植物组织培养实验室及操作技术植物组织培养实验室及操作技术第一节第一节实验室设置及基本技术实验室设置及基本技术第二节第二节组织培养所需的环境条件及营养成分组织培养所需的环境条件及营养成分第三节第三节培养基的配制与灭菌培养基的配制与灭菌第一节 实验室设置及基本技术一、实验室组成二、基本设备三、培养器皿及实验用具四、洗涤技术五、灭菌技术六、无菌操作 组织培养实验室布局的总体要求 便于隔离 便于操作 便于灭菌 便于观察一一、实验室组成基本实验室辅助实验室实验室组成准备室缓冲室无菌操作室培养室细胞生物学实验室温 室生化分析实验室基本实验室布局平面图实验台搁架培养架培养架培养架培养架药品及仪器柜无菌台无菌台搁架拉窗冰箱搁架水槽电炉门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室准备室缓冲室缓冲室无菌室无菌室培养室培养室组织培养准备实验室缓冲室培养室无菌室（一）无菌室（二）二、仪器与设备1、基本设备 冰箱、电炉、酸度计、纯水器、天平、培养基分装器、搅拌器等。冰箱酸度计电炉天平纯水器培养基分装器搅拌器2、灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。蒸汽压力灭菌锅干热消毒柜无菌瓶顶过滤装置喷雾消毒器（参考图）（参考图）3、无菌操作设备 超净工作台无菌接种箱4、细胞培养设备 摇床培养架HZC-250恒温振荡培养箱150C250D光照培养箱5、细胞学鉴定设备 光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜倒置显微镜光学显微镜1、玻璃器皿三、培养器皿及实验用具培养皿三角瓶培养瓶2、金属材质用具镊子 解剖刀接种针四、洗涤技术1、玻璃器皿洗涤、玻璃器皿洗涤新购置玻新购置玻璃器皿璃器皿1%稀HCl浸渍浸渍12h洗衣粉洗衣粉洗涤洗涤清水清水冲洗冲洗晾干晾干备用备用已用过的已用过的玻璃器皿玻璃器皿2、塑料用品洗涤、塑料用品洗涤新的塑料器皿打开即用新的塑料器皿打开即用已用过的已用过的塑料器皿塑料器皿2%NaOH浸泡浸泡12h清水清水冲洗冲洗2%5%盐盐酸浸泡酸浸泡30min清水清水冲洗冲洗蒸馏水蒸馏水冲洗冲洗晾干备用晾干备用3、金属用品洗涤、金属用品洗涤热洗衣粉水热洗衣粉水洗净洗净冲洗冲洗擦干擦干配方成分弱液次强液强液常用配方重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）501001000100200100060800200100200800清洁液配方五、灭菌技术物理方法： 物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等化学方法： 消毒剂、抗菌素灭菌1、灭菌方法、灭菌方法2、灭菌、灭菌（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法 压力在9.810410.8104Pa 温度在121 灭菌2030min（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌 干热消毒灭菌饱和蒸汽压力与其对应的温度饱和蒸汽压力温度（）饱和蒸汽压力温度（）kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.6（3）塑料器皿灭菌： 多采用高压蒸汽消毒灭菌（4）金属用具灭菌：灼烧灭菌 浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用（5）接种室灭菌空气消毒灭菌接种室接种室超净工超净工作台作台紫外灯照射70%75%的酒精擦洗培养材料的接种紫外灯照射（6）外植体灭菌流水冲洗流水冲洗1020min或更长时间或更长时间70%75%酒精中浸泡酒精中浸泡30s0.1%0.2%氯化汞氯化汞液中浸泡液中浸泡10min左右左右蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗45次次在在10%的次氯酸钠、的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡饱和漂白粉浸泡30min左右左右备用备用常用消毒剂消毒灭菌比较表消毒剂使用浓度（%）去除难易消毒时间（min）效果次氯酸钙次氯酸钠漂白粉溴水过氧化氢升汞酒精抗生素硝酸银9102饱和溶液1210120.11707545（mg/L1易易易易最易较难易中较难5305305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好较好好六、无菌操作实验员消毒实验室、无菌台灭菌实验器材的灭菌无菌接种消毒实验台卫生培养室培养1、消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接种室。2、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射40min左右，后关闭。3、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。4、用70%75%的酒精擦拭工作台和双手。5、用沾有70%75%酒精的纱布擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。8、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。9、取下接种器械，在火焰上消毒。10、把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口。11、接种结束后，清理和关闭超净工作台。注意：操作期间应经常用70%75%的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。第二节第二节植物组织培养所需的环境植物组织培养所需的环境条件及营养成分条件及营养成分一一、所需环境条件 与自然条件一样，组织培养中的材料的生长要受到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养基的组成、pH值和渗透压等各种化学条件，以及外植体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一个重要问题。