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生化药品概论.近些年来,伴随着生物化学、医药学的蓬勃发展,在临床上愈来愈多地应用氨基酸、多肽、蛋白质、核酸、酶及辅酶、糖类、脂类等生物体内的生化基本物质,预防、诊断和治疗多种疾病,并取得了令人鼓舞的效果。蛋白质、糖类、脂类是生物体内的基本组成物质和主要能量来源。.生命的基本特征是蛋白质的自我更新,生命的许多现象,如神经感受性、肌肉收缩、生长繁殖、免疫反应等都以蛋白质为物质基础,氨基酸则是组成蛋白质的基本物质;核酸在体内起指导各种特异蛋白质合成的作用,与生长、发育、繁殖、遗传、变异都有着极为密切的关系;酶是生物体内的催化剂,参与一切代谢过程;激素是体内各种化学反应的速度、方向以及相互关系的“自控调节器”。.第一节 生物药物的研究范围一、生物药物的历史与现状 早期阶段 生物药物多来自动物脏器,但有效成分不明。 上世纪二十年代到本世纪末 对动物脏器有效成分逐渐明确,从生物体分离、纯化酶制剂的技术日益成熟,酶类药物广泛应用;并且各种激素类药物和疫苗等迅速发展。此外,应用酶工程技术、细胞工程技术和基因工程技术生产抗生素、氨基酸和植物次生代谢产物进入产业化阶段。 本世纪 广泛应用现代生物技术开发各类新型药物和改造传统的制药工业。.生化药物的发展几乎是伴随着生物化学的发展,生物化学史也就是生化药物史。生物化学是生命科学中最古老的学科之一(遗传学、细胞学)。18世纪,一些从事化学研究的科学家,如拉瓦锡、舍勒等人和一些药剂师、炼丹师转向生物领域,这就为生物化学的诞生播下了种子。这时生物学就逐渐分离成生理化学、遗传学、细胞学。 19世纪末,又从生理化学中分离出生物化学 20世纪中后期又从生物化学中分离出分子生物学 .1、生化药物发展概况 迄今为止,生化药物按照其产品纯度、工艺特点和临床疗效大体经历了三个发展阶段,一些利用生物材料加工制成的含有某些天然活性物质与其他共存成分相混合的制剂于20世纪 5070年代相继问世,例如利用牛、羊胆酸与胆红素等制成的人工牛黄,利用牛羊新鲜眼球制成的眼明注射液、滴眼液(现国家标准更名为眼氨肽注射液、滴眼液),利用胎盘生产的胎盘注射液及胎盘片,利用猪肠黏膜生产的肝素钙和肠多糖,利用动物的喉骨或软骨组织生产的硫酸软骨素,利用银耳生产的银耳口服液等。上述药物约有数十个品种。由于疗效尚可,加之质量标准的不断提高 . 具体运用生物化学研究方法,从生物体中具体运用生物化学研究方法,从生物体中经经提取、分离、提取、分离、纯纯化等手段化等手段获获得的天然存得的天然存在的生化活性物在的生化活性物质质或将上述或将上述这这些物些物质质加以加以结结构改造或人工合成构改造或人工合成创创造出的自然界没有造出的自然界没有的新的活性物的新的活性物质质,通称生化,通称生化药药物物(Biochemical medicine)。.二 生化药品的分类 按照制品的纯度,工艺特点和临床疗效特征, 生化药物的发展经历了三个阶段:第一代是利用生物材料加工的含有某些天然活性物质 与混合成分的粗制剂;第二代生化药物是根据生物化学和免疫学原理,应用 近代生化分离、纯化技术从生物体制取的具有 针对性治疗作用的特异生化成分;第三代生化药物是应用生物工程技术生产的天然生物 活性物质以及通过蛋白质工程原理设计制造的 具有比天然物质更高活性的类似物或与天然品 结构不同的全新的药理活性成分。.氨基酸类药物:个别氨基酸制剂和复方氨基酸制剂; 多肽和蛋白质类药物:多肽在生物体内活性很强,对调节生理功能有重要作用;蛋白质类药由单纯蛋白质和结合蛋白质两类;酶与辅酶类药物:酶类药物有助消化酶类、消炎酶类、心血管疾病治疗酶、抗肿瘤酶类和辅酶类药物;核酸及其降解物和衍生物:核酸类、多聚核苷酸、核苷、核苷酸及其衍生物;.多糖类药物:在抗凝、降血脂、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫功能和抗衰老方面具有较强的药理作用;脂类药物:磷脂类、多价不饱和脂肪酸和前列腺素、胆酸类、固醇类和噗啉类;细胞生长因子与组织制剂:这类制剂药效成分不完全清楚,但对某些疾病却有一定疗效;.