第二章第二章 基因工程基因工程Gene Engineering基因工程是生物工程的基因工程是生物工程的核心技术，是最具生命核心技术，是最具生命力和最引人注目的前沿力和最引人注目的前沿学科之一。学科之一。学习要求n掌握基因工程的概念掌握基因工程的概念,DNA重组原理与技术重组原理与技术;n熟悉外源基因转入受体细胞的各种途径熟悉外源基因转入受体细胞的各种途径;n了解基因工程研究的基本技术路线，基因工程的应用。了解基因工程研究的基本技术路线，基因工程的应用。n 第一节第一节 基因工程概述基因工程概述一、复习一、复习DNA、基因的概念和结构、基因的概念和结构1. DNA的组成、结构和功能的组成、结构和功能 DNA DNA由腺嘌呤脱氧核苷酸（由腺嘌呤脱氧核苷酸（A A）、鸟嘌呤脱氧核）、鸟嘌呤脱氧核苷酸苷酸(G)(G)、胞嘧啶脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸(C)(C)、胸腺嘧啶脱氧核、胸腺嘧啶脱氧核苷酸苷酸(T)(T)组成。组成。 脱氧核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸基组成。脱氧核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸基组成。 四种脱氧核苷酸的脱氧核糖、磷酸基的结构和四种脱氧核苷酸的脱氧核糖、磷酸基的结构和位置相同，只是各自的碱基不同。位置相同，只是各自的碱基不同。 DNA的双螺旋结构的双螺旋结构 DNA两条脱氧两条脱氧核苷酸链总是按照核苷酸链总是按照碱基碱基A与与T互补配对互补配对和和G与与C互补配对的，互补配对的，通过氢键形成稳定通过氢键形成稳定的双螺旋结构，称的双螺旋结构，称为双链为双链DNA。 少数病毒和噬少数病毒和噬菌体中的菌体中的DNA是以是以单链形式存在的。单链形式存在的。 DNA的功能的功能（1）DNA分子能在细胞内复制分子能在细胞内复制 以原有的以原有的DNA链为模板，从特定的复制起链为模板，从特定的复制起始位点始位点（ori）起始，复制出新的）起始，复制出新的DNA链。链。 （2）携带遗传信息）携带遗传信息 DNA 是遗传信息的主要携带者，是遗传信息的主要携带者，DNA 上的部上的部分核苷酸序列决定着分核苷酸序列决定着RNA的核苷酸序列。通过的核苷酸序列。通过转录，这些核苷酸序列分别指令转录出核糖体转录，这些核苷酸序列分别指令转录出核糖体 RNA(rRNA)、转移、转移RNA(tRNA)和信使和信使 RNA(mRNA)。2 2、基因的概念和结构、基因的概念和结构 基因是编码蛋白质或基因是编码蛋白质或RNARNA等具有特定功等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是具有能产物的遗传信息的基本单位，是具有遗传信息一段遗传信息一段DNADNA序列。序列。 结构：包括编码序列结构：包括编码序列( (外显子外显子) )、编码区、编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列前后对于基因表达具有调控功能的序列和单个编码序列间的间隔序列和单个编码序列间的间隔序列( (内含子内含子) )。 基因是基因工程的操作对象原核生物基因结构原核生物基因结构真核生物基因结构真核生物基因结构 原核生物基因启动子相关的保守核苷酸序列原核生物基因启动子相关的保守核苷酸序列 Pribnow框或框或-10区：区： -4 -13bp之间由个核苷酸组成，之间由个核苷酸组成，多数是多数是TATAAT序列。序列。 -35区：区：-35bp前后保守的前后保守的TTGACA序列。序列。动、植物基因启动子相关的保守核苷酸序列动、植物基因启动子相关的保守核苷酸序列生物生物类型类型 TATA区区 （-25-30） CAAT区区（-70-80） GC区区（-80-100）动物动物TATAATAGGCCAACTGCCACACCC植物植物TCTATATA13CA 或或TGTATAAA13CA CA25GNGA24CC或或 T A25TNGA24TTGGGCGGG终止子发夹结构序列终止子发夹结构序列终止子发夹结构序列终止子发夹结构序列终止子终止子(termi- nator): 在基因编码区下游有一段使转在基因编码区下游有一段使转录终止的核苷酸序列。录终止的核苷酸序列。3、 基因工程的概念基因工程的概念n按按照照人人们们的的愿愿望望（人人为为的的），进进行行严严密密的的设设计计（类类似似工工程程设设计计），通通过过体体外外DNA重重组组（非非生生命命活活动动过过程程）和和转转基基因因等等技技术术，有有目目的的地地改改造造生生物物种种性性，使使现现有有的的物物种种在在较较短短的的时时间间内内趋趋于于完完善善（区区别别于于自自然然突突变变和和常常规规育育种种），创创造造出出更更符符合合人人们们需需求求的的新新的的生生物物类类型型;利利用这种技术对人类疾病进行有效的诊断和治疗。用这种技术对人类疾病进行有效的诊断和治疗。体外DNA重组是基因工程的基本内容和关键技术。自然界的DNA重组-难以预测基因工程-按人的意志进行DNA重组重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称分子克隆技术。因此供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。二、基因工程诞生的基础二、基因工程诞生的基础n（一）理论上的三大发现（一）理论上的三大发现n1、40年代确定的遗传信息的携带者是年代确定的遗传信息的携带者是DNA而而不是蛋白质（肺炎双球菌实验）不是蛋白质（肺炎双球菌实验）n2、50年代揭示的年代揭示的DNA分子的双螺旋结构模型分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制。和半保留复制机制。n3、50年代末年代末60年代：确定了遗传信息的传年代：确定了遗传信息的传递方式递方式(密码子学说，中心法则密码子学说，中心法则)n（二）基因工程研究的理论依据（为何可对基因进行（二）基因工程研究的理论依据（为何可对基因进行切、接、转、增、检操作）切、接、转、增、检操作）n1 1、基因可以重组互换、基因可以重组互换n2 2、基因可切割、基因可切割n3 3、基因可转移（不同生物体之间、同一染色体上、不、基因可转移（不同生物体之间、同一染色体上、不同人染色体之间、插入到靶同人染色体之间、插入到靶DNADNA中）：可把来自任何生中）：可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状 n4 4、多肽与基因之间存在对应关系、多肽与基因之间存在对应关系n5 5、遗传密码是通用的、遗传密码是通用的n6 6、基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代：某一段、基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代：某一段DNADNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNADNA片段片段提供了可能提供了可能（三）技术上的三大发明（三）技术上的三大发明1 1、6060年代末年代末7070年代：限制性核酸内切酶的年代：限制性核酸内切酶的发现发现 2 2、7070年代：年代： DNA DNA连接酶的发现连接酶的发现3 3、7070年代：基因工程载体的使用。年代：基因工程载体的使用。 1973 1973年第一次实现了重组转化成功的例子。年第一次实现了重组转化成功的例子。从此基因工程诞生，这年定为基因工程诞生从此基因工程诞生，这年定为基因工程诞生的元年。的元年。