物的一种抗病毒机制，它包含系统是高等脊椎动物的一种抗病毒机制，它包含2个个关键酶：关键酶：2-5合成酶与依赖于合成酶与依赖于2-5的的RNaseL，通过病毒，通过病毒侵染形成的侵染形成的dsRNA激活激活2-5系统，降解病毒系统，降解病毒RNA，从而阻，从而阻止其复制及扩散。止其复制及扩散。六、植物抗病毒基因工程六、植物抗病毒基因工程局限性与危险性局限性与危险性局限性与危险性局限性与危险性应用前景瞩目，美国批准商业化应用的转基因植物有抗病毒西应用前景瞩目，美国批准商业化应用的转基因植物有抗病毒西葫芦，番茄和番木瓜等，目前国内也有转基因抗病毒烟草、葫芦，番茄和番木瓜等，目前国内也有转基因抗病毒烟草、番茄和甜椒的产品获准商业化应用。番茄和甜椒的产品获准商业化应用。研究方向研究方向研究方向研究方向用用多多种种类类型型的的抗抗性性基基因因来来获获得得广广谱谱的的、高高程程度度的的抗抗性性。如如作作用用于于病病毒毒侵侵染染早早期期的的CPMP，广广谱谱的的MPMP与与作作用用于于侵侵染染后后的的RPMP相结合；相结合；开展基础研究，探讨抗性机理，以求更准确有效地导入合适开展基础研究，探讨抗性机理，以求更准确有效地导入合适的外源基因；的外源基因；揭示植物本身的防御机制以提高植物的内在抗性；揭示植物本身的防御机制以提高植物的内在抗性；用用基基因因工工程程技技术术将将综综合合性性状状，质质量量性性状状基基因因一一起起导导入入目目的的植植物，再物，再与常规育种相结合与常规育种相结合，培育抗病毒、高品质的新品种。，培育抗病毒、高品质的新品种。七、植物病毒检测的七、植物病毒检测的主要方法主要方法生物学特性生物学特性测定测定：在鉴别寄主上的反应、症状、传播等在鉴别寄主上的反应、症状、传播等显微镜显微镜观察观察：内涵体、病毒粒子、定位分布等内涵体、病毒粒子、定位分布等免疫学特性免疫学特性测定测定：以血清学和组织免疫化学方法检以血清学和组织免疫化学方法检测材料带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体测材料带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体分子生物学技术分子生物学技术鉴定鉴定：核酸分子杂交、核酸分子杂交、PCR等等分子标记技术（分子标记技术（AFLP、RFLP、RAPD）生物学鉴定生物学鉴定依靠寄主植物和病毒的传播方式依靠寄主植物和病毒的传播方式寄主病症、寄主范围、介体、交叉保护现象等寄主病症、寄主范围、介体、交叉保护现象等依靠症状诊断不完全可靠依靠症状诊断不完全可靠：不同病毒在同种植物产生相同症状不同病毒在同种植物产生相同症状同种病毒在植物的不同栽培品种上症状不尽一致同种病毒在植物的不同栽培品种上症状不尽一致同种病毒的不同株系可产生不同症状同种病毒的不同株系可产生不同症状复合侵染复合侵染常有潜伏侵染常有潜伏侵染不同土壤和气候条件可改变症状不同土壤和气候条件可改变症状鉴别寄主检验鉴别寄主检验马铃薯病毒在马铃薯病毒在鉴别寄主鉴别寄主上的症状表现上的症状表现检验病毒检验病毒 接种植物接种植物 检查时间检查时间 症状表现症状表现PVX千日红千日红57d叶面有红色环形枯斑叶面有红色环形枯斑PVM千日红千日红1224d叶面有紫红色小枯斑叶面有紫红色小枯斑PVS千日红千日红1425d叶面有桔红色小枯斑叶面有桔红色小枯斑PVG心叶烟心叶烟20d系统性白斑花叶系统性白斑花叶PVY普通烟普通烟710d明脉，后脉常花叶明脉，后脉常花叶PVA香料烟香料烟710d明明脉脉PSTV莨莨菪菪510d沿脉出现褐色环死斑沿脉出现褐色环死斑TestingforSoybeanViruseswithIndicatorPlantsHypersensitivitySomeplantsarepredictablysensitivetoaspecificvirus.Thehypersensitiveplantsarecalledindicatorplants, andareusedasabioassaytotestforthepresenceofvirusinanunknownsample1Materials:gloves,sterilecottonswabs,rinsebottle,tissuegrindingbagsandcarborundum-siliconcarbidewhichisusedasatissueabrasive2Plantsapismadefromtheplanttobetestedforvirusbypullingoffasymptomaticupperleaf3placingtheleafinasterileplasticbag.addingbuffersolutiontothebag.grindtheleaftissuetoreleasethevirusparticlesintothebuffer.4sprinkleabitofcarborundumontheplanttobeinoculated.Justalightdustingissufficienttoprovideenoughabrasiontointroducevirusintotheplantcells.5inoculatetheindicatorplant,acottonswabisimmersedinplantsaprubthesurfaceofthetestplantleaffirmly,butnotwithenoughforcetoteartheleaf67rinseoffthecarborundumexcesssapfromtheleafwithwatertoremovecompoundsthatcouldinterferewiththeinfectionprocess8Theindicatorplantsareplacedinthegreenhouseandcheckeddailyforsymptoms.Ifcharacteristicsymptomsappear,weknowthatvirusparticleswerepresent光镜与电镜观察光镜与电镜观察光镜用于植物病毒内涵体的细胞学研究光镜用于植物病毒内涵体的细胞学研究内涵体类型、形态、组成、亚结构及其位置等内涵体类型、形态、组成、亚结构及其位置等电镜电镜(生物样品的分辨率生物样品的分辨率35nm,0.10.2nm)观察病毒详细的结构、形态特征观察病毒详细的结构、形态特征电镜负染技术电镜负染技术:快速、简单和直接，但需要一定快速、简单和直接，但需要一定技能，而且工作比较集中，所以样本数量大则技能，而且工作比较集中，所以样本数量大则不易处理。不易处理。(磷钨酸及其钾或钠盐作负染剂）磷钨酸及其钾或钠盐作负染剂）免疫吸附电镜技术（免疫吸附电镜技术（ISEM）：电镜与血清学技术结合：如胶体金免疫电镜技术电镜与血清学技术结合：如胶体金免疫电镜技术成功用于检测病汁液中不同形态的病毒。成功用于检测病汁液中不同形态的病毒。ISEM一般是把抗体先吸附在电镜铜网的支架膜上，加上一般是把抗体先吸附在电镜铜网的支架膜上，加上抗原抗原，然后再加第二次抗体，最后用醋酸铀作负染色。如，然后再加第二次抗体，最后用醋酸铀作负染色。如抗原和抗体两者有反应，则第一次抗体可把抗原抗原和抗体两者有反应，则第一次抗体可把抗原“捕获捕获”于铜网上。第二次抗体的处理则使抗原粒子四周包被抗体于铜网上。第二次抗体的处理则使抗原粒子四周包被抗体分子，负染色的结果在抗原粒子四周形成一分子，负染色的结果在抗原粒子四周形成一“抗体晕抗体晕”。在电镜观察中，使抗原更为突出，易于观察。在电镜观察中，使抗原更为突出，易于观察。光镜与电镜观察光镜与电镜观察免疫吸附电镜技术免疫吸附电镜技术(ISEM)：特点：特点：利用电镜高度放大率和分辨能力，直接对利用电镜高度放大率和分辨能力，直接对细胞内的抗原定位，看到抗原与抗体之间特异性细胞内的抗原定位，看到抗原与抗体之间特异性反应和免疫复合物的形态学特征，具有反应和免疫复合物的形态学特征，具有高度敏感高度敏感性性和和特异性特异性。当被测样本小时，它尤其适用。当被测样本小时，它尤其适用。应用：应用：广泛用于检测和鉴定植物病汁液中不同形广泛用于检测和鉴定植物病汁液中不同形态（线状、棒状和球状）的病毒。