十大热门生物技术. 所谓疾病,主要是机体因内外环境改变时无法适应,而发生代谢失常,使起控制、调节作用的酶,激素核酸以及蛋白质等生物活性物质自身或环境发生故障;如酶作用的失控,会使产物过多积累而造成中毒或底物大量消耗而得不到补偿,或激素分泌紊乱或免疫功能下降或基因表达调控失灵等。. 如果把上述生物体内的各种基本物质用来补充、调整、增强、抑制、替换或纠正人体代谢的失调,则对疾病的治疗就比较合理了。现在,这些具有生物活性的生化基本物质和某些已知的化学结构,经过人工改造或合成而获得了一些比较理想的新药,巳经成了临床治疗上不可缺少的药物.目前人类所要克服的主要疾病有:(1)肿瘤。在全世界肿瘤死亡率居首位,美国每年用于肿瘤的治疗费用高达1020亿美元;(2)神经退化性疾病。老年痴呆症、帕金森氏病、脑中风及脊椎外伤的生物技术药物治疗;(3)自身免疫性疾病。许多炎症由自身免疫缺陷引起,如哮喘、风湿性关节炎、多发性硬化症、红斑狼疮等。世界上风湿性关节炎患者多于4000万,每年用于治疗风湿性关节炎的医疗费达上千亿美元,一些制药公司正在积极攻克这类疾病;.(4)冠心病。美国有100万人死于冠心病,每年治疗费用高于1170亿美元。今后10年,防治冠心病的药物将是制药工业的重要增长点; (5) 病毒感染性疾病。 无论是谈“艾(AIDS)”色变还是谈“萨(SARS)” 色变的现象都使人们意识到病毒感染性疾病对人类的巨大威胁。人类甚至连相对比较温和的感冒病毒、乙肝病毒(HBV)都难以战胜。从另一角度讲,解决这些疾病为药物科学与技术的发展提供了契机,针对这些疾病的药物研发将是未来药学界和制药业的研究热点和重点.第二节生化药物特点1生物原材料的复杂性 生物材料的复杂性主要表现在以下方面:同一种生化物质的原料可来源于不同生物体如人、动物、微生物、植物、海洋生物等;同一种物质也可由同种生物体的不同组织,器官、细胞产生,如在猪胰脏和猪的颌下腺中都有血管舒缓素并且从两者获得的血管舒缓素并无生物学功能的差别;同一种生物体或组织可产生结构完全不同的物质及结构相似物质。由此也造成对制备技术要求的多样性和复杂性。.2生化物质种类多、有效成分含量低 生物原材料中的生化成分组成复杂,种类多,有效成分含量低,杂质多,尤其是那些生物活性越高的成分,含量往往越低,如胰岛素在胰脏中的含量约为万分之二,脱氧核糖核酸酶的含量约为十万分之四。并且杂质与目的物的性质如溶解度、相对分子质量、等电点都十分相近,使得分离纯化比较困难。所以,直接从生物材料提取含量极低的生理活性物质,没有太大的工业价值。而这正是现代生物技术的重点开发领域。.3生物材料的种属特性 由于生物体间存在着种属特性关系,因而,使许多内源性生理活性物质的应用受到了限制。如用人脑垂体分泌的生长素治疗侏儒症有特效,但用猪脑垂体制备的生长素则对人体无效;牛胰中提取的牛胰岛素单位比猪胰岛素高,牛为40000lUkg,猪为30001Ukg。而抗原性则猪胰岛素比牛胰岛素低,猪胰岛素与人胰岛素只有一个氨基酸差异,而牛胰岛素有三个氨基酸差异。由动物细胞产生的干扰素与人干扰素有抗原交叉反应,而对一些非同源性动物的某些细胞的抗病毒活性作用并不下降。.4药物活性与分子空间构象相关 生化成分中的大分子物质都是以其严格的空间构象维持其生物活性功能的,原有的构象一旦发生变化,其生理活性就完全丧失。引起活性破坏的因素有生物性因素的破坏(如被自身或污染的微生物的酶所破坏)、理化因素的破坏(如pH值、温度、剪切力、重金属、压力等),因而对生产、制剂、贮存、运输等过程条件的控制有较高的要求。.5对制备技术条件要求高 由于生物材料及产品的特殊性,对其生产技术、生产条件、检测方法、检测内容及生产人员都有较高的要求:不管是原料还是产品均为高营养物质,极易染菌腐败,因而对原料的采集、保藏、产品的生产等都有温度和无菌条件的要求;因有效成分含量低、稳定性差等对生产过程中的pH值、温度、剪切力、重金属含量、压力等操作条件均需严格控制;.检测内容不但要有理化检测指标更要求有生物活性检验指标,对生物技术药物还需有工程菌(细胞)的各种分析资料及产物的鉴定分析资料;检测方法要求重现性好,有较高的灵敏度高和专属性;要求生产、管理人员具备一定的知识深度和相当的知识结构。.第三节 传统生化制药的一般工艺过程一、生物材料的选择与保存(一)材料的选择 传统生化药物主要是来源于动物器官、组织、血液经提取获得的一大类内源性生理活性物质。传统生化药品的制造主要包括以下工艺过程: 生物材料的选取与预处理-提取有活性部分-有效成分的分离、纯化-制剂 一、生物材料的选择与保存(一)材料的选择 选取生物材料时需考虑其来源、目的物含量、杂质的种类、价格、材料的种属特性等,其原则是要选择富含所需目的物、易于获得、易于提取的无害生物材料。.1.来源 选材时应选用来源丰富的生物材料,做到尽量不与其他产品争原料,且最好能综合利用。如用胰脏生产弹性蛋白酶、激肽释放酶、胰岛素与胰酶等;用人胎盘生产r-球蛋白、胎盘白蛋白、胎盘脂多糖及胎盘水解物;用人尿生产尿激酶、HCG等;用猪心生产细胞色素C和辅酶Q10等。.2.与有效成分含量相关的因素(二)材料的采集与保存1天然生物材料的保存 由于生理活性物质易失活、降解,所以采集时必须保持材料的新鲜防止腐败、变质与微生物污染。如胰脏采摘后要立即速冻,防止胰岛素活力下降;胆汁在空气中久置,会造成胆红素氧化;提取酶原要及时,止酶原被激活转变为酶。因此生物材料的采摘必须新鲜、快速,及时速冻,低温保存。保存生物材料的方法主要有速冻、冻干、有机溶剂脱水,如制成“丙酮粉”或浸存于丙酮与甘油中等.2动物细胞的保存方法及影响保存质量的因素(1)保存方法 动物细胞培养技术是1907年RG帕拉逊在试管内对蛙的神经组织培养成功后建立的,以后陆续成功地培养了哺乳动物、昆虫、鱼类等各种动物细胞。利用培养的细胞生产疫苗、干扰素、尿激酶、促红细胞生成素和单克隆抗体等已进入工业化生产。动物细胞的保存方法有组织块保存,细胞悬液保存,单层细胞保存及低温冷冻保存等。.组织块保存法 胚胎组织块比成体组织块易保存。胚胎组织如人胚胎肾块在4C可保存2周,长者可达1个月。其方法是取出新生胎儿肾脏剪成小块,洗涤后加生长培养液,于4C过夜,换液一次,可置冰瓶转送他地。.细胞悬液保存法 在一定条件下,细胞悬液可短期保存,不同种类的细胞保存条件亦异,通常于4,在生长培养液中可保存数日或数周。如用胰蛋白酶分散的新鲜猴肾细胞悬液,在4保存10-24h后,离心收集细胞,用新鲜生长培养液再悬浮,于4至少可保存3周。.单层细胞保存法 本法是通过降低温度来延长细胞的正常代谢时间,保存过程中经常更换生长培养液可提高保存的效果。如人羊膜细胞28可保存1个月;人二倍体细胞30可保存2周,中间换液可保存1个月。若生长培养液中牛血清减到0.5-1,37培养,并有规律更换生长培养液,可长期保存。低温冷冻保存 将细胞冻存于-70的低温冰箱中或液氮中。在低温冰箱中可冻存1年以上,在液氮中可长期保存。.(2)影响保存质量的因素细胞的冻存速度 生理浓度盐溶液在-0.5-0.6时开始结冰,若温度急速下降则胞内外一起结冰,可破坏细胞结构,造成细胞死亡,故降温速度应缓慢,先使细胞间隙结冰,将胞内水分慢慢吸出,细胞的脱水程度将达到90以上。温度以1-5min的速度下降,获得的生存率最高。复苏时可加温加速融化,细胞吸收水分,结构与功能不受影响。.保护剂 细胞冻结的保护剂有甘油及二甲基亚砜(DMSO)。甘油能结合水,减少组织结冻量,防止胞内盐浓度上升,使组织慢慢冻结,并能增加细胞膜通透性,而且毒性小对细胞有保护作用。甘油的使用浓度依不同组织而定,一般在5-20之间。DMSO比甘油更能防止细胞冻伤,通透性更高,黏度更低,毒性更小。细胞在DMSO中30s-10min即可达到内外平衡。DMSO常用浓度为5-12.5,使用时应注意DMSO的质量,要用蒸汽高压消毒。复苏时含05%-1DMSO不影响细胞生长。.