三、基因工程操作的技术路线三、基因工程操作的技术路线生物材料mRNARNADNAcDNA基因组文库人工合成目的基因PCR扩增酶切技技术术路路线线剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达基因操作的基因操作的基本步骤基本步骤n第二节第二节 基因工程四大要素基因工程四大要素n 工具酶工具酶n 载体载体n 目的基因目的基因n 受体受体基因工程技术中对核酸的精雕细刻主要用酶作为工具基因工程技术中对核酸的精雕细刻主要用酶作为工具一、工具酶一、工具酶（一）限制性内切核酸酶（一）限制性内切核酸酶 1、概念、概念 一类能识别双链一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有酯键断开，产生具有3-OH和和5-P基团的基团的DNA片片段的内切脱氧核糖核酸酶。段的内切脱氧核糖核酸酶。什么是限制性内切酶？ 由由19731973年年H.O SmithH.O Smith和和D. NathansD. Nathans提议的命名系统提议的命名系统 由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。1 1、用属名的第一个字母（大写，斜体）和种名的头两个字母、用属名的第一个字母（大写，斜体）和种名的头两个字母（小写，斜体）组成（小写，斜体）组成3 3个字母的略语表示寄主菌的物种名。个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coliEscherichia coli）用）用EcoEco表示；表示；流感嗜血菌（流感嗜血菌（Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae）用）用HinHin表示。表示。2 2、用一个大写字母表示菌株或型。如、用一个大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoREcok, EcoR3. 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示分离到的第几个，正体书写。如罗马字母表示分离到的第几个，正体书写。如EcoR IEcoR I，EcoR VEcoR V。 命名原则？命名原则？n目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶nI I 类限制性内切酶类限制性内切酶nII II 类限制性内切酶类限制性内切酶 nIIIIII类限制性内切酶类限制性内切酶 限制性内切酶系统的种类？限制性内切酶系统的种类？2、限制性内切核酸酶识别序列、限制性内切核酸酶识别序列n识别双链识别双链DNA分子中分子中4-8对碱基的特定序；对碱基的特定序；n大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧；大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧；n识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。同裂酶：识别相同序列的限制酶同裂酶：识别相同序列的限制酶 同裂酶可以具有不同的酶切位点，也可同裂酶可以具有不同的酶切位点，也可以具有相同的酶切位点。前者肯定是两以具有相同的酶切位点。前者肯定是两种不同的限制性内切核酸酶，而后者往种不同的限制性内切核酸酶，而后者往往是从不同生物中提取到的同一种限制往是从不同生物中提取到的同一种限制性内切核酸酶。性内切核酸酶。同尾酶同尾酶 (isocaudamer) 与同裂酶对应的一类限制性内切酶与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它它们虽然来源不同，识别的靶序列也各们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同不相同,但都能产生相同的粘性末端但都能产生相同的粘性末端,特特称为同尾酶。称为同尾酶。 G A A T T CC T T A A GGC T T A A1 1、黏性末端：被限制酶切开的、黏性末端：被限制酶切开的DNADNA两条单链两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基正好互补配对。（碱基正好互补配对。（55粘性和粘性和33粘性）粘性）A A T T C G3、切切割割方方式式EcoRI等酶切产生的5粘性末端5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C5EcoRI 375G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-P HO-G-C-T-C5PstI等酶切产生的3粘性末端5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5PstI 375G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G33C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C5PvuII等酶切产生的平末端5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C5PvuII 375G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G33C-G-A-G-T-C-P HO-G-A-C-C-T-C54、限制性内切核酸酶反应系统反应底物内切酶反应缓冲液适当的温度5、酶切方法单酶切方法单酶切方法一个酶切反应体系一个酶切反应体系（20L）：）：无菌重蒸水：无菌重蒸水：13L，缓冲液（缓冲液（10）：）：2L底物底物DNA： 4L酶液：酶液：1L总体积为总体积为20L。离心离心2S保温保温1-3h（30度或度或37度）度） 终止反应终止反应（65水浴中保温水浴中保温10-15min，或乙醇沉淀处，或乙醇沉淀处理，或者先用酚处理后再理，或者先用酚处理后再用乙醇沉淀处理除去酶蛋用乙醇沉淀处理除去酶蛋白。）白。）双酶切法双酶切法两种不同的酶切割同一种两种不同的酶切割同一种DNADNA分子的方法。分子的方法。（）分别酶切（）分别酶切（）同时酶切（）同时酶切先后加入酶：适于酶的稳定性不好的酶；需不同温度先后加入酶：适于酶的稳定性不好的酶；需不同温度的酶。的酶。同时加入酶：适于酶的热稳定性强，则两种酶同时加同时加入酶：适于酶的热稳定性强，则两种酶同时加入反应系统，待最适反应温度低的那种限制性核酸入反应系统，待最适反应温度低的那种限制性核酸内切酶完全切割后，升温到第二种酶的最适反应温内切酶完全切割后，升温到第二种酶的最适反应温度完成第二种酶的完全切割。度完成第二种酶的完全切割。n完全消化（完全酶切）：内切酶在完全消化（完全酶切）：内切酶在DNADNA上的所有识别位点都被上的所有识别位点都被切开。切开。n部分酶切法（不完全酶切）：只有有限数量的酶切位点被切开。部分酶切法（不完全酶切）：只有有限数量的酶切位点被切开。n部分酶切的原因：部分酶切的原因：n底物底物DNADNA的纯度低；的纯度低；n识别序列的甲基化；识别序列的甲基化；n酶用量的不足以及反应缓冲液和温度不适宜；酶用量的不足以及反应缓冲液和温度不适宜；n反应时间不足等。反应时间不足等。n（若要想部分酶切的话，则可通过缩短保温时间、降低反应温（若要想部分酶切的话，则可通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。）度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。）( (二二)DNA)DNA连接酶（连接酶（DNA ligaseDNA ligase）能催化双链能催化双链DNADNA片段紧靠在一起的片段紧靠在一起的 3OH 3OH末末端与端与 5P 5P末端之间形成磷酸二酯键，使两末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。