课题结题报告结题报告结题报告肾早期损伤定位标志物研究肾早期损伤定位标志物研究 重庆三峡中心医院重庆三峡中心医院 杜红心杜红心 立立 项项 依依 据据 研研 究究 内内 容容 研研 究究 结结 果果 项项目目完完成成情情况况 预预 实实 验验 结结 果果 经经 费费 来来 源源一一、立立 项项 依依 据据 研究背景研究背景妊娠期糖代谢异常：包括妊娠期糖耐量受损妊娠期糖代谢异常：包括妊娠期糖耐量受损（GIGT）和妊娠期糖尿病和妊娠期糖尿病（GDM）。GIGT：一组已有糖代谢异常并可能向糖尿病：一组已有糖代谢异常并可能向糖尿病发展的病理生理过程的中间阶段。发展的病理生理过程的中间阶段。GDM：妊娠期首次发生或发现的不同程度的：妊娠期首次发生或发现的不同程度的糖代谢异常。糖代谢异常。 近年的研究表明近年的研究表明, GDM 与与GIGT 的总体发病率的总体发病率逐年升高逐年升高,达达7.61 %。追踪研究显示。追踪研究显示30 % -50%的的GDM患者可在远期发生糖尿病，且有糖尿病家族史患者可在远期发生糖尿病，且有糖尿病家族史者，者，GDM患病机率增加，提示其有一定的免疫遗传患病机率增加，提示其有一定的免疫遗传学背景学背景 。研究背景研究背景 妊妊娠娠期期糖糖代代谢谢异异常常对对妊妊娠娠的的影影响响最最常常见见的的是是导导致致巨巨大大儿儿、胎胎儿儿窘窘迫迫和和新新生生儿儿低低血血糖糖的的发发生生；以以及及并并发发血血管管病病变变，增增加加妊妊娠娠期期高高血血压压和和手手术术产产的的发发生生率率。国国内内外外的的数数据据表表明明：未未治治疗疗的的GDM孕孕妇妇并并发发症症明明显显增增加加，且且围围生生儿儿患患病病率率主主要要与与治治疗疗早早晚晚有有关关，证证明明早早期期筛筛查查、诊诊断断、干干预预可可以以降降低低孕产妇的并发症及围生儿患病率。孕产妇的并发症及围生儿患病率。研究背景研究背景 妊妊娠娠期期糖糖代代谢谢异异常常的的发发生生与与遗遗传传、环环境境及及生生活活习习惯惯密密切切相相关关, 近近年年来来国国内内外外的的研研究究表表明明, 某某些些基基因因的的多多态态性性对对妊妊娠娠期期糖糖代代谢谢异异常常的的发发生生可可能能具具有有重重要要作作用用。如如：葡葡萄萄糖糖转转运运蛋蛋白白基基因因、葡葡萄萄糖糖激激酶酶基基因因、磺磺脲脲类类药药物物受受体体基基因因、胰胰岛岛素素受受体体底底物物基基因因、人人类类主主要要组组织织相相容容性性基基因因复复合合体体以以及及钙钙蛋蛋白白酶酶-10基基因因、尾尾加加压压素素基基因因、肿肿瘤瘤坏坏死死因因子子-基基因因等等均均与与妊妊娠娠期期糖糖代代谢谢异异常常发发病病有有一一定定关联。关联。立项依据立项依据 但但是是目目前前已已有有的的研研究究成成果果还还存存在在争争议议, 引引起起疾疾病病的责任基因及其作用机理的责任基因及其作用机理尚未明确尚未明确。因此对致病基。因此对致病基因的研究已日益成为临床诊疗的迫切需要。探究及因的研究已日益成为临床诊疗的迫切需要。探究及筛选与妊娠期糖代谢异常相关的基因多态性筛选与妊娠期糖代谢异常相关的基因多态性, 将会对将会对妊娠合并糖尿病、妊娠合并糖尿病、GDM及及GIGT的预防、治疗、改的预防、治疗、改善预后及提高广大妊娠妇女围产期的生命质量起到善预后及提高广大妊娠妇女围产期的生命质量起到十分积极而重要的作用。同时十分积极而重要的作用。同时, 对节约医疗资源、提对节约医疗资源、提高出生人口质量也将有十分重要的意义。