冻结方法 准备传代的单层细胞可进行冻存。操作方法是用常规方法消化分散细胞,离心收集(800rmin),按每毫升5X106个细胞浓度添加保护剂(保护剂是在生长液中加入8%-10%DMSO、15-20牛血清及适量NaHC03配成,也可添加适量抗生素),然后以1mL量分装于2mL的保存瓶中,在0-4预冻2-4h,摇匀,置于-70冰箱冻存。也可先置于液氮罐气相中过夜,再浸入液相中(-196)保存。或将-70冻存过夜的细胞保存瓶直接浸入液氮中存放。. 冻存细胞的复苏 细胞传代培养前,要先使冻存细胞融化复苏。其过程为取出冻存细胞保存瓶,立即用4层纱布包好。浸入40水中片刻,防止炸裂,去掉纱布,浸入水中摇融40s,混匀后立刻接种到1-2个培养瓶中,按等量稀释法加人生长液使成为20mL。如用DMSO为保护剂即可直接接种,但DMSO必须在生长液中被稀释10倍以上。若保护剂是甘油,即应离心收集细胞,除去甘油后再接种。加完生长培养液后,取样计活细胞数,用台酚蓝染色,死者为蓝色。于37培养4-18h后换液,然后转入传代培养。.二、生物材料的预处理(一)组织与细胞的破碎1物理法(1)磨切法工业上常用的有绞肉机、刨胰机、胶体磨、球磨机、万能磨粉机。实验室常用的有匀浆器、乳钵、高速组织捣碎机。用乳钵时,常加入玻璃粉、氧化铝等助磨剂。.(2)压力法 有渗透压法,高压法和减压法。高压法是用几百万至几千万压力反复冲击物料。减压法是对菌体缓缓加压,使气体溶入细胞,然后迅速减压使细胞破裂。渗透压法是使细胞在浓盐中平衡,再投入水中膨胀破裂。(3)震荡法 用超声波震荡破碎细菌细胞,频率为10一200kHz。该法产热较多,要注意冷却。 .(4)冻融法 将材料先在一15以下冻结,再使其融化,反复操作使细胞与菌体破碎。2.化学法 用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂或表面活性剂(如胆酸盐、氧化十二烷基吡啶)处理细胞,可使细胞结构破坏,释放出内容物。.3生物法(1)组织自溶法 利用组织中自身酶的作用,改变、破坏细胞结构,释放出目的物,称为组织自溶。自溶过程酶原被激活为酶,既便于提取,又提高了效率,但不适用于易受酶降解的目的物的提取。.(2)酶解法 用外来酶处理生物材料,如用溶菌酶处理某些细菌,用胰酶处理猪脑生产脑安泰等。用作专一性分解细胞壁的酶还有细菌蛋白酶、纤维素酶、蜗牛酶、酯酶、壳聚糖(3)噬菌体法 用噬菌体感染细菌、裂解细胞,释放出内容物。此法较少应用。.(二)细胞器的分离 为获得结合在细胞器上的一些生化成分或酶系,常常要先获得特定的细胞器,再进一步分离目的产物。方法是匀浆破碎细胞,离心分离,包括差迷离心和密度梯度离心。现以大鼠肝细胞匀浆的差迷离心分离各种细胞器为例加以说明,见图91。.对所得细胞器的含量与纯度可用电镜观察,用免疫法分析某种特定物质的含量或用“标志酶”法分析特定酶类的浓度予以确定。如线粒体可测定琥珀酸脱氢酶,微粒体可测定NADPH(辅酶)细胞色素C还原酶,细胞膜可测定Na、K-ATP酶,细胞核可测定DNA合成酶。.(三)制备丙酮粉 在生化物质提取前,有时还有用丙酮处理原材料,制成“丙酮粉”,其作用是使材料脱水、脱脂,使细胞结构松散,增加了某些物质的稳定性,有利于提取,同时又减少了体积,便于贮存和运输。而且应用“丙酮粉”提取可以减少提取液的乳化程度及黏度,有利于离心与过滤操作。同时,有机溶剂既能抑制微生物的生长和某些酶的作用,防止目的物降解失活,又能阻止大量无关蛋白质的溶出,有利于进一步纯化。.三、生物活性物质的提取提取是利用制备目的物的溶解特性,将目的物与细胞的固形成分或其他结合成分分离,使其由固相转入液相或从细胞内的生理状态转入特定溶液环境的过程。生物活性物质的提取常用浸渍法(用冷溶剂溶出固体材料中的物质)与浸煮法(用热溶剂溶出目的物)。.(一)提取方法的选择及注意的问题提取是分离纯化活性物质的第一步,其目的和作用是除去与目的物性质差异大的杂质,浓缩目的物。