末端连接。两种两种DNADNA连接酶连接酶（1 1）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端（2 2）T4T4噬菌体的连接酶：连接粘性末端、齐平噬菌体的连接酶：连接粘性末端、齐平末端末端功用：功用：DNADNA重组中促使载体与重组中促使载体与DNADNA连接连接具互补粘性末端片段之间的连接具平末端DNA片段之间的连接DNA片段末端修饰后进行连接DNA片段加连杆后或加衔接头连接 u基因克隆载体的含义基因克隆载体的含义u能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以相能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以相对稳定维持的对稳定维持的DNADNA分子称为基因克隆载体（分子称为基因克隆载体（gene gene cloning vectorcloning vector）。）。u基因克隆载体应具备的基本条件基因克隆载体应具备的基本条件u具有具有1 1个或多个克隆位点。个或多个克隆位点。u进入受体细胞后，一般是能够以不同的形式进行进入受体细胞后，一般是能够以不同的形式进行复制。复制。u含有供选择克隆子的标记基因。含有供选择克隆子的标记基因。u克隆载体必须是安全的。克隆载体必须是安全的。二、二、 基因克隆载体基因克隆载体载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件u克隆载体种类克隆载体种类u按构建克隆载体的材料来源分按构建克隆载体的材料来源分:u 质粒克隆载体、病毒（噬菌体）克隆载质粒克隆载体、病毒（噬菌体）克隆载体、线粒体克隆载、人工染色体克隆载体、体、线粒体克隆载、人工染色体克隆载体、叶绿体克隆载体叶绿体克隆载体 .u 按克隆载体的用途分按克隆载体的用途分:u 一般克隆载体、表达载体、建库载体、一般克隆载体、表达载体、建库载体、T或或U载体载体 . 按克隆载体的受体生物分按克隆载体的受体生物分:原核生物克隆载体原核生物克隆载体 大肠杆菌克隆载体、放线菌克隆载体大肠杆菌克隆载体、放线菌克隆载体 .真核生物克隆载体真核生物克隆载体 酵母克隆载体、植物克隆载体、动物克隆酵母克隆载体、植物克隆载体、动物克隆 载体载体 、人克隆载体、人克隆载体. u克隆载体种类克隆载体种类含义：以质粒含义：以质粒DNA分子为基础构建的克分子为基础构建的克隆载体，必须含有质粒的复制起始位点。隆载体，必须含有质粒的复制起始位点。种类：种类： 大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体 蓝藻穿梭质粒载体蓝藻穿梭质粒载体 农杆菌农杆菌Ti质粒载体质粒载体 酵母酵母2m质粒载体质粒载体 .1 1、 质粒克隆载体（重点掌握）质粒克隆载体（重点掌握）质粒DNA质粒载体的一般特征染色体DNA质粒DNA大肠杆菌细胞质粒的改造构建质粒的改造构建删除非必需区：减小质粒的分子量，提高外删除非必需区：减小质粒的分子量，提高外源源DNADNA的装载量的装载量( (一般来说，大于一般来说，大于20kb20kb的质粒的质粒很难导入受体细胞很难导入受体细胞) )加入新的遗传标记基因。加入新的遗传标记基因。引入具有多种限制酶识别及切割位点的引入具有多种限制酶识别及切割位点的DNADNA序序列：即多克隆位点列：即多克隆位点(multiple cloning (multiple cloning sitessites，MCS)MCS)。插入特殊的基因表达调控序列。插入特殊的基因表达调控序列。PBR322 PBR322 由大肠杆菌源由大肠杆菌源质粒质粒Col ElCol El衔生的质衔生的质粒粒pMBlpMBl作为出发质粒作为出发质粒构建而成含有构建而成含有Col ElCol El复制起始位点复制起始位点(Col-(Col-ori)ori)，能在大肠杆菌，能在大肠杆菌细胞中高拷贝复制。细胞中高拷贝复制。蓝藻穿梭质粒载体蓝藻穿梭质粒载体穿梭载体（穿梭载体（shuttle shuttle vectorvector）: :是指在两种不是指在两种不同的生物中复制的载体。同的生物中复制的载体。蓝藻穿梭质粒载体：既蓝藻穿梭质粒载体：既有大肠杆菌质粒载体必有大肠杆菌质粒载体必备元件，还含有蓝藻的备元件，还含有蓝藻的复制起始位点。复制起始位点。农杆菌农杆菌Ti质粒质粒致癌农杆菌致癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有一种内源质含有一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时，粒，当农杆菌同植物接触时，这种质粒会引发植物产生肿瘤这种质粒会引发植物产生肿瘤(冠瘿瘤冠瘿瘤)，所以称此质粒为，所以称此质粒为 Ti 质粒质粒(tumor in- ducing plasmid)几乎所有的酿酒酵母菌中几乎所有的酿酒酵母菌中都存在一种质粒，即都存在一种质粒，即 2m 2m质粒；质粒；构建了一系列用于酵母转构建了一系列用于酵母转基因的质粒载体，一般也基因的质粒载体，一般也构建成穿梭质粒载体，含构建成穿梭质粒载体，含有有 2m 2m 质粒的复制起始位质粒的复制起始位点和大肠杆菌源质粒的复点和大肠杆菌源质粒的复制起始位点。制起始位点。 含义含义 以病毒（噬菌体）以病毒（噬菌体）DNA或或cDNA为主构建为主构建的克隆载体，或者通过转染直接进入宿主细胞，或的克隆载体，或者通过转染直接进入宿主细胞，或者包装成病毒颗粒后通过转导进入宿主细胞。者包装成病毒颗粒后通过转导进入宿主细胞。种类种类 噬菌体克隆载体：噬菌体克隆载体：噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体 Cosmid载体载体 植物病毒克隆载体：植物病毒克隆载体： CaMV克隆载体克隆载体 动物病毒克隆载体：动物病毒克隆载体： 痘苗病毒载体痘苗病毒载体 腺病毒载体腺病毒载体 反转录病毒克隆载体反转录病毒克隆载体2、 病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体 nDNA在噬菌体中以线状双链在噬菌体中以线状双链 DNA分子存在，分子存在，全长全长 48 502bp。其左右两端各有。其左右两端各有 12 个核苷酸个核苷酸组成的组成的 5凸出黏性末端凸出黏性末端(cohesive end)，而且，而且两者的核苷酸序列互补，进入宿主细胞后，黏两者的核苷酸序列互补，进入宿主细胞后，黏性末端连接成为环状性末端连接成为环状 DNA 分子。把此末端称分子。把此末端称为为 COS位点位点(cohesive end site)。构建构建噬菌体克隆载体的策略噬菌体克隆载体的策略n用合适的限制性内切核酸酶切去 DNA 上的部分或全部非必需区，相应保留这种酶的 1个或 2 个识别位点作为克隆位点，并用点突变或甲基化酶处理等方法使必需区内的这种酶的识别序列失效，避免外源 DNA片段插入必需区；n若有必要可在非必需区组人选择标记基因；n构建的 DNA 载体不应小于 364kb入噬菌体载体入噬菌体载体 gtwes-B 粘粒（粘粒（Cosmid） 载体载体组成：质粒复制原点、抗药基组成：质粒复制原点、抗药基因、多克隆位点、已连接入的因、多克隆位点、已连接入的DNAcos位点；位点；包装范围：包装范围：29.9-45kb大片段；大片段；用途：构建基因组文库。用途：构建基因组文库。痘苗病毒载体示意图痘苗病毒载体示意图3 3 人工染色体载体人工染色体载体大大DNADNA片段克隆载体片段克隆载体 （1 1）含义：）含义： 指能在宿主细胞中稳定地复制并准指能在宿主细胞中稳定地复制并准确确 传递给子细胞的人工传递给子细胞的人工构建的染色体。构建的染色体。（2 2）特点：能容纳长达）特点：能容纳长达 1000kb 1000kb以上的外源以上的外源DNADNA片段。