态（线状、棒状和球状）的病毒。1973年发明以来，已成为植物病毒研究的一个重年发明以来，已成为植物病毒研究的一个重要手段，尤其是要手段，尤其是胶体金免疫电镜技术胶体金免疫电镜技术。光镜与电镜观察光镜与电镜观察免疫电镜负染结果免疫电镜负染结果观察到大量圆形病毒颗粒，直径为观察到大量圆形病毒颗粒，直径为2022nm 光镜与电镜观察光镜与电镜观察免疫吸附电镜技术免疫吸附电镜技术(ISEM)A金颗粒特异性地标记在病毒粒子囊膜表面的纤突上金颗粒特异性地标记在病毒粒子囊膜表面的纤突上B单抗与甲醛固定的病毒粒子发生特异性反应单抗与甲醛固定的病毒粒子发生特异性反应Pinwheels,ScollsandLaminatedAggregatesPotyvirusCylindricalInclusions Pinwheels,Scolls,andshortCurvedLaminatedAggregates采用几种电镜技术观采用几种电镜技术观察病毒粒子的形态察病毒粒子的形态Orfvirus：口疮病毒口疮病毒(接触性脓疱皮炎接触性脓疱皮炎) )Ebolavirus埃博埃博拉病毒（正染技术）拉病毒（正染技术）Vacciniavirus痘苗病毒痘苗病毒（投影技术）（投影技术）负染技术负染技术免疫学方法免疫学方法在病毒检测中应用最广泛的有：在病毒检测中应用最广泛的有：1.ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassay)优点：优点：具免疫荧光法和放射免疫法的反应灵敏、具免疫荧光法和放射免疫法的反应灵敏、特异性强的优点、克服常规血清学方法中受病毒特异性强的优点、克服常规血清学方法中受病毒浓度、粒子形态和抗血清用量等缺陷。浓度、粒子形态和抗血清用量等缺陷。方法：方法：间接法、双抗体法、双夹心法、竞争法间接法、双抗体法、双夹心法、竞争法应用：应用：ELISA反应快速便利，适合于大规模田间反应快速便利，适合于大规模田间样本的常规病毒检测，也广泛用于脱毒植物、无样本的常规病毒检测，也广泛用于脱毒植物、无性繁殖的苗木以及种子上的病毒检测。性繁殖的苗木以及种子上的病毒检测。酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法间接法双抗体夹心法双抗体夹心法竞争法竞争法直接法直接法双夹心法双夹心法非标记抗体酶法非标记抗体酶法原原理理：酶标抗体酶标抗体抗原抗原酶标抗原抗体酶标抗原抗体复合物复合物底物底物产物产物显色剂显色剂比色测定比色测定酶促反应酶促反应将酶标记的抗原或抗体吸附到适当的载体将酶标记的抗原或抗体吸附到适当的载体上进行抗原上进行抗原抗体反应及酶催化反应。抗体反应及酶催化反应。免疫学方法免疫学方法在病毒检测中应用最广泛的有：在病毒检测中应用最广泛的有：2.免疫扩散免疫扩散（单向与双向）（单向与双向）用于比较同源、异源抗原，可区别病毒不用于比较同源、异源抗原，可区别病毒不同种和不同株系。同种和不同株系。3.斑点免疫结合测定法（斑点免疫结合测定法（DIBA）以硝酸纤维薄膜为载体进行酶联免疫吸附测定。以硝酸纤维薄膜为载体进行酶联免疫吸附测定。硝酸纤维膜比酶联板便宜而且携带方便，进行田硝酸纤维膜比酶联板便宜而且携带方便，进行田间病害诊断时，可直接用病毒粗汁液进行大量样间病害诊断时，可直接用病毒粗汁液进行大量样本的测定。本的测定。比比ELISA简单，实验流程短，不需任何特殊设备，简单，实验流程短，不需任何特殊设备，而且灵敏度高。而且灵敏度高。抗原抗原/抗体抗体吸附在吸附在NC膜上，通过与相应的膜上，通过与相应的抗体抗体/抗原抗原和酶标记和酶标记物反应形成酶标记的物反应形成酶标记的抗原抗原-抗体复合物抗体复合物，加入相应底物后显色，加入相应底物后显色，呈现肉眼可见的颜色斑点，根据颜色有无和深浅判定。呈现肉眼可见的颜色斑点，根据颜色有无和深浅判定。免疫学方法免疫学方法免疫扩散免疫扩散用于比较同源、异源抗原，可区别病毒不同种和用于比较同源、异源抗原，可区别病毒不同种和不同株系不同株系有共同抗原，有共同抗原，但不完全相同但不完全相同不同抗原不同抗原免疫学方法免疫学方法在病毒检测中应用最广泛的有：在病毒检测中应用最广泛的有：4.