要获得好的提取效果,最重要的是针对生物材料和目的物的性质选择合适的溶剂系统与提取条件。常用的提取方法是固液提取,常用的溶剂是水。生物材料和目的物与提取有关的一些性状包括目的产物的溶解性质、相对分子质量、等电点、存在方式、稳定性、相对密度、粒度、黏度、含量、主要杂质种类及性质、相关酶类的特性等。其中最主要的是目的物与主要杂质在溶解度方面的差异以及它们的稳定性。设计者可根据文献资料及试验结果获得有关信息,选择、设计合适的方法和条件。.在提取过程中尽量增加目的物的溶出度、减少杂质的溶出度,同时关注生物材料及目的物在提取过程中的活性变化。对酶类药物的提取要防止辅酶的丢失和其他失活因素的干扰;对蛋白质类药物要防止其高级结构的破坏,应避免高热、强烈搅拌、大量泡沫、强酸、强碱及重金属离子等不利因素对其空间构象的影响;多肽类及核酸类药物需注意避免酶的降解作用,并添加某些酶抑制剂;对脂类药物应特别注意防止氧化,减少与空气接触等措施,如添加抗氧剂、通氮气及避光等。提取过程,应在低温、无菌条件下进行。 .水是提取生化物质的常用溶剂。水是高度极化的极性分子,具有很高的介电常数。在水溶液中,水分子自身形成氢键的趋势很强,有极高的分子内聚力(缔合力)。水分子的存在可使其他生物分子间(包括同种分子与异种分子)的氢键减弱,而与水分子形成氢键,水分子还能使溶质分子的离子键解离,这就是所谓“水合作用”。水合作用促使蛋白质、核酸、多糖等生物大分子与水形成了水合分子或水合离子;从而促使它们溶解于水或水溶液中。.(二)活性物质的保护措施 在提取过程中,保持目的物的生物活性十分重要,对于一些生物大分子,如蛋白质、酶及核酸类药物常采用下列保护措施。(1)采用缓冲系统 提取溶剂采用缓冲系统,防止提取过程中某些酸碱基团的解离导致溶液pH值的大幅度变化,使某些活性物质变性失活,或因pH值变化影响提取效果。在生化药物制备中,常用的缓冲系统有磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、tris缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液等,所使用的缓冲液浓度较低,以利于增加溶质的溶解性能。.(2)添加保护剂 为防止某些生理活性物质活性基团及酶活性中心受破坏(如巯基是许多活性蛋白质和酶的催化活性基团,极易被氧化),故提取时常添加某些还原剂(如半胱氨酸,巯基乙醇,二巯基赤藓糖醇,还原型谷胱甘肽等)。提取某些酶时常加入适量底物以保护活性中心。对易受重金属离子抑制的活性物质,可在提取时添加某些金属螯合剂,以保护活性物质的稳定性。.(3)抑制水解酶的作用 抑制水解酶活力是提取操作中的最重要的保护性措施之一。可根据不同水解酶的性质采用不同方法:需要金属离子激活的水解酶(如DNAse)常加入EDTA或用柠檬酸缓冲液,以降低或除去金属离子使酶活力受到抑制;对热不稳定的水解酶,可选择热变性提取法,使酶失活;根据酶的溶解性质的不同,还可用pH值不同的缓冲体系提取,以减少酶的释放或根据酶的最适pH值,选用酶发挥活力最低的pH值进行提取。. 最有效的办法是在提取时,添加酶抑制剂,以抑制水解酶的活力。如提取RNA时添加核糖核酸酶抑制剂,常用的有十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、萘-1,5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠、4-氨基水杨酸钠以及皂土、肝素、DEP(二乙基焦碳酸盐)、蛋白酶K等。.(4)其他保护措施 为了保持某些生物大分子的活性,也要注意避免紫外线、强烈搅拌、过酸、过碱或高温、高频震荡等。有些活性物质还应防止氧化,如固氮酶、铜铁蛋白提取分离时要求在无氧条件下进行;有些活性蛋白对冷、热变化也十分敏感,如免疫球蛋白就不宜在低温冻结。所以提取时要根据目的物的不同性质,具体对待。.(三)影响提取的因素1温度 多数物质的溶解度随提取温度的升高而增加,另外较高的温度可以降低物料的黏度,有利于分子扩散和机械搅拌。