片段。（3 3）用途：构建基因组文库）用途：构建基因组文库, ,克隆和转移完整的克隆和转移完整的高分高分 子量基因子量基因, ,基因功能鉴定基因功能鉴定, ,基因治疗基因治疗 （4 4）类型：）类型：线形的人工染色体：必须含有端粒、着丝粒和线形的人工染色体：必须含有端粒、着丝粒和 复制起始区。复制起始区。 包含：酵母人工染色体（包含：酵母人工染色体（YAC)YAC) 人类人工染色体（人类人工染色体（HAC)HAC) 哺乳动物人工染色体（哺乳动物人工染色体（MAC)MAC)环形的人工染色体：不需要端粒和着丝粒，但环形的人工染色体：不需要端粒和着丝粒，但必须必须 含有合适的复制起始区。含有合适的复制起始区。 包含：细菌人工染色体包含：细菌人工染色体(BAC)(BAC) 源于噬菌体源于噬菌体1 1的人工染色体的人工染色体(PAC)(PAC) 双元细菌人工染色体双元细菌人工染色体(BIBAC)(BIBAC) 可转化人工染色体可转化人工染色体(TAC)(TAC)三、目的基因三、目的基因（一）定义：（一）定义： 目的基因含义：指已被或欲被分离、改造、目的基因含义：指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或扩增和表达的特定基因或DNADNA片段，能编片段，能编码某一产物或某一性状。码某一产物或某一性状。（二）来源（二）来源 ：来源于各种生物，其中主要：来源于各种生物，其中主要是真核生物如人和动物。是真核生物如人和动物。 基本步骤：基本步骤：a.a.从供体基因组从供体基因组DNADNA产生适当大小的产生适当大小的DNADNA片段片段 b.b.在体外将这些在体外将这些DNADNA片段同适当的片段同适当的噬菌体连接成噬菌体连接成重组分子重组分子 c.c.转化到大肠杆菌的受体细胞中去转化到大肠杆菌的受体细胞中去 d.d.从转化子克隆群体中挑选出含有目的基因的片段。从转化子克隆群体中挑选出含有目的基因的片段。（方法同从（方法同从cDNAcDNA基因文库中获得目的基因）基因文库中获得目的基因）四、受体细胞四、受体细胞1 1、含义：、含义： 所谓基因克隆的受体细胞，从实验技术上讲是能摄取外所谓基因克隆的受体细胞，从实验技术上讲是能摄取外源源DNADNA（基因）并使其稳定维持的细胞；从实验目的上（基因）并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。 2 2、种类：、种类： 原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细胞，原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细胞，但不是所有细胞都可以作为受体细胞。最好的是原核但不是所有细胞都可以作为受体细胞。最好的是原核生物细胞。生物细胞。 n原因：原因：n大部分原核生物没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于大部分原核生物没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源外源DNADNA的进入的进入 n没有核膜，染色体没有核膜，染色体DNADNA没有固定结合的蛋白质，这为外没有固定结合的蛋白质，这为外源源DNADNA与裸露的染色体与裸露的染色体DNADNA重组减少麻烦重组减少麻烦 n基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析 n原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验料并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快快第三节第三节 基因工程技术路线基因工程技术路线目的基因的获得（分离目的基因）目的基因的获得（分离目的基因） 目的基因和载体的连接目的基因和载体的连接DNADNA重组重组 重组重组DNADNA导入受体细胞导入受体细胞筛选与鉴定克隆子（目的基因）筛选与鉴定克隆子（目的基因） 目的基因表达目的基因表达一、一、 分离目的基因的途径分离目的基因的途径1 1、利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离目的、利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离目的基因基因 PCR扩增含目的基因DNA示意2 2、 利用利用PCRPCR直接扩增目的基因直接扩增目的基因nPCRPCR技术是基因扩增技术的一次重大革新技术是基因扩增技术的一次重大革新-19851985年美国年美国Cetus Cetus 公司的公司的MillisMillis等研制，于等研制，于19931993年获诺贝尔化学奖。年获诺贝尔化学奖。什么是什么是PCRPCR（聚合酶链式反应）（聚合酶链式反应）即在体外选择性地将即在体外选择性地将DNADNA某个特殊区域扩增出来的技某个特殊区域扩增出来的技术。术。所用的仪器是所用的仪器是PCRPCR仪。仪。n（1 1）PCRPCR的原理的原理 ：n PCR PCR技术的原理并不复杂，实质为体内技术的原理并不复杂，实质为体内DNADNA复制的体外模拟。复制的体外模拟。当双链当双链DNADNA变性为单链后，变性为单链后，DNADNA聚合酶以单链聚合酶以单链DNADNA为模板，并为模板，并利用反应混合物的四种利用反应混合物的四种dNTPsdNTPs，以与模板互补的核苷酸为引，以与模板互补的核苷酸为引物，合成新生的物，合成新生的DNADNA互补链。互补链。 nPCRPCR技术能快速特异地扩增所希望的目的基因或技术能快速特异地扩增所希望的目的基因或DNADNA片段，并片段，并能很容易地使微微克（能很容易地使微微克（pgpg）水平的起始物达到微克（）水平的起始物达到微克（gg）水平的量。水平的量。 n现已发展成为生命科学实验室获取某一目的现已发展成为生命科学实验室获取某一目的DNADNA片段的常规片段的常规技术，并逐渐被应用于各个领域。技术，并逐渐被应用于各个领域。20-35 cycles72 5-7 min4 12 h-更长时间72 1-3 min94 -96 0.5-1 min92 -96 4-6 min60 -37 0.5-1 min变性使双链变为单链退火使复性-引物与模板DNA结合Tac聚合酶使延伸nPCR扩增的步骤扩增的步骤（2 2）PCRPCR反应体系反应体系水水 18( 18( l)l)dNTPdNTP（原料）（原料） 2 2 Primer1Primer1（引物）（引物） 0.5 0.5Primer2Primer2（引物）（引物） 0.5 0.5DNADNA分子（模板）分子（模板） 1 1Mg2+Mg2+（酶的辅助因子，（酶的辅助因子，10buffer10buffer） 2.5 2.5TaqTaq酶（酶（DNADNA聚合酶）聚合酶） 0.5 0.5总体积总体积 25 l（3 3）PCRPCR的特点的特点n灵敏度高nPCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝n特异性强特异性强n引物的序列及其与模板结合的特异性是决定引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCRPCR反应结果的关键。反应结果的关键。n引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性效率和特异性, ,同时尽可能减少非特异性扩增。同时尽可能减少非特异性扩增。