组织印迹法组织印迹法在在ELISA的基础上发展起来的植物病毒检测技术的基础上发展起来的植物病毒检测技术保持保持ELISA对病毒检测的灵敏度高、特异性强的特对病毒检测的灵敏度高、特异性强的特点，而且大大地简化了操作程序，对病毒的检测更点，而且大大地简化了操作程序，对病毒的检测更加加快速、简单、方便快速、简单、方便。印迹在硝酸纤维膜上的样品能印迹在硝酸纤维膜上的样品能保存保存3个月以上，检测个月以上，检测结果能结果能直观直观地显示出病毒感染的部位。地显示出病毒感染的部位。尤其适用于植物病毒的尤其适用于植物病毒的大规模大规模普查，是近年来国外普查，是近年来国外对植物病毒检测广泛采用的技术。对植物病毒检测广泛采用的技术。植物病毒的检测植物病毒的检测组织印迹法组织印迹法1 1、基本原理、基本原理、基本原理、基本原理与间接与间接ELISA相同，首先将待测样品印迹在固相载体相同，首先将待测样品印迹在固相载体NC上，用病毒的家兔特异性抗体上，用病毒的家兔特异性抗体(Ig)与吸附在固与吸附在固相载体上的病毒进行特异性反应，再与碱式磷酸酶相载体上的病毒进行特异性反应，再与碱式磷酸酶(AlkalinephosphataseAP)标记的第二抗体（羊抗兔标记的第二抗体（羊抗兔Fc）进行反应，最后用碱式磷酸酶的反应底物）进行反应，最后用碱式磷酸酶的反应底物BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/nitrobluetetrazolium)进行显色反应，根据颜色的变进行显色反应，根据颜色的变化，确定病毒的感染程度。化，确定病毒的感染程度。植物病毒的检测植物病毒的检测组织印迹法组织印迹法具体反应：具体反应：具体反应：具体反应：碱式磷酸酶（碱式磷酸酶（AP）以硝基）以硝基酚磷酸盐酚磷酸盐为底物，在为底物，在pH9.5条件下产生条件下产生不溶性不溶性蓝色。蓝色。(辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶HRP是以是以H2O2为底物为底物,需要供氢体如需要供氢体如四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)参与，参与，在在pH5.0条件下产生条件下产生可溶可溶性黄色产物性黄色产物，需借助比色，需借助比色分析分析.)植物病毒的检测植物病毒的检测组织印迹法组织印迹法植物病毒的检测植物病毒的检测组织印迹法组织印迹法基本步骤基本步骤1、采样、采样3、封闭、封闭2、点样、点样4、洗涤、洗涤5、病毒与特异、病毒与特异抗体反应抗体反应6、洗涤、洗涤7、第二抗体连接反应、第二抗体连接反应8、洗涤、洗涤9、显色反应、显色反应10、终止显色、终止显色11、干燥保存、干燥保存采取植物叶、茎根等，避免手与样采取植物叶、茎根等，避免手与样品伤口接触，装入塑料袋。品伤口接触，装入塑料袋。将将NC膜膜置于平整洁净滤纸上，用手置于平整洁净滤纸上，用手术刀片横切样品，将切口均匀压印在术刀片横切样品，将切口均匀压印在膜上，印迹清晰为宜，每张膜上可排膜上，印迹清晰为宜，每张膜上可排列数百个样品，设正负对照。列数百个样品，设正负对照。将点好样的膜置于盛有将点好样的膜置于盛有2脱脂奶粉的脱脂奶粉的PBS封闭液的培养皿中，封闭液的用量以覆盖封闭液的培养皿中，封闭液的用量以覆盖膜为宜在膜为宜在37下温浴下温浴lh或或4过夜过夜用用PBS-Tbuffer洗膜洗膜3次，次，5min/次次将清洗后的膜转入含有特异性抗将清洗后的膜转入含有特异性抗体的封闭液或体的封闭液或PBS缓冲液的培养缓冲液的培养皿中，皿中，37下温育下温育3h或或4过夜过夜7洗毕，将膜转入含碱式磷酸酶标洗毕，将膜转入含碱式磷酸酶标记的羊抗兔第二抗体的记的羊抗兔第二抗体的PBS缓冲缓冲液中，液中，37下温育下温育3h或或4过夜过夜9将将NC膜膜转入显色液中直至阳转入显色液中直至阳性对照显色为止（性对照显色为止（510min）10待阳性对照显示清晰的紫蓝色待阳性对照显示清晰的紫蓝色时，将膜转入蒸馏水中终止反应时，将膜转入蒸馏水中终止反应终止反应后将膜放置于干净的终止反应后将膜放置于干净的卫生纸之间，使之干燥，待完全卫生纸之间，使之干燥，待完全干燥后过塑，便永久保存和观察干燥后过塑，便永久保存和观察植物病毒的检测植物病毒的检测组织印迹法的灵敏度组织印迹法的灵敏度一次切割，连印一次切割，连印45次（蕙兰花叶病毒）次（蕙兰花叶病毒）感病叶汁液稀释感病叶汁液稀释1：100000，均呈，均呈+灵敏度可达灵敏度可达2020pg/ /ml(1 1pg=1=11010-12-12g)较较ELISA方法灵敏方法灵敏2 23 3个反应级个反应级免疫学方法受到的限制免疫学方法受到的限制检测病毒的基础是利用检测病毒的基础是利用病毒外壳蛋白的抗原性病毒外壳蛋白的抗原性,但有些植物病但有些植物病毒在某些情况下缺乏外壳蛋白毒在某些情况下缺乏外壳蛋白,而类病毒则没有外壳蛋白而类病毒则没有外壳蛋白;季节性的不确定变化季节性的不确定变化问题常阻碍问题常阻碍+与与-样品的区分样品的区分:如如ELISA可可以检测出藜属的叶、花、果实中的以检测出藜属的叶、花、果实中的CMLV,但对于休眠植物的但对于休眠植物的木本部分却难以成功木本部分却难以成功;病毒在感染植株上病毒在感染植株上不均匀分布不均匀分布，病毒分离物的多样性也给，病毒分离物的多样性也给ELISA法带来了问题，从苹果、樱桃、梨上分别取样检测法带来了问题，从苹果、樱桃、梨上分别取样检测ACLSV的存在，只有花瓣是可行的，因此准确鉴定局限于每的存在，只有花瓣是可行的，因此准确鉴定局限于每个生长期的个生长期的2周时间周时间;CMLV与与PMV可以侵染相似的寄主，然而导致不同的病症可以侵染相似的寄主，然而导致不同的病症,并且两者在并且两者在血清学上相关血清学上相关，用，用ELISA不易检测。不易检测。病毒检测的分子生物学技术病毒检测的分子生物学技术灵敏度高、特异性强灵敏度高、特异性强、检测速度更快检测速度更快、操作简便操作简便、可用于大量可用于大量样品的检测。样品的检测。可以从植物体的任何部分取样检测可以从植物体的任何部分取样检测, ,很容易区分病毒，甚至很容易区分病毒，甚至病毒的不同株系或分离物。病毒的不同株系或分离物。应用组织印迹杂交技术检测蕙兰花叶病毒应用组织印迹杂交技术检测蕙兰花叶病毒(CyMV)和齿瓣兰和齿瓣兰环斑病毒环斑病毒(ORSV) ,(ORSV) ,其灵敏度可达其灵敏度可达2020pg/ /ml11pg( (皮克皮克)= 1)= 11010- -12 12 g 分子生物学检测法是通过检测病毒核酸来证实病毒的存在。分子生物学检测法是通过检测病毒核酸来证实病毒的存在。此方法比血清学方法的灵敏度高此方法比血清学方法的灵敏度高, ,能检测到能检测到pg级甚至级甚至fg级级11fg( (飞克飞克)=1)=11010-15-15g 的病毒的病毒. .1、核酸序列分析技术、核酸序列分析技术2、dsRNA电泳技术电泳技术3、PCR技术技术4、限制性内切图谱、限制性内切图谱5、分子标记技术、分子标记技术:AFLP、RFLP、RAPD病毒检测的分子生物学技术病毒检测的分子生物学技术病毒检测的分子生物学技术病毒检测的分子生物学技术1、核酸分子杂交技术、核酸分子杂交技术杂交的双方是使用的杂交的双方是使用的探针探针和和要检测的核酸。要检测的核酸。待测核酸待测核酸克隆的基因片段、未克隆化的基因组克隆的基因片段、未克隆化的基因组DNA、病毒、病毒总总RNA。被检测核酸被检测核酸提纯提纯(膜上印迹杂交或液相杂交膜上印迹杂交或液相杂交),在细胞内杂交在细胞内杂交(细胞原位杂交细胞原位杂交)。所用探针必须标记。所用探针必须标记,以便示踪和检测。以便示踪和检测。最初用放射性同位素最初用放射性同位素(如如32)标记探针标记探针;但不利常规检测但不利常规检测,且探且探针寿命短。针寿命短。非放射性探针分子非放射性探针分子,如生物素或地高辛标记的探针分子如生物素或地高辛标记的探针分子特定基因标记特定基因标记2、dsRNA电泳技术电泳技术原理原理：ssRNA病毒在植物体内增殖，通过核酸互补而形成一种病毒在植物体内增殖，通过核酸互补而形成一种健康植物没有的碱基配对健康植物没有的碱基配对dsRNA。