所以对一些植物成分、某些较耐热的生化成分(如多糖类),可以用浸煮法提取,加热温度一般为5090C。但对大多数不耐热生物活性物质不宜采用浸煮法,一般在010C进行提取。对一些热稳定性较好的成分,如胰弹性蛋白酶可在2025提取。有些生化物质在提取时,需要酶解激活,如胃蛋白酶的提取,温度可以控制在30一40。应用有机溶剂提取生化成分时,一般在较低的温度下进行提取,一方面是为了减少溶剂挥发损失和生产安全,另一方面也是为了减少活力损失。.2酸碱度 多数生化物质在中性条件下较稳定,所以提取用的溶剂系统原则上应避免过酸或过碱,pH值一般应控制在49范围内。为了增加目的物的溶解度,往往要避免在目的物的等电点附近进行提取。有些生化物质在酸性环境中较稳定,且稀酸又有破坏细胞的作用,所以有些酶(如胰蛋白酶、弹性蛋白酶及胰岛素等)都在偏酸性介质中进行提取。多糖类物质因在碱性环境中更稳定,故多用碱性溶剂系统提取多糖类药物。巧妙地选择溶剂系统的pH值不但可直接影响目的物与杂质的溶解度,还可以抑制有害酶类的水解破坏作用,防止降解,提高收得率。对于小分子脂溶性物质而言,调节适当的溶剂pH值还可使其转入有机相中,便于与水溶性杂质分离。.3盐浓度 盐离子的存在能减弱生物分子间离子键及氢键的作用力。稀盐溶液对蛋白质等生物大分子有助溶作用。一些不溶于纯水的球蛋白在稀盐中能增加溶解度,这是由于盐离子作用于生物大分子表面,增加了表面电荷,使之极性增加,水合作用增强,促使其形成稳定的双电层,此现象称“盐溶”作用。多种盐溶液的盐溶能力既与其浓度有关,也与其离子强度有关,一般高价酸盐的盐溶作用比单价酸盐的盐溶作用强。常用的稀盐提取液有:氯化钠溶液(01015molL);磷酸盐缓冲液(002005molL);焦磷酸钠缓冲液(002005molL);醋酸盐缓冲液(010015molL);柠檬酸缓冲液(002005molL)。其中焦磷酸盐的缓冲范围较大,对氢键和离子键有较强的解离作用,还能结合二价离子,对某些生化物质有保护作用。柠檬酸缓冲液常在酸性条件下使用,作用效果近似焦磷酸盐。.(四)常用的提取方法1.用酸、碱、盐水溶液提取用酸、碱、盐水溶液可以提取各种水溶性、盐溶液的生化物质。这类溶剂提供了一定的离子强度、pH值及相当的缓冲能力。如胰蛋白酶用稀硫酸提取;肝素用pH9的3氯化钠溶液提取。对某些与细胞结构结合牢固的生物大分子,在提取时采用高浓度盐溶液(如4molL盐酸胍,8molL脲或其他变性剂),这种方法称“盐解”。.2用表面活性剂提取 表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团,分布于水油界面时有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂又称“去垢剂”。可分为阴离子型、阳离子型、中性与非离子型去垢剂。离子型表面活性剂作用强,但易引起蛋白质等生物大分子的变性,非离子型表面活性剂变性作用小,适合于用水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取。某些阴离子去垢剂如十二烷基磺酸钠(SDS)等可以破坏核酸与蛋白质的离子键合,对核酸酶又有一定抑制作用,因此常用于核酸的提取。使用去垢剂时应注意它的亲油、亲水性能的强弱。.3有机溶剂提取用有机溶剂提取生化物质可分为固液提取和液液提取(萃取)两类。(1)固液提取 常用于水不溶性的脂类、脂蛋白、膜蛋白结合酶等。例如用丙酮从动物脑中提取胆固醇,用醇醚混合物提取辅酶Q10,用氯仿提取胆红素等。有机溶剂在提取目的物时,可以用单一溶剂提取法,也可用多种溶剂组合提取。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等极性溶剂以及乙醚、氯仿、苯等非极性溶剂。极性溶剂既有亲水基团又有疏水基团,从广义上说,也是一种表面活性剂。乙醚、氯仿、苯是脂质类化合物的良好溶剂。.