高出生人口质量也将有十分重要的意义。立项依据立项依据二二 、 研研 究究 内内 容容 对对葡萄糖转运蛋白葡萄糖转运蛋白基因、基因、磺脲类药物受体磺脲类药物受体基因、基因、人类主要组织相容性复合体人类主要组织相容性复合体基因、基因、钙蛋白酶钙蛋白酶-10-10基基因、因、尾加压素尾加压素基因等五个可能的糖代谢异常相基因等五个可能的糖代谢异常相关基因及其相关位点的关基因及其相关位点的多态性多态性进行研究，以明晰进行研究，以明晰它们与妊娠期糖代谢异常的发生发展的关系。观它们与妊娠期糖代谢异常的发生发展的关系。观察可能与察可能与GIGT、GDM及及T2DM的发生有关的的发生有关的危险危险因素因素。研究内容研究内容关键技术或方法关键技术或方法1采用酚采用酚- -氯仿法提取基因组氯仿法提取基因组DNA23PCR技术扩增目的基因片段技术扩增目的基因片段PCR-RFLP方法检测基因型方法检测基因型4logistic回归进行数据分析回归进行数据分析研究对象研究对象研究对象研究对象NGT组组GIGT组组GDM组组T2DM组组100例例,贵阳医学院附贵阳医学院附属医院内分泌科属医院内分泌科100例例, 贵阳市妇幼保贵阳市妇幼保健院门诊健康体检者健院门诊健康体检者 各各100例例, 贵阳市妇幼贵阳市妇幼保保健院门诊患者健院门诊患者实验方法实验方法1. GDM及及GIGT的诊断方法（的诊断方法（NDDG标准）标准） 1、50g葡萄糖负荷试验筛查葡萄糖负荷试验筛查, 7.8mmol/L为阳性者做为阳性者做糖耐量试验糖耐量试验(OGTT) 。 2、OGTT试验：抽血前禁食试验：抽血前禁食812h, 75g葡萄糖溶葡萄糖溶300ml水中水中35min服完服完, 查空腹及服糖后查空腹及服糖后1、2、3 h血糖。两次血糖。两次5.8、10.6、9.2、8.1mmol/L者诊断为者诊断为GDM；两次空腹；两次空腹血糖血糖5.8或糖筛或糖筛10.6mmol/L, 空腹血空腹血5.8mmol/L即诊断即诊断为为GDM。 OGTT 4项中任何一项异常或第项中任何一项异常或第2小时小时6.7mmol/L诊断为诊断为GIGT。诊断标准诊断标准2. T2DM的诊断标准（的诊断标准（1999年年WHO标准）标准） 糖尿病症状糖尿病症状+任意时间血浆葡萄糖水平任意时间血浆葡萄糖水平11.1 mmol/L或或 空腹血浆葡萄糖空腹血浆葡萄糖(FPG)水平水平7.0mmol/L或或 OGTT试验中，试验中，2h-PG水平水平11.1 mmol/L 诊断标准诊断标准全血全血DNA的提取的提取PCR-RFLP、PCR-AFLP凝胶电泳分离凝胶电泳分离收集标本收集标本PCR扩增目的片段扩增目的片段基因型的判定基因型的判定数据处理数据处理实验步骤实验步骤计数资料：计数资料：计数资料：计数资料：基因频率及基因型频率：基因频率及基因型频率：基因频率及基因型频率：基因频率及基因型频率：计量资料：计量资料：计量资料：计量资料：危险因素采用危险因素采用危险因素采用危险因素采用logisticlogisticlogisticlogistic回归分析回归分析回归分析回归分析 百分数描述百分数描述 （ XSXS）描述，）描述，采用采用t t检验检验 Hardy-Weinberg平衡检平衡检验；卡方检验，验；卡方检验，P P0.050.05统计学统计学统计学统计学处理处理处理处理数据分析及处理：数据分析及处理：三三 