dsRNA经经提纯、电泳、染色提纯、电泳、染色后后,在凝胶上所显示的谱带可以反映每种病毒组群的特异性，并在凝胶上所显示的谱带可以反映每种病毒组群的特异性，并且有些单个病毒的且有些单个病毒的dsRNA在电泳图谱上也显示一定的特征。因在电泳图谱上也显示一定的特征。因此此,利用病毒利用病毒dsRNA的电泳图谱可以检测出病毒的类型和种类。的电泳图谱可以检测出病毒的类型和种类。已用于一些病毒属的分类研究已用于一些病毒属的分类研究(如黄化病毒属、马铃薯病毒属、如黄化病毒属、马铃薯病毒属、番石竹潜病毒属、烟草坏死病毒属、黄瓜花叶病毒属、绒毛烟番石竹潜病毒属、烟草坏死病毒属、黄瓜花叶病毒属、绒毛烟斑驳病毒属斑驳病毒属)。病毒检测的分子生物学技术病毒检测的分子生物学技术dsRNA分析法在植物病毒的分析法在植物病毒的检测中的用途检测中的用途 （1）判断）判断RNA病毒是否存在；病毒是否存在；（2）在病毒属水平上，对病毒进行鉴定；）在病毒属水平上，对病毒进行鉴定；（3）鉴别单个病毒或株系；）鉴别单个病毒或株系；（4）检测卫星）检测卫星RNA和卫星病毒。和卫星病毒。很适合于病毒复合侵染的检测：很适合于病毒复合侵染的检测：dsRNA分析法分析法是是非特异性非特异性的实的实验方法，可检测样本中的任何验方法，可检测样本中的任何dsRNA，包括数量少的病毒，以，包括数量少的病毒，以及除病毒侵染外其他来源的及除病毒侵染外其他来源的dsRNA。dsRNA分析法还可对来自田间的样本直接检测，如果是新病毒分析法还可对来自田间的样本直接检测，如果是新病毒或不易纯化的病毒，或不易纯化的病毒，dsRNA分析则是病毒检测的唯一选择。分析则是病毒检测的唯一选择。dsRNA分析法的局限性分析法的局限性（1）无法用于大数量样本的检测；）无法用于大数量样本的检测；（2）检测需要知识和技能，尤其当无法与已知病毒）检测需要知识和技能，尤其当无法与已知病毒相比较时；相比较时；（3）病毒检测时进行的）病毒检测时进行的dsRNA分析，常包括潜隐病分析，常包括潜隐病毒和非病毒的毒和非病毒的dsRNA；（4）dsRNA不能用于不能用于DNA病毒检测。病毒检测。3、多聚酶链式反应技术、多聚酶链式反应技术(PCR)PCR用于植物病毒检测：是先扩增植物病毒基因用于植物病毒检测：是先扩增植物病毒基因DNA或或RNA的的cDNA，再对扩增物，再对扩增物(DNA)进行电泳或核酸杂交分析。植物进行电泳或核酸杂交分析。植物病毒病毒PCR扩增所用引物因病毒而异扩增所用引物因病毒而异对核酸序列已知病毒用对核酸序列已知病毒用DNA合成仪合成仪合成的引物合成的引物，对核苷酸序列未知的病毒用对核苷酸序列未知的病毒用随机引物随机引物进行扩增，进行扩增，对大多数对大多数RNA植物病毒，先通过逆转录酶法植物病毒，先通过逆转录酶法合成其合成其cDNA，后以，后以cDNA作为作为PCR扩增的模板。扩增的模板。PCR技术发明后，不断衍生出许多新的技术，使其应用范围技术发明后，不断衍生出许多新的技术，使其应用范围不断扩大，特异性和敏感性也不断提高。不断扩大，特异性和敏感性也不断提高。PCR用于植物病毒用于植物病毒的鉴定与分类，灵敏度高、特异性强、快速简便，特别当样的鉴定与分类，灵敏度高、特异性强、快速简便，特别当样品病毒含量低，血清学方法难以检出时，效果更好。品病毒含量低，血清学方法难以检出时，效果更好。病毒检测的分子生物学技术病毒检测的分子生物学技术植物病毒的症状特点植物病毒的症状特点植物病毒传播植物病毒传播病害防治原理与方法病害防治原理与方法植物病毒抗病基因工程植物病毒抗病基因工程检测原理与方法检测原理与方法本本章章要要点点病毒保藏病毒保藏后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料仅供参考，实际情况实际分析主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求The 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