大肠杆菌表达重组人粒细胞大肠杆菌表达重组人粒细胞- -集集落刺激因子包涵体的复性与纯化落刺激因子包涵体的复性与纯化创新实验I-化学生物学 课程组课程组 王骊丽王骊丽实验四实验四NORTHWEST UNIVERSITY化学国家级实验教学示范中心化学国家级实验教学示范中心大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化基因工程操作：基因扩增、表达；原核细胞；包涵体的形成与特点。重组蛋白分离纯化：细胞收集、破碎；包涵体的溶解；蛋白质变性、复性：稀释法、透析法、蛋白质折叠液相色谱法；蛋白质构象的表征：包涵体构象变化、圆二色谱法实验技能训练要点实验技能训练要点主要新知识主要新知识大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化仪器分析：色谱技术液相色谱技术仪器分析：光谱技术-荧光光谱、核磁共振化学生物学导论：蛋白质、酶蛋白质与酶化学：重组DNA技术蛋白质纯化与表征：液相色谱法、蛋白质构象表征.有机化学：荧光探针实验技能训练要点实验技能训练要点主要知识回顾主要知识回顾大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化背景知识背景知识实验室研室研发从从E.coli 中得中得到到一个具有活性的治一个具有活性的治疗用用药物蛋白物蛋白或者研究用蛋白或者研究用蛋白纯品，包括以下步品，包括以下步骤：目的基因目的基因DNA片段的片段的获得；得；E.coli 重重组表达表达载体的构建；体的构建；在在E.coli 中中对目的基因目的基因进行表达；行表达；目的蛋白从目的蛋白从E.coli 裂裂解液中的解液中的纯化；化；规模化生模化生产工工艺（包括工程菌（包括工程菌发酵、酵、复性复性与与纯化工化工艺的放大等）的建立。的放大等）的建立。关关键词：重重组人人粒粒细胞胞-集落刺激因子、液相色集落刺激因子、液相色谱复性与复性与纯化化Recombinant human granulocyte colony stimulating factor, Renaturation and purification by liquid chromatography大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化实例：粒细胞白血病实例：粒细胞白血病粒细胞白血病粒细胞白血病(ML)(ML)在我国其发病率占成人新诊断白在我国其发病率占成人新诊断白血病血病20%20%以上，年发病率为以上，年发病率为1010万分之万分之1 1。大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化人粒细胞人粒细胞- -集落刺激因子对造血系统的调控作用集落刺激因子对造血系统的调控作用H HSCSCCLPCLPC CMPMPGMPGMPMEPMEPPro-TPro-TPro-BPro-BT TB BNKNK单核细胞单核细胞粒细胞粒细胞巨核细胞巨核细胞红细胞红细胞SCF;IL-2SCF;IL-2SCFSCFEPOEPOSCFSCFSCFSCFSCFSCFSCFSCFIFN-IFN- SCFSCF基质细胞基质细胞SCFSCF大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化名称名称氨基酸氨基酸残基数残基数二硫二硫键数数相相对分子分子质量与等量与等电点点主要主要产生生细胞胞主要生物学主要生物学rhG-SCF177分子中分子中含有含有5个个半胱氨酸半胱氨酸残基，可残基，可形成两个形成两个二硫二硫键19.6kD;pI6.0巨噬巨噬细胞、内胞、内皮皮细胞及胞及纤维母母细胞胞能高度特异性能高度特异性的刺激中性白的刺激中性白细胞系的前体胞系的前体细胞存活、增胞存活、增殖和分化，同殖和分化，同时也是成熟的也是成熟的中性白中性白细胞的胞的功能活化因子功能活化因子rhG-CSF的理化性能与生物学功能的理化性能与生物学功能大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化复性与复性与纯化方化方法法添加添加剂质量回收量回收率率(%)纯度度(%)生物活性生物活性(108IU/mg)IEC3.0 mol/L urea,2.5m mol/L GSH, 0.8 m mol/L GSSG49.0963.0HICN.R.42.696.82.1SEC15% glycerol (v/v),2.5m mol/L GSH, 0.8 mM GSSG30.0831.2脲梯度梯度SEC15% glycerol (v/v), 2.5m mol/L GSH, 0.8 m mol/L GSSG46.1N.R1.0AFC2.0 mol/L urea32.0971.8AFC3.0 mol/L urea39.0972.3几种几种PFLC法复性与法复性与纯化化rhG-CSF包涵体包涵体结果比果比较大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化实验内容提要实验内容提要一、一、实验目的目的二、二、实验原理原理三、三、实验仪器器与与试剂六、六、实验延伸延伸五、五、实验结果果与与讨论四、四、实验步步骤与与方法方法 思考思考题 参参考文考文献献西北大学化学与材料科学学院大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化一、实验目的一、实验目的掌握包涵体的变性、复性的基本原理；熟练掌握复性与纯化后蛋白质的表征和鉴定方法；熟练掌握蛋白质含量测定和蛋白质构象的表征。 