、 研研 究究 结结 果果实验数据及图表：实验数据及图表：12型型:404,372bp11型型:372bp22型型:404bpCAPN-10 19位点多态性分析位点多态性分析：CAPN-10 43位点多态性分析位点多态性分析：GG型型:144bpAA型型:121,23bpGA型型:144,121,23bpCAPN-10 63位点多态性分析位点多态性分析：CT型型:192,162,30bpTT型型:192bpCC型型:162,30bp相关危险因素分析相关危险因素分析：单因素单因素logistic回归分析结果回归分析结果相关危险因素分析相关危险因素分析：多因素多因素logistic回归分析结果回归分析结果（GIGT组、组、GDM组与组与NGT组）组）相关危险因素分析相关危险因素分析：多因素多因素logistic回归分析结果回归分析结果（T2DM组与组与NGT组）组）项目完成情况：项目完成情况：主要考核指标完成情况主要考核指标完成情况 ：对对7 7个可能相关的基因及其相关位点的多态性与妊个可能相关的基因及其相关位点的多态性与妊娠期糖代谢异常的关系进行研究，明晰了它们与娠期糖代谢异常的关系进行研究，明晰了它们与妊娠期糖代谢异常相关疾病的发生和发展之间的妊娠期糖代谢异常相关疾病的发生和发展之间的关系；关系； 根据实验室数据及统计结果，我们可以得出以下根据实验室数据及统计结果，我们可以得出以下结论：可能与妊娠期糖代谢异常发病相关目的基结论：可能与妊娠期糖代谢异常发病相关目的基因及其位点因及其位点7 7个，它们具体是：个，它们具体是： 技术指标方面技术指标方面:CAPN-10基因多态性可能与基因多态性可能与GDM、T2DM遗传易感性有关；遗传易感性有关；CAPN-10基因基因SNP43位点位点G等位基因可能与等位基因可能与GDM的发生有关，而的发生有关，而16和和63位点则与位点则与GDM的发生无关。的发生无关。CAPN-10基因基因SNP43位点位点G等位基因可能与等位基因可能与T2DM的发生有关，而的发生有关，而16和和63位点则与位点则与T2DM的发生无关。的发生无关。CAPN-10基因基因SNP43位点多态性、糖尿病位点多态性、糖尿病家族史、家族史、BMI和年龄是和年龄是GDM 、T2DM发生的发生的重要危险因素。重要危险因素。技术指标方面：技术指标方面：尾加压素尾加压素基因基因rs228648 rs228648 位点单核苷酸多态性可位点单核苷酸多态性可能在决定受研究人群的妊娠期糖尿病遗传易感性能在决定受研究人群的妊娠期糖尿病遗传易感性中起重要作用。中起重要作用。G等位基因可能与等位基因可能与GDM发生有关发生有关, ,而而rs228648rs228648位点的位点的A A型纯合子可能是型纯合子可能是GDM的一个的一个重要的保护因素。重要的保护因素。尾加压素尾加压素基因基因rs228648 rs228648 位点单核苷酸多态性可位点单核苷酸多态性可能在决定妊娠期糖尿病遗传易感性中起重要作用。能在决定妊娠期糖尿病遗传易感性中起重要作用。G等位基因可能与妊娠期糖代谢异常发生有关，等位基因可能与妊娠期糖代谢异常发生有关，rs228648rs228648的基因型频率与糖尿病家族史有关联。的基因型频率与糖尿病家族史有关联。技术指标方面：技术指标方面：GLUT1基因基因型频率和等位基因频率在基因基因型频率和等位基因频率在GDM、GIGT和和T2DM中分布差异均无统计学意义。