n简便、快速、重复性好简便、快速、重复性好n一次性加好反应液，一次性加好反应液，2-42-4小时完成扩增小时完成扩增n对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低n血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提等组织的粗提DNADNA3 3、目的基因的合成、目的基因的合成 实际上是实际上是DNADNA片断的化学合成，不同的是组成基因的片断的化学合成，不同的是组成基因的DNADNA片段一般比较长，是将化学合成的片段一般比较长，是将化学合成的200bpDNA200bpDNA片段采片段采用全片段酶促连接法等组装成为含完整目的基因的用全片段酶促连接法等组装成为含完整目的基因的DNADNA片段。片段。 步骤：步骤：合成引物合成引物 合成合成DNADNA寡核苷酸连杆寡核苷酸连杆 合成基因片断合成基因片断 DNADNA片断的连接重组，采用片断的连接重组，采用DNADNA片段的连接酶有片段的连接酶有E.coli E.coli DNA DNA 、T4DNAT4DNA连接酶连接酶3 3、 目的基因的化学合成目的基因的化学合成4 4、通过构建基因组文库或、通过构建基因组文库或cDNAcDNA文库文库分离的基因分离的基因首先构建基因组文库或首先构建基因组文库或cDNA文库；文库；再从再从cDNA基因文库中获得目的基因。基因文库中获得目的基因。 含义含义 cDNA（complementary DNA) 指由指由mRNA通过通过反转录酶进行反转录而成。反转录酶进行反转录而成。 cDNA（complementary DNA)文库：某种生物基文库：某种生物基因组转录的全部因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，储存在一种片段分别与克隆载体重组，储存在一种受体菌克隆子群体中，这样的群体称为受体菌克隆子群体中，这样的群体称为cDNA文库。文库。n基因组文库（基因组文库（ gene library(bank),genomic library):是指将真核生物的染色体组或原核生是指将真核生物的染色体组或原核生物的基因组切成许多片段，分别连接到载体物的基因组切成许多片段，分别连接到载体（噬菌体或粘粒）上，经体外包装，侵染大肠（噬菌体或粘粒）上，经体外包装，侵染大肠杆菌后形成的克隆群体。它包含某一生物的全杆菌后形成的克隆群体。它包含某一生物的全部或大部分染色体组，其中的每一克隆仅含有部或大部分染色体组，其中的每一克隆仅含有某一生物基因组的一个片段。某一生物基因组的一个片段。构建构建cDNA文库文库构建基因组文库构建基因组文库n从基因组或从基因组或cDNA文库中获得目的基因文库中获得目的基因n根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选：根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选：用已知的核苷酸序列制成核酸探针，对用已知的核苷酸序列制成核酸探针，对cDNA基因文库的一系列克隆子进行杂交，基因文库的一系列克隆子进行杂交，能杂交的克隆子就含有目的基因能杂交的克隆子就含有目的基因(后面介绍后面介绍) n根据目的基因特异性表达进行分离：有的根据目的基因特异性表达进行分离：有的基因只有在某生物的特定生长发育阶段或基因只有在某生物的特定生长发育阶段或特定的器官中才能表达特定的器官中才能表达 二、二、DNADNA片段和载体的连接片段和载体的连接重组体重组体DNADNA1 1、载体的选择和构建、载体的选择和构建 如质粒、温和噬菌体等，如质粒、温和噬菌体等，选择：根据实验的目的来选择。如果要获得大量的高纯选择：根据实验的目的来选择。如果要获得大量的高纯度的度的DNADNA片段，则选具有高拷贝的质粒载体：片段，则选具有高拷贝的质粒载体：ColE1ColE1、PMB1PMB1、PMB9PMB9等松弛型复制子质粒。等松弛型复制子质粒。2 2、载体与目的基因的链接（、载体与目的基因的链接（DNADNA连接酶）连接酶）3 3、 DNA DNA重组类型重组类型插入重组：即外源插入重组：即外源DNADNA插入到另一插入到另一DNADNA分子中。外源分子中。外源DNADNA的两末端与接受载体的的两末端与接受载体的DNADNA（只有一个识别位（只有一个识别位点）两末端都相同，且会产两种重组点）两末端都相同，且会产两种重组DNADNA分子。分子。 置换重组：每种重组置换重组：每种重组DNADNA分子中，对于接受外源分子中，对于接受外源DNADNA片段来说，部分序列已被外源片段来说，部分序列已被外源DNADNA片段置换，因片段置换，因此称为置换重组。外源此称为置换重组。外源DNADNA的两末端与接受载体的两末端与接受载体的的DNADNA（有两个识别位点）两末端都相同，会产（有两个识别位点）两末端都相同，会产4 4种重组种重组DNADNA分子。分子。三、重组体三、重组体DNADNA导入受体细胞导入受体细胞受体受体: :原核生物细胞、真核生物细胞原核生物细胞、真核生物细胞 原核生物细胞：大肠杆菌原核生物细胞：大肠杆菌 真核生物细胞：酵母真核生物细胞：酵母 导入方法：目前有很多种方法，但采用哪导入方法：目前有很多种方法，但采用哪一种应根据选用的载体系统和受体细胞一种应根据选用的载体系统和受体细胞类型而定类型而定 1 1、外源、外源DNADNA转化方法转化方法 通过生物学、物理学和化学等方法使外源裸露通过生物学、物理学和化学等方法使外源裸露 DNADNA进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化。表达的过程称为转化。 三、三、 重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞主要包括以下几种方法：主要包括以下几种方法：直接转化法直接转化法化合物诱导转化法化合物诱导转化法结合转化法结合转化法电穿孔转化法电穿孔转化法微弹轰击转化法微弹轰击转化法激光微束穿孔转化法激光微束穿孔转化法 超声波处理转化法超声波处理转化法超声波处理转化法超声波处理转化法 脂质体介导转化法脂质体介导转化法脂质体介导转化法脂质体介导转化法 体内注射转化法体内注射转化法体内注射转化法体内注射转化法 花粉管通道转化法花粉管通道转化法花粉管通道转化法花粉管通道转化法 精子介导法精子介导法精子介导法精子介导法 磷酸钙转染法磷酸钙转染法磷酸钙转染法磷酸钙转染法2 2、 病毒病毒( (噬菌体噬菌体) )颗粒转导法颗粒转导法用用病病毒毒( (噬噬菌菌体体) )的的 DNADNA（或或cDNAcDNA）构构建建成成重重组组DNADNA，在在体体外外包包装装成成重重组组病病毒毒( (噬噬菌菌体体) ) 颗粒，通过感染使重组颗粒，通过感染使重组DNADNA进入受体细胞。进入受体细胞。 方式：方式：重组病毒直接感染受体细胞重组病毒直接感染受体细胞重组病毒同另一辅助病毒一起感染受体细胞重组病毒同另一辅助病毒一起感染受体细胞重组病毒感染互补型受体细胞系重组病毒感染互补型受体细胞系适用：主要用于基因组文库或适用：主要用于基因组文库或cDNA文库的构建和动文库的构建和动植物的转基因。植物的转基因。四、筛选与鉴定克隆子（目的基因）四、筛选与鉴定克隆子（目的基因）基本概念：基本概念： 克隆子：通常将摄取外源克隆子：通常将摄取外源DNADNA分子并能使该分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称克分子在其中稳定维持的受体细胞统称克隆子。也叫转化子。隆子。也叫转化子。 重组子：含重组重组子：含重组DNADNA分子（含目的基因）的分子（含目的基因）的克隆子称重组子。克隆子称重组子。（一）克隆子的筛选方法：（一）克隆子的筛选方法：1 1、根据载体选择的标记基因筛选转化子、根据载体选择的标记基因筛选转化子 方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。子。