温度光照湿度气体培养基的渗透压pH值植物材料一般最适温度在252之间环境条件最常用的光周期是光照16h，黑暗8h 一般情况下，培养器内相对湿度应达100%，培养室内环境的相对湿度在70%80% 氧气是愈伤组织生长所必需的 调节渗透压常常从糖入手 植物组织培养时培养基的pH值大多在5.06.5二、营养成分 植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳 定、电荷平衡等点化学方面的作用；d、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、 器官建成。Arnon和和Stout（1939）提出的确定植物必需营养元）提出的确定植物必需营养元素的素的3个标准个标准A、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史B、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充改元素来预防和恢复C、改元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的改进而产生的间接效果。国内外公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种： C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni） 在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。根据植物体内含量多少，可把这些元素分为大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上； C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9种微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下 有的只含0.1mg/kg Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种按照国际植物生理协会的建议： 所需浓度 0.5mmol/L的元素为大量元素 所需浓度 0.5mmol/L的元素为微量元素1、大量元素N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。 P是磷脂的主要成分。培养基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。 K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。2、微量元素 在微量元素中，铁的使用最大 ： 一些氧化酶的组成成分 叶绿素形成的必要条件 使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）鳌合物防止铁的沉淀硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长锰参与植物的光合、呼吸代谢钼参与氮素的代谢氯是光合作用水光解的活化剂微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。桃桃树树缺铜症状：缺铜症状：新梢顶端叶片的叶尖失绿新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至变黄，叶片出现褐色斑点至扩大变成深褐色，引起落叶。扩大变成深褐色，引起落叶。枝顶端生长不良，其下部枝顶端生长不良，其下部的芽开始生长，形成丛生的的芽开始生长，形成丛生的细枝。细枝。菊花菊花缺锰典型症状：缺锰典型症状：叶脉间失绿褪色，但叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间叶脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。由幼叶开始。菜豆菜豆缺钼典型症状：缺钼典型症状：叶较小，叶脉间失绿叶较小，叶脉间失绿,有坏有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。内卷曲。十字花科植物缺钼时叶片卷十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。曲畸形，老叶变厚且枯焦。白菜白菜缺硼典型症状：缺硼典型症状：受精不良受精不良,籽粒减少籽粒减少，“花而不实花而不实”，“蕾而不花蕾而不花”；根尖、茎尖的生长点停止根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状；生长，而形成簇生状；常引起各种腐烂病。常引起各种腐烂病。马铃薯马铃薯3、碳源 碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最重要。 糖类物质特点： 具有热易变的性质利于吸收和利用 使用浓度一般在2%5% 提供能源和调节渗透压4、维生素类 以各种辅酶的形式存在 参与多种代谢活动 对生长，分化等有很好的促进作用 主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素 常用维生素有VB1和VB6 5、肌醇 环己六醇 细胞壁的构建材料 参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动 促进活性物质发挥作用6、氨基酸 蛋白质的组成成分 有机氮源 可直接被细胞吸收利用 培养基中常用的是甘氨酸7、天然复合物 促进某些愈伤组织和器官的生长 化学成分不明、复杂 天然营养混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物8、琼脂 是使用最普遍的凝固剂用量一般在610g/L之间颜色以浅、透明度高好，洁净为上品 除了琼脂外，在组织培养中还可以使用琼脂糖、结冷胶等。