提中分布差异均无统计学意义。提示示GLUT1基因可能与基因可能与GDM、GIGT遗传易感性遗传易感性无关。无关。TNF-基因的基因的-308 G/A、TNF-基因的基因的+252 A/G单核苷酸多态性研究显示：单核苷酸多态性研究显示：GDM患者存在患者存在TNF-启动子启动子-308G-A等位基因的突变，可能是等位基因的突变，可能是通过上调血浆通过上调血浆TNF-水平，增加胰岛素抵抗，最水平，增加胰岛素抵抗，最终导致终导致GDM发生。同时发生。同时TNF-基因多态性与基因多态性与GDM没有显著相关性。没有显著相关性。技术指标方面：技术指标方面：脂联素基因脂联素基因+45位点位点 GG基因型与基因型与GDM的遗传的遗传易感性显著相关，与易感性显著相关，与GIGT的遗传易感性无关。的遗传易感性无关。TCF7L2基因基因rs7903146位点位点 CT基因型与基因型与GDM遗传易感性显著相关，与遗传易感性显著相关，与GIGT的遗传易的遗传易感性无显著相关性。感性无显著相关性。同时，基因同时，基因-基因的交互作用研究显示：脂联基因的交互作用研究显示：脂联素基因素基因+45位点、位点、TNF-基因基因-308位点基因型位点基因型之间有交互作用。其他基因及位点间未显示明之间有交互作用。其他基因及位点间未显示明显的交互作用。显的交互作用。技术指标方面：技术指标方面：撰写研究论文撰写研究论文6 6篇，篇，2 2篇已发表于国家级核心期篇已发表于国家级核心期刊；其余均已出投到相关学术刊物待发表；刊；其余均已出投到相关学术刊物待发表；培养硕士研究生培养硕士研究生2 2名：周龙、阚林。名：周龙、阚林。20112011年年6 6月，月，二名研究生均以优异成绩从贵阳医学院毕业，二名研究生均以优异成绩从贵阳医学院毕业，并且获得硕士学位。并且获得硕士学位。 技术指标方面：技术指标方面：社会、环境效益方面社会、环境效益方面 ：社会效益：寻找妊娠期糖代谢异常致病过程中起关键作社会效益：寻找妊娠期糖代谢异常致病过程中起关键作用的基因，具有至关重要的意义，是近年来妇产科、优用的基因，具有至关重要的意义，是近年来妇产科、优生及内分泌领域的研究热点。探索及筛选与妊娠期糖代生及内分泌领域的研究热点。探索及筛选与妊娠期糖代谢异常相关的基因多态性谢异常相关的基因多态性, ,对妊娠合并糖尿病、对妊娠合并糖尿病、GDM及及GIGT的预防、治疗、改善、预后及提高广大妊娠妇女围的预防、治疗、改善、预后及提高广大妊娠妇女围产期的生命质量具有积极的作用。产期的生命质量具有积极的作用。环境效益：本研究课题采用成本最低廉的酚环境效益：本研究课题采用成本最低廉的酚- -氯仿法从外氯仿法从外周血有核细胞中提取基因组周血有核细胞中提取基因组DNADNA；然后用针对目的基因片；然后用针对目的基因片段设计的引物在适当条件下进行扩增；再结合扩增片段段设计的引物在适当条件下进行扩增；再结合扩增片段长度鉴定技术和扩增长度鉴定技术和扩增DNADNA的限制性片段长度多态性技术，的限制性片段长度多态性技术，有效地分析扩增后有效地分析扩增后DNADNA碱基序列的改变。课题的设计方法碱基序列的改变。课题的设计方法在降低实验成本的同时，可确保实验结果的准确性和可在降低实验成本的同时，可确保实验结果的准确性和可重复性。重复性。四四 、 研研 究究 结结 果果数据分析及处理：数据分析及处理：数据分析及处理：数据分析及处理：