1 1、 根据载体标记基因筛选转化子根据载体标记基因筛选转化子根据载体抗菌素抗性基因筛选转化子根据载体抗菌素抗性基因筛选转化子根据载体除草剂抗性基因筛选转化子根据载体除草剂抗性基因筛选转化子根据根据LacZLacZ基因互补显色筛选转化子基因互补显色筛选转化子根据生长调节剂非依赖型筛选转化子根据生长调节剂非依赖型筛选转化子根根据据核核苷苷酸酸合合成成代代谢谢相相关关酶酶基基因因缺缺失失互互补补筛筛 选转化子选转化子不含抗生素含抗生素蓝白斑筛选2 2、根据报告基因筛选转化子、根据报告基因筛选转化子 报告基因：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，报告基因：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。由于受体细胞内报即表达产物易被鉴定的基因。由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以次来识别告基因的表达，出现新的遗传性状，以次来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。被转化的细胞或未被转化的细胞。 条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因，比如：灵敏毒高的基因，比如：-葡萄糖酸苷酶基因（葡萄糖酸苷酶基因（gusgus） 萤火虫荧光素酶基因（萤火虫荧光素酶基因（lucluc） 绿色荧光蛋白基因（绿色荧光蛋白基因（gfpgfp）3、根据形成噬菌斑筛选转化子（不要求）、根据形成噬菌斑筛选转化子（不要求） 转导受体菌，在培养基上形成噬菌斑，未转导转导受体菌，在培养基上形成噬菌斑，未转导的受体菌继续正常生长。的受体菌继续正常生长。1 1、 根据重组根据重组DNADNA分子特征鉴定重组子分子特征鉴定重组子根据重组根据重组DNADNA分子大小鉴定重组子分子大小鉴定重组子根据重组根据重组DNADNA分子酶切图谱鉴定重组子分子酶切图谱鉴定重组子 根据根据PCRPCR扩增片段鉴定重组子扩增片段鉴定重组子采用采用DNADNA分子杂交法鉴定重组子分子杂交法鉴定重组子应用芯片鉴定重组子应用芯片鉴定重组子根据根据DNADNA序列鉴定重组子序列鉴定重组子（二）重组子的鉴定（二）重组子的鉴定2 2、根据外源基因转录产物、根据外源基因转录产物mRNAmRNA鉴定重组子鉴定重组子根据根据RT-PCR 扩增片段鉴定重组子扩增片段鉴定重组子 采用采用RNA分子杂交法鉴定重组子分子杂交法鉴定重组子 Northern印迹杂交法印迹杂交法 斑点印迹杂交斑点印迹杂交 菌落（或噬菌斑）原位杂交菌落（或噬菌斑）原位杂交3 3、根据目的基因翻译产物蛋白质（酶）、多肽鉴定重组子、根据目的基因翻译产物蛋白质（酶）、多肽鉴定重组子蛋白质凝胶电泳法鉴定重组子蛋白质凝胶电泳法鉴定重组子 单向凝胶电泳单向凝胶电泳 双向凝胶电泳双向凝胶电泳 毛细管等电点凝胶电泳毛细管等电点凝胶电泳免疫检测法鉴定重组子免疫检测法鉴定重组子 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法 Western印迹法印迹法 固相放射免疫法固相放射免疫法 免疫沉淀法免疫沉淀法质谱分析法质谱分析法 样品（样品（DNA RNA DNA RNA 蛋白质）蛋白质） 转移到转移到 尼龙膜尼龙膜 探针制备探针制备 杂交杂交 放射自显影或显色观察放射自显影或显色观察杂交的基本程序：杂交的基本程序：Southern杂交杂交Northern杂交杂交Western 杂交杂交探针与样品结合以探针与样品结合以检测样品中是否存检测样品中是否存在与探针具有同源在与探针具有同源性的核酸分子或与性的核酸分子或与特异性的蛋白质存特异性的蛋白质存在的过程在的过程分子杂交的原理分子杂交的原理: :（1 1）碱基互补原则（）碱基互补原则（DNADNA、RNARNA）：根据两条核酸单）：根据两条核酸单链中互补碱基序列能专一配对的原理，利用已标记链中互补碱基序列能专一配对的原理，利用已标记的某核酸片段为探针，可以检测重组的某核酸片段为探针，可以检测重组DNADNA分子中是分子中是否有与探针同源的序列。否有与探针同源的序列。（2 2）抗原抗体反应（蛋白质）：抗原与相应抗体之）抗原抗体反应（蛋白质）：抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。间所发生的特异性结合反应。nSouthernSouthern杂交杂交: :用以检查重组用以检查重组DNADNA中目的基因中目的基因的存在。的存在。NorthernNorthern杂交：用以分析特定目的基因的转录情杂交：用以分析特定目的基因的转录情况及不同组织器官中基因的差异表达。况及不同组织器官中基因的差异表达。Western Western 杂交：用以检测目的基因的翻译表杂交：用以检测目的基因的翻译表达情况及特定蛋白的组织特异性表达。达情况及特定蛋白的组织特异性表达。（五）目的基因的表达（五）目的基因的表达n目的基因在插入载体后，在其编码顺序的目的基因在插入载体后，在其编码顺序的5端端有能被受体细胞识别的启动基因顺序及能和核有能被受体细胞识别的启动基因顺序及能和核糖体结合的顺序。则该目的基因就可以表达，糖体结合的顺序。则该目的基因就可以表达，从而使是基因工程得以实现。从而使是基因工程得以实现。重组产物重组产物目的基因目的基因克隆载体克隆载体连接连接重组重组DNADNA分子分子细菌中原核表达细菌中原核表达在植物中表在植物中表达（转基因达（转基因植物）植物）在酵母在酵母中表达中表达病毒中表达病毒中表达分离纯化分离纯化上上游游技技术术下下游游技技术术酶切酶切酶切酶切转化感受态宿主细胞转化感受态宿主细胞目的基因被克隆目的基因被克隆构建其表达载体构建其表达载体转化感受态转化感受态宿主细胞宿主细胞PCRPCR和和酶切鉴酶切鉴定定SouthernNorthernWestern 鉴定第四节第四节 基因工程的应用与安全基因工程的应用与安全有巨大潜力：有巨大潜力：1 1、高效、经济、高效、经济2 2、清洁、低耗、可持续发展、清洁、低耗、可持续发展可遗传、易扩散、自主扩展可遗传、易扩散、自主扩展对人类伦理和人性尊严有直接影响对人类伦理和人性尊严有直接影响一、应用：一、应用：（一）基因工程应用于生命科学本身的研究（一）基因工程应用于生命科学本身的研究基因结构与功能研究基因结构与功能研究基因与疾病的关系基因与疾病的关系（二）基因工程与医药卫生（二）基因工程与医药卫生1 1）生产基因药品）生产基因药品2 2）基因诊断）基因诊断3 3）基因治疗）基因治疗基因工程在医药卫生领域的应用基因工程在医药卫生领域的应用传统生产方法的缺点传统生产方法的缺点由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。可利用什么方法来解决上述问题？可利用什么方法来解决上述问题？ 利用基因工程方法制造利用基因工程方法制造“工程菌工程菌”，可，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素、生长激素等是直接从生物体的组织、干扰素、生长激素等是直接从生物体的组织、细胞或血液中提取得到的。细胞或血液中提取得到的。1 1）生产基因药品）生产基因药品 胰岛素是治疗糖尿病的特效药。一般临床上使用的胰岛胰岛素是治疗糖尿病的特效药。一般临床上使用的胰岛素主要从猪、牛等家畜的胰腺中提取，每素主要从猪、牛等家畜的胰腺中提取，每100kg100kg胰腺只能提取胰腺只能提取45g45g胰岛素。用该方法生产的胰岛素产量低，价格昂贵，远胰岛素。用该方法生产的胰岛素产量低，价格昂贵，远不能满足社会需要。不能满足社会需要。19791979年，科学家将动物体内的胰岛素基年，科学家将动物体内的胰岛素基因与大肠杆菌因与大肠杆菌DNADNA分子重组，并在大肠杆菌内实现了表达。每分子重组，并在大肠杆菌内实现了表达。每2000L2000L培养液就能产生培养液就能产生100g100g胰岛素！胰岛素！ 1982 1982年，美国一家基因年，美国一家基因公司用基因工程方法生产的胰岛素投入市场，售价降低了公司用基因工程方法生产的胰岛素投入市场，售价降低了30%-50%30%-50%。 