通过人粒细胞通过人粒细胞- -集落刺激因子集落刺激因子(GC-(GC-CSF)CSF)基因扩增和在大肠杆菌基因扩增和在大肠杆菌DH5DH5中重中重组包涵体蛋白表达、复性的实验，使学组包涵体蛋白表达、复性的实验，使学生生了解大肠杆菌包涵体形成和特点了解大肠杆菌包涵体形成和特点; ;了了解二硫键形成与构象的关系；解二硫键形成与构象的关系；大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化基因工程技基因工程技术是指人是指人们按照自己的愿望，通按照自己的愿望，通过体体外外DNA重重组和和转移等技移等技术，有目的地改造生物物，有目的地改造生物物种，使种，使现有物种出有物种出现人人类需要的性状的技需要的性状的技术;以大以大肠杆菌克隆表达系杆菌克隆表达系统为基基础的原核基因工程的原核基因工程技技术，使得人，使得人们可以在大可以在大肠杆菌中高效表达出几杆菌中高效表达出几乎任何一种有理乎任何一种有理论和和应用价用价值的蛋白。的蛋白。二、实验原理二、实验原理-基因工程技术基因工程技术大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌中高效表达的蛋白，常常以不可溶解包涵体存在；包涵体是由错误折叠的多肽形成的致密、非晶体性的蛋白沉淀物，其一级结构（即氨基酸序列）是正确的，立体结构是错误，所以没有生物活性；包涵体能够溶解于强的变性剂，如8mol/L脲或6-7mol/L盐酸胍溶液中。二、实验原理二、实验原理包涵体的形成和特点包涵体的形成和特点 超声破碎超声破碎包含体包含体外周质外周质胞浆胞浆沉淀沉淀 可溶部分可溶部分洗涤洗涤溶解溶解离心离心离心离心包涵体复性包涵体复性大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化直接稀释法（直接稀释法（Directdilution），包括透析法和超滤法），包括透析法和超滤法液相色谱复性法（液相色谱复性法（Chromatographicmethodsforproteinrefolding）人工配基辅助的蛋白复性（人工配基辅助的蛋白复性（Artificialmolecularchaperoneassistedproteinrefolding)二、实验原理二、实验原理体外复性的主要途径体外复性的主要途径大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化液相色谱复性蛋白的过程液相色谱复性蛋白的过程蛋白质被可逆地吸附在固定相以单个分子存在，从而实现单个蛋白质被可逆地吸附在固定相以单个分子存在，从而实现单个分子相互分离，并抑制聚集产生，合适的流动相将蛋白分子从分子相互分离，并抑制聚集产生，合适的流动相将蛋白分子从固定相上洗脱。固定相上洗脱。大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化三、三、实验实验试剂和仪器试剂和仪器 尿尿素素（成成都都金金山山化化学学试剂厂厂），乙乙腈（色色谱纯，天天津津科科密密欧欧化化学学试剂有有限限公公司司）；三三氟氟醋醋酸酸（分分析析纯，Fluka公公司司）；硫硫酸酸铵、氢氧氧化化钠、磷磷酸酸二二氢钾、氯化化钠、浓盐酸酸等等均均为分分析析纯（西西安安化化学学试剂厂厂）。-氰基基-4-羟基基肉肉桂桂酸酸（CHCA）均均购自自Sigma公司（公司（St.Louse，MO，美国）。，美国）。试剂试剂西北大学化学与材料科学学院大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化三、三、实验实验试剂和仪器试剂和仪器纯水仪纯水仪离心机离心机二氧化碳培养箱二氧化碳培养箱快速蛋白纯化仪快速蛋白纯化仪日立日立F-4500荧光光谱仪荧光光谱仪仪器仪器大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化天数天数实验内容实验内容实验准备实验准备相关知识点相关知识点第第1天天包涵体粗分离、溶包涵体粗分离、溶解解配制变性剂及其缓配制变性剂及其缓冲液，装填色谱柱冲液，装填色谱柱细胞的破碎，细胞的破碎，离心技术离心技术第第2天天利用稀释法、利用稀释法、HIC法进行包涵体的复法进行包涵体的复性与同时纯化性与同时纯化配制色谱流动相配制色谱流动相稀释法、色谱稀释法、色谱复性与纯化原复性与纯化原理理第第3天天理化性质分析，分理化性质分析，分子量，蛋白质含量子量，蛋白质含量SDS-PAGE、质谱、质谱紫外分光光度计紫外分光光度计电泳、质谱技电泳、质谱技术术第第4天天一级结构、高级一级结构、高级构构象象、生物学活性生物学活性荧光光谱仪、配制荧光光谱仪、配制测定活性缓冲液测定活性缓冲液荧光光谱、荧光光谱、MTT法法第第5天天数据处理、整理数据处理、整理实验报告实验报告环节环节1 