在选用有机溶剂时一般采用“相似相溶”的原则。如丁醇在水中有一定溶解度,对细胞膜上磷脂蛋白的溶解能力强,能迅速透人酶的脂质复合物中。所以对那些与细胞颗粒结构如线粒体等结合的酶,或与脂类物质紧密结合的活性物质,采用丁醇为溶剂,效果较好。丁醇也能用于干燥生物材料的脱脂,但它在水溶液中解离脂蛋白的能力更强。.(2)液液萃取 液液萃取是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异,将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。影响液液萃取的因素主要有目的物在两相的分配系数(K)和有机溶剂的用量等。分配系数K值增大,提取效率也增大,萃取就易于进行完全。当物质的K值较小时,可以适当增加有机溶剂用量来提高萃取率。但有机溶剂用量增加会增加后处理的工作量,因此在实际工作中,常常采取分次加入溶剂,连续多次提取来提高萃取率。.四、生物活性物质的浓缩与干燥(一)生物活性物质的浓缩(1)盐析浓缩(2)有机溶剂沉淀浓缩(3)用葡聚糖凝胶(Sephadex)浓缩(4)用聚乙二醇浓缩(5)超滤浓缩(6)真空减压浓缩与薄膜浓缩. 大型薄膜蒸发器示意.(二)干燥干燥是使物质从固体或半固体状经除去存在的水分或其他溶剂,从而获得干燥物品的过程在生化制药工艺中干燥目的在于:提高药物或药剂的稳定性,以利保存与运输;使药物或药剂有一定的规格标准;便于进一步处理。水在干燥的物料中,有三种存在形式:即表面水、毛细管中的水与细胞内的水。表面水很容易通过汽化除去。毛细管中的水, 由于毛细管壁的作用,较难除去。细胞内的水由于被细胞膜包围封闭,如不扩散到膜外则不容易蒸发除去。水分在固体物料中的存在情况可能是单一的,也可能是多样的,因此,干燥应缓慢进行,使各种形成存在水能被逐步去除。干燥速度在温度及压力不变的条件下取决于液体到达表面的速度。物质在空气中的干燥度,常称为物质的平衡湿度,在一定条件下是一个定值。因此,除非改变大气的温度、湿度或压力,否则即使无限地延长干燥的时间也不能改变物质干燥度.五、 生化物质的分离纯化(一)生物制药中分离纯化的特点在生化分离技术中包括生化分离分析和生化制备。前者主要对生物体内各组分分离后进行定性、定量分析,它不一定要把某组分从混合物中分离提取出来。而后者则主要是为了获得生物体内某一单纯组分.生物材料组成非常复杂,一种生物材料常含成千上万种成分,各种化合物在形状、相对分子质量和理化性质等方面都各不相同,且又相似,其中有不少化合物迄今还是未知物,而且生物活性物质在分离过程中仍处于不断代谢变化中,因此常无固定操作方法可循。有些化合物在生物材料中含量极微,只有万分之一、十万分之一,甚至百万分之一。因此分离操作步骤多,不易获得高收率。生物活性成分离开生物体后,易变性、失活,分离过程必须十分小心地保护这些化合物的生理活性,这也是生物制药中分离、制备的难点。.生物制药中的分离方法几乎都在溶液中进行,各种参数(温度、pH值、离子强度等)对溶液中各种组分的综合影响无固定性,以致许多实验设计理论性不强,实验结果常常带有很大经验成分。因此,实验要有一定的重现性,必须从材料、方法、条件及试剂药品等严格地加以规定。为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性,生物制药中的分离方法多采用温和的“多阶式”方法进行,即常说的“逐级分离”方法。为了纯化一种生化物质常常要联用几个甚至十几个步骤,并不断变换各种不同类型的分离方法,才能达到目的。因而操作时间长,工艺复杂,效率不高。近年发展起来的亲和层析法具有从复杂生物组成中专一“钓出”特异生化成分的特点,目前已在生物大分子,如酶、蛋白、抗体和核酸等的纯化中得到广泛应用。.(二)分离纯化的基本原理根据分子形状和大小不同进行分离。如差迷离心与超速离心、膜分离(透析,电渗析)与超滤法、凝胶过滤法等。根据分子荷电性质(带电性)差异进行分离。如离子交换法、电泳法、等电聚焦法等。