基因工程药品基因工程药品 胰岛素胰岛素举例举例1 1：胰胰岛岛素素生生产产车车间间胰胰胰胰岛岛岛岛素素素素分分分分子子子子结结结结构构构构 干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白。干扰素干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白。干扰素几乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一种抗病毒的特效药。几乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一种抗病毒的特效药。此外干扰素对治疗某些癌症和白血病也有一定疗效。此外干扰素对治疗某些癌症和白血病也有一定疗效。 基因工程药品基因工程药品 干扰素干扰素 传统的干扰素生产方法是从人血液中的白细胞内提取，传统的干扰素生产方法是从人血液中的白细胞内提取，每每300L300L血液只能提取出血液只能提取出1mg1mg干扰素。干扰素。1980198219801982年，科学家年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，是传统的生产量的是传统的生产量的1212万倍。万倍。19871987年上述干扰素大量投放市年上述干扰素大量投放市场。场。 举例举例2 2：干扰素分子结构干扰素分子结构干扰素生产车间干扰素生产车间n基因工程人干扰素基因工程人干扰素-2b（安达芬）（安达芬） 是我国第一个全国是我国第一个全国产化基因工程人干扰素产化基因工程人干扰素-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。 治疗侏儒症的唯一方法，是向人体注射生长激治疗侏儒症的唯一方法，是向人体注射生长激素。而生长激素的获得很困难。以前，要获得生长素。而生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。中提取生长激素。基因工程药品基因工程药品 生长激素生长激素 现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从 450 450 L L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6 6万具万具尸体的全部产量。尸体的全部产量。 举例举例3 3：其它基因工程药物其它基因工程药物n人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。人人人人造造造造血血血血液液液液及及及及其其其其生生生生产产产产基因诊断：基因诊断： 也称为也称为DNADNA诊断或基因探针技术，即在诊断或基因探针技术，即在DNADNA水平分析检测某一基因，从而对特定的水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。疾病进行诊断。2 2）基因诊断）基因诊断原原 理：利用理：利用DNADNA分子杂交原理；分子杂交原理；基因探针技术：基因探针技术：探针制备：放射性同位素探针制备：放射性同位素( (如如32P)32P)、荧光分、荧光分子子 等标记的等标记的DNADNA分子；分子；基因探针：基因探针： 基因探针就是一段与目的基因或基因探针就是一段与目的基因或DNADNA互互补的特异核苷酸序列。它包括整个基因，补的特异核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的一部分；可以是或基因的一部分；可以是DNADNA本身，也可以本身，也可以是由之转录而来的是由之转录而来的RNARNA。基因诊断技术在什么方面发展迅速？基因诊断技术在什么方面发展迅速？ 在诊断遗传性疾病方面发展迅速。目前在诊断遗传性疾病方面发展迅速。目前已经可以对几十种遗传病进行产前诊断。已经可以对几十种遗传病进行产前诊断。 1 1）-珠蛋白的珠蛋白的DNADNA探针探针 镰刀状细胞贫血症镰刀状细胞贫血症 2 2）苯丙氨酸羧化酶基因探针）苯丙氨酸羧化酶基因探针 苯丙酮尿症苯丙酮尿症 3 3）白血病患者细胞中分离出的癌基因制备的）白血病患者细胞中分离出的癌基因制备的 DNA DNA探针探针 白血病白血病举例举例基因治疗：基因治疗： 是指是把健康的外源基因导入有基因缺是指是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。 3 3）基因治疗）基因治疗体细胞基因治疗：广泛使用。对象：基因变异或基因缺失的细胞。将有治疗功能的基因转入患者的某一特定组织中生殖细胞基因治疗：因能引起遗传改变而受到限制。当代-下一代，一旦出问题，造成严重后果。美国85年规定基因治疗仅限于体细胞 患半乳糖血症的患者，由于细胞内半乳患半乳糖血症的患者，由于细胞内半乳糖苷转移酶基因缺陷而缺少半乳糖苷转移酶，糖苷转移酶基因缺陷而缺少半乳糖苷转移酶，使过多的半乳糖在体内积聚，引起肝、脑等使过多的半乳糖在体内积聚，引起肝、脑等功能受损。功能受损。 1971 1971年，美国科学家在体外做了试验，年，美国科学家在体外做了试验，用带有半乳糖苷转移酶基因的噬菌体侵染患用带有半乳糖苷转移酶基因的噬菌体侵染患者的离体组织细胞，结果发现这些组织细胞者的离体组织细胞，结果发现这些组织细胞能够利用半乳糖了。这表明，用基因替换的能够利用半乳糖了。这表明，用基因替换的方法治疗这种遗传病是可能的。方法治疗这种遗传病是可能的。举例举例SCIDSCID的基因工程治疗的基因工程治疗n重症联合免疫缺陷（重症联合免疫缺陷（SCIDSCID）患者缺乏正常的人体免疫功患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被细菌或者病毒能，只要稍被细菌或者病毒感染，就会发病死亡。这个感染，就会发病死亡。这个病的机理是细胞的一个常染病的机理是细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶色体上编码腺苷酸脱氨酶（简称（简称ADAADA）的基因（）的基因（adaada）发生了突变。可以通过基因发生了突变。可以通过基因工程的方法治疗。工程的方法治疗。SCIDSCID患者生存在无菌环境中患者生存在无菌环境中患者生存在无菌环境中患者生存在无菌环境中基因治疗基因治疗SCID的过程的过程基因工程在农业上的应用：基因工程在农业上的应用：1 1）高产、稳产和具优良品质的品种）高产、稳产和具优良品质的品种用基因工程的方法可以改善粮食作物的蛋白质含量。用基因工程的方法可以改善粮食作物的蛋白质含量。“向日葵豆向日葵豆”植株植株高光合作用基因转入普通杂交水稻高光合作用基因转入普通杂交水稻产量可能提高产量可能提高20%20%大豆蛋白基因转入水稻、小麦大豆蛋白基因转入水稻、小麦-高蛋白水稻、小高蛋白水稻、小麦麦（三）基因工程与农牧业、食品工业（三）基因工程与农牧业、食品工业2）抗逆性品种）抗逆性品种n将细菌的抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐碱、将细菌的抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐碱、抗干旱、抗高温等抗性基因转移到作物体内，抗干旱、抗高温等抗性基因转移到作物体内，将从根本上改变作物的特性。如转基因抗虫棉。将从根本上改变作物的特性。如转基因抗虫棉。转鱼抗寒基因转鱼抗寒基因的番茄的番茄1 1、哈师大生物系研制、哈师大生物系研制2 2、美洲拟蝶鱼抗寒基因、美洲拟蝶鱼抗寒基因3 3、植株致死温度下降、植株致死温度下降2 2度，度，VcVc含量高含量高15.5%15.5%，产量增，产量增11%11%转黄瓜抗青枯病转黄瓜抗青枯病基因的甜椒基因的甜椒土传、细菌性病害叶片青干且不易脱落 抗虫棉抗虫棉抗虫棉抗虫棉普通棉普通棉普通棉普通棉科学家从苏云金芽孢杆菌中提取出毒蛋白基科学家从苏云金芽孢杆菌中提取出毒蛋白基因，并成功的导入棉细胞内使之合成毒蛋白。