9、活性炭 吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质 抑制外植体褐变 防止玻璃苗的产生 促进培养物生长和分化 促进生根缺点： 没有选择性10、抗生素 防止外植体内生菌造成的污染活性炭活性炭11、生长素类 促进细胞伸长和分裂 促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实 诱导愈伤组织形成 溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好 常用的生长素： IAA(吲哆乙酸) NAA (奈乙酸 ) 2,4-D(二氯苯氧乙酸) IBA(吲哆丁酸)12、细胞分裂素类 促进细胞分裂和分化 诱导胚状体和不定芽的形成 延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成 用于离体成花的调控 溶于0.51.0mol/L的盐酸或稀薄的NaOH中 常用的细胞分裂素： KT (激动素) BA(6-卞基腺嘌呤) 2-ip(异戊烯氨基嘌呤)玉米素13、赤霉素类和脱落酸 A、赤霉素类 组织培养中不常使用 加速细胞的伸长生长 促进细胞的分裂 主要是GA3 B、脱落酸 抑制细胞分裂和伸长 促进脱落和衰老 促进休眠和提高抗逆能力培养基形态不同：固体培养基、液体培养基培养过程不同：初代培养基、继代培养基其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基 营养水平不同：基本培养基、完全培养基一一、培养基的种类第三节第三节培养基的配制、灭菌与保存培养基的配制、灭菌与保存1、MS培养基 无机盐浓度高高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐含有一定数量的铵盐营养丰富不需要添加更多的有机附加物二、几种常见培养基的特点2、White培养基1943年由White为培养番茄根尖而设计 1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素 无机盐浓度较低 使用广泛 在生根培养、胚胎培养中有良好的效果大量元素大量元素含量含量微量元素微量元素含含量量铁盐含量含量有机物有机物含含量量其他其他含量含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇肌醇100蔗糖蔗糖30000Ca(NO3)24H2O300MnSO44H2O7.0烟酸烟酸0.3琼脂脂8000MgSO47H2O720ZnSO47H2O3.0盐酸硫胺酸硫胺素素0.1NaH2PO44H2O16.5MoO30.0001盐酸吡哆酸吡哆辛辛0.1KCl65CuSO45H2O0.001甘氨酸甘氨酸3Na2SO4200附表：White培养基3、B5培养基 1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计 含有较低的铵盐 较高的硝酸盐和盐酸硫胺素组成成分数量(mg/l）组成成分数量(mg/l)KNO32500FeSO47H2O27.8CaCl22H2O150CuSO45H2O0.025MgSO47H2O250蔗糖40(NH4)2SO4134pH5.5KI0.75肌醇100H3BO43.0烟酸1.0MnSO44H2O10盐酸吡哆醇1.0ZnSO47H2O2.0激动素0.1Na2MoO42H2O0.252,4D0.11.0CoCl26H2O0.025盐酸硫铵10Na2-EDTA37.3B5培养基的组成和配方4、N6培养基1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计 KNO3和（NH4）SO4含量高，不含钼组成成分数量(mg/l)组成成分(mg/l)KNO32.3Na2EDTA37.3CaCl22H2O166FeSO47H2O27.8MgSO47H2O185蔗糖50KH2PO4400pH5.8(NH4)2SO4463烟酸0.5KI0.8盐酸吡哆醇0.5H3BO31.6甘氨酸2.0MnSO44H2O4.4盐酸硫铵1.0ZnSO47H2O1.5N6培养基组成及配方配制培养基应做好几点工作：1、实验用具的准备。包括配制过程中所需电炉、酸度计、高压灭菌锅等设备及其他玻璃器皿的清洗和准备2、试剂、药品的准备3、根据培养基的配方、母液扩大倍数及需要配制的培养基体积计算所需各种母液及其他附加物的量三、培养基的配制具体操作如下：1、取规定数量的糖源和凝固剂置于烧杯或搪瓷锅内，加蒸馏水加热使之溶解，并不断搅拌；2、根据计算所需量依次加入大量元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调节物质母液及其他特殊的附加物，搅拌均匀；3、加水定容至规定体积，搅拌均匀；4、调整培养基的pH值；5、分装；6、封口。 组织培养必须在无菌环境中进行，因此培养基的灭菌操作非常重要。 培养基分装封口后立刻进行灭菌，至少在24h内完成灭菌程序。 一般采用的是高压蒸汽灭菌。四、培养基的灭菌 灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：1、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；2、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空 间，利于蒸汽流动；3、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响 灭菌效果；4、灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间；5、排气降压时应缓慢进行；6、只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅；7、高压锅工作时，应有专人看守。 灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用检验灭菌效果。 检验方法： 将培养基置于培养室中3天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。 保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避光处理。 保存时间不可过长。五、培养基的保存