根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。 根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附与吸附层析法。根据生物分子与其配体的特异亲和性进行分离。如亲和层析法、亲和沉淀法。.(三)分离纯化的基本程序和实验设计确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法;通过文献了解制备物的理化性质,进行稳定性的预备试验;材料处理及抽提方法的选择;分离纯化方法的摸索;产物的均一性测定。.1.分离纯化早期使用方法的选择在分离纯化的早期,由于提取液中的成分复杂,目的物浓度较稀,与目的物理化性质相似的杂质多,所以不宜选择分辨能力较高的纯化方法。因为在杂质大量存在情况下,被分离的目的物难于集中在一个区域,所以分离纯化的早期常用萃取、沉淀、吸附等一些分辨力低、负荷能力大的方法较为有利。这些方法多兼有分离、提纯和浓缩作用,为进一步分离纯化创造良好的基础。总之,早期分离方法的选择原则是低分辨能力、大负荷量者为合适。但随着许多新技术的建立,一种特异性方法的分辨力愈高,便意味着提纯步骤愈简化、收率愈高、生化物质的变性危险愈少,因此亲和层析法、纤维素离子交换色谱法、连续流动电泳、连续流动等电聚焦等在一定条件下,也可用于从粗提取液中分离制备小量目的物。. 2各种分离纯化方法的使用程序 生化物质的分离都是在液相中进行,分离方法主要根据物质的分配系数、相对分子质量大小、离子电荷性质及数量和外加环境条件的差别等因素为基础,而每一种方法又都在特定条件下发挥作用。因此,不适宜在相同或相似条件下连续使用同一种分离方法。例如纯化某一两性物质时,前一步已利用该物质的阴离子性质,使用了阴离子交换色谱法,下一步提纯时再用阳离子性质作色谱层析或电泳分离便会取得较好分离效果。各种分离方法的交叉使用对于除去大量理化性质相近的杂质是较为有效的。如某些杂质在各种条件下带电荷性质可能与目的物相似,但其分子形状、大小与目的物相差较大,而另一些杂质的分子形状与大小可能与目的物相似,但在某条件下与目的物的电荷性质又不同。.3分离后期的保护性措施在分离操作的后期必须注意避免产品的损失,主要损失途径是器皿的吸附、操作过程样品液体中的残留、空气的氧化和不可预知的因素。为了取得足够量的样品,常常需要加大原材料的用量,并在后期纯化工序中注意保持样品溶液有较高的浓度,以防止制备物在稀溶液中的变性,有时常加入一些电解质以保护生化物质的活性,减少样品溶液在器皿中的残留量。.(四)分离纯化工艺优劣的综合评价 每一个分离纯化步骤的好坏,除了从分辨能力和重现性两方面考虑外,还要注意方法本身的回收率,特别是制备某些含量很少的物质时,回收率的高低十分重要。但不同物质的稳定性不同,分离难易不同,回收率也不同。对每一步骤方法的优劣的记录,体现在所得产品质量及活性关系上。这一关系,可通过每一步骤的分析鉴定求出。.例如酶的分离纯化,可通过测定每一步骤产物质量与活性关系。其他活性物质也可通过测定总活性的变化与样品质量或体积的变化,列表进行对比分析,算出每步的提纯倍数及回收率。在这种情况下,先用分子筛,离心或膜过滤法除去相对分子质量相差较大的杂质,然后在一定pH值和离子强度范围下,使目的物变成合适的离子状态,便能有效地进行色谱分离。当然,这两种步骤的先后顺序反过来应用也会得到同样效果。.在安排纯化方法顺序时,还应考虑有利于减少工序,提高效率,如在盐析后采取吸附法,必然会因离子过多而影响吸附效果,如增加透析除盐,则使操作大大复杂化。如倒过来进行,先吸附,后盐析,就比较合理。对于未知物通过各种方法的交叉应用,有助于进一步了解目的物的性质。不论是已知物或未知物,当条件改变时,连续使用一种分离方法是允许的,如分级盐析和分级有机溶剂沉淀等.
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