因，并成功的导入棉细胞内使之合成毒蛋白。特异性地毒杀棉铃虫及鳞翅目的一些其它害虫特异性地毒杀棉铃虫及鳞翅目的一些其它害虫 繁殖具有抗病能力、高产仔率、高产奶率和高质繁殖具有抗病能力、高产仔率、高产奶率和高质量的皮毛等优良品质的转基因动物。量的皮毛等优良品质的转基因动物。 该过程的重要步骤是通过感染或显微注射技术将该过程的重要步骤是通过感染或显微注射技术将重组重组DNADNA转移到动物受精卵中。转移到动物受精卵中。 人的干扰素基因、抗凝血因子基因、胰岛素基因人的干扰素基因、抗凝血因子基因、胰岛素基因转入奶牛转入奶牛-相当于生产工厂，可持久使用。相当于生产工厂，可持久使用。基因工程在畜牧养殖业上的应用主要是什么？基因工程在畜牧养殖业上的应用主要是什么？基因工程在畜牧业上的应用基因工程在畜牧业上的应用用口径为用口径为1m1m的的DNADNA注射器，注射器，将大量的目的基因片段注入到将大量的目的基因片段注入到受精卵的核内，然后把经过注受精卵的核内，然后把经过注射的受精卵移植到另一只雌性射的受精卵移植到另一只雌性动物的子宫内，使受精卵发育动物的子宫内，使受精卵发育为转基因动物。为转基因动物。什么叫显微注射技术？什么叫显微注射技术？将大鼠的将大鼠的生长激素生长激素基因注射基因注射到小鼠受到小鼠受精卵中，精卵中，得到的得到的“超级鼠超级鼠”。 转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快两到三倍，体积大一倍 这项研究被称为分子生物学技术发展史上的里程碑 生长生长快、肉质快、肉质好的转基好的转基因鱼因鱼 ( (中国中国) )生长速度比普通鱼提高生长速度比普通鱼提高，饵料利用率提，饵料利用率提高高 用只小鼠进行了用只小鼠进行了转全鱼基因转全鱼基因 鱼食品消费鱼食品消费安全试验，结果表明：安全试验，结果表明：转全鱼基因鱼作为食品转全鱼基因鱼作为食品消费是安全的。消费是安全的。 乳汁中含乳汁中含有人生长有人生长激素的转激素的转基因牛。基因牛。( (阿根廷阿根廷) )转基因动物的乳腺细胞内。转基因动物的乳腺细胞内。就基因药物而言，最理想的表达场所是哪里？就基因药物而言，最理想的表达场所是哪里？是指把人或哺乳动物的某种基因导入到哺乳动物是指把人或哺乳动物的某种基因导入到哺乳动物( (如鼠、兔、羊和猪如鼠、兔、羊和猪) )的受精卵里，目的基因若与受的受精卵里，目的基因若与受精卵染色体精卵染色体DNADNA整合，细胞分裂时，该基因随染色整合，细胞分裂时，该基因随染色体的倍增而倍增，使每个细胞中都带有目的基因，体的倍增而倍增，使每个细胞中都带有目的基因，使性状得以表达，并稳定地遗传给后代，从而获得使性状得以表达，并稳定地遗传给后代，从而获得基因产品。这样一种新的个体，称为转基因动物。基因产品。这样一种新的个体，称为转基因动物。 什么叫转基因动物？什么叫转基因动物？ 1 1）乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内）乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。循环，不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。 2 2）从乳汁中获取目的基因产物，产量高，易）从乳汁中获取目的基因产物，产量高，易提纯，表达的蛋白质已经过充分的修饰加工，具有提纯，表达的蛋白质已经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。稳定的生物活性。 3 3）从乳汁中源源不断获得目的基因的产物的）从乳汁中源源不断获得目的基因的产物的同时，转基因动物又可无限繁殖。同时，转基因动物又可无限繁殖。为什么动物的乳腺细胞能成为基因药物最理为什么动物的乳腺细胞能成为基因药物最理想的表达场所呢？想的表达场所呢？基因工程为人类开辟新的食物来源。基因工程为人类开辟新的食物来源。 1 1）鸡蛋白基因在大肠杆菌和酵母菌中）鸡蛋白基因在大肠杆菌和酵母菌中表达获得成功。这表明，未来能用发酵罐表达获得成功。这表明，未来能用发酵罐培养的大肠杆菌或酵母菌来生产人类所需培养的大肠杆菌或酵母菌来生产人类所需要的卵清蛋白。要的卵清蛋白。 2 2）用基因工程的方法从微生物中获得）用基因工程的方法从微生物中获得人们所需要的糖类、脂肪和维生素等产品。人们所需要的糖类、脂肪和维生素等产品。基因工程为食品工业提供了什么前景？基因工程为食品工业提供了什么前景？基因工程在食品工业上的应用：基因工程在食品工业上的应用：1 1）用于环境监测；）用于环境监测；2 2）用于被污染环境的净化。）用于被污染环境的净化。基因工程在环保方面有什么应用？基因工程在环保方面有什么应用？ 例如：用例如：用DNADNA探针可以检测饮用水中病探针可以检测饮用水中病毒的含量。此方法的特点是快速、灵敏，毒的含量。此方法的特点是快速、灵敏，1 1吨水中有吨水中有1010个病毒也能检测出来。个病毒也能检测出来。 通过基因工程方法怎样进行环境监测？通过基因工程方法怎样进行环境监测？（四）基因工程与环境保护（四）基因工程与环境保护1t1t水中只有水中只有1010个病毒也能被个病毒也能被DNADNA探针检测出来探针检测出来 1 1）用基因工程产物）用基因工程产物“超级细菌超级细菌”分解石分解石油，可以大大提高细菌分解石油的效率。具体方法：油，可以大大提高细菌分解石油的效率。具体方法：将能分解三种烃类的假单孢杆菌的基因都转移到能将能分解三种烃类的假单孢杆菌的基因都转移到能分解另一种烃类的假单孢杆菌内，创造出了能同时分解另一种烃类的假单孢杆菌内，创造出了能同时分解四种烃类的分解四种烃类的“超级细菌超级细菌”。 2 2）用基因工程培养出）用基因工程培养出“吞噬吞噬”汞和降解土壤汞和降解土壤中中DDTDDT的细菌，以及能够净化镉污染的植物。的细菌，以及能够净化镉污染的植物。 3 3）通过基因重组构建新的杀虫剂，取代生产）通过基因重组构建新的杀虫剂，取代生产过程中耗能多、易造成环境污染的农药，并试图通过程中耗能多、易造成环境污染的农药，并试图通过基因工程回收和利用工业废物。过基因工程回收和利用工业废物。 通过基因工程方法怎样净化被污染的环境？通过基因工程方法怎样净化被污染的环境？( (六六) )基因本身也是一个产业基因本身也是一个产业nRockfeller 大学将人肥胖基因出售大学将人肥胖基因出售0.2亿美元亿美元（1995年年3月）月）nAmgen公司将公司将FKBP神经免疫因子配体转让神经免疫因子配体转让达达3.29亿美元（亿美元（1997年）年）nMillennium公司以公司以4.65亿美元向亿美元向Bayer公司公司转让转让225种基因的开发权（种基因的开发权（1998年年9月）月）基因工程试剂的高回报基因工程试剂的高回报n碱性成纤维细胞生长因子碱性成纤维细胞生长因子 231元元/ugn红细胞生成素红细胞生成素 1072元元/ugn白细胞介素白细胞介素-2 410元元/ugn巨细胞粒细胞集落刺激因子巨细胞粒细胞集落刺激因子 1960元元/ugn胰岛素胰岛素 10.2元元/mg二、安全问题二、安全问题n（一）对生态环境的影响（一）对生态环境的影响n（二）对人类健康的影响（二）对人类健康的影响n（三）对伦理道德的影响（三）对伦理道德的影响n（四）所带来的经济问题（四）所带来的经济问题n（一）对农业基因工程安全性管理（一）对农业基因工程安全性管理n（二）对基因工程食品的安全性管理（二）对基因工程食品的安全性管理n（三）对基因工程医药产品的安全评价（三）对基因工程医药产品的安全评价三、安全性管理三、安全性管理思考题：思考题：n1、基因工程技术的发展给人类带来的影响？、基因工程技术的发展给人类带来的影响？ n2、基因工程技术在应用中存在的主要问题？、基因工程技术在应用中存在的主要问题？ n3、基因工程技术的发展方向？、基因工程技术的发展方向？