1环节环节2 2环节环节3 3四、实验步骤与方法四、实验步骤与方法实验天数实验天数大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化四、实验步骤与方法四、实验步骤与方法PCR扩增技术获得扩增技术获得rhGC-CSF基因基因插入克隆载体进行测序插入克隆载体进行测序回收扩增片断回收扩增片断插入表达载体表达插入表达载体表达5L或或50L发酵罐发酵罐蛋白的生物活性和蛋白的生物活性和理化性质分析理化性质分析正确的基因正确的基因筛选表达最好的菌株筛选表达最好的菌株获得包涵体蛋白获得包涵体蛋白多种方法复性重组多种方法复性重组包涵体蛋白包涵体蛋白获得有活性的蛋白获得有活性的蛋白大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化四、四、实验步步骤与方法与方法-流流动相相组成成普通普通SEC：0.15mol/LNaCl，3.0mol/Lurea，0.05mol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA+1.0mmol/L，pH8.0GSH/0.1mmol/LGSSG，15%甘油甘油;脲梯度梯度SEC：A为0.05mol/LTris(pH8.0)，1.0mmol/LEDTA，0.15mol/LNaCl，2.5mmol/LGSH+0.8mmol/L；B为8.0mol/Lurea。大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化1 1、普通、普通SECSEC法对法对hG-CSFhG-CSF复性与纯化复性与纯化流流动相平衡相平衡Superdex75(16/20)柱子，然后将柱子，然后将200L8.0mol/L脲溶解溶解变性的性的rhG-CSF溶液直接溶液直接进样到平衡好的色到平衡好的色谱柱中，用平衡柱中，用平衡时所用的流所用的流动相洗脱复性的相洗脱复性的rhG-CSF。流速流速1.04.0mL/min，检测波波长为280nm。收集复性的收集复性的rhG-CSF馏分，分，测定蛋白定蛋白浓度。度。将收集液用稀将收集液用稀盐酸将其酸将其pH调至至4.0，然后，然后对储存液存液10.0mmol/LNaAc缓冲液冲液(pH4.0)透析，透析后的含透析，透析后的含rhG-CSF的溶液用于的溶液用于测定生物活性。定生物活性。大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化2 2、脲梯度、脲梯度SECSEC复性复性rhG-CSFrhG-CSF用流用流动相相A和和B按一定比例的混合液平衡色按一定比例的混合液平衡色谱柱，然后在柱，然后在10或者或者15mL内将内将B液液浓度增至度增至100%。按上述方法平衡后，将。按上述方法平衡后，将不同体不同体积还原原变性的性的rhG-CSF直接直接进入入SEC色色谱柱，然后以柱，然后以2.0mL/min的流速用的流速用B液洗脱。液洗脱。检测波波长280nm。收集复性的收集复性的rhG-CSF，用稀，用稀盐酸将其酸将其pH调至至4.0，然后，然后对储存液存液10.0mmol/L醋酸醋酸钠缓冲液（冲液（pH4.0）透析。透析后的）透析。透析后的含含rhG-CSF的溶液用来的溶液用来测定蛋白定蛋白浓度和生物活性。度和生物活性。大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化优化的条件化的条件下复性与下复性与纯化化普通普通SEC法：法：流流动相相为0.15mol/LNaCl,0.05mol/LTris,1.0mmol/LEDTA,2.5mmol/LGSH,0.8mmol/LGSSG,3.0mol/Lurea,15%甘油甘油(v/v)，pH8.0；脲梯度梯度SEC法：法：流流动相相为0.15mol/LNaCl,0.05mol/LTris,1.0mmol/LEDTA,2.5mmol/LGSH,0.8mmol/LGSSG,15%甘油甘油(体体积比比)，pH8.0；流；流动相相B：流：流动相相A+8.0mol/L脲流速流速为2.0mL/min,检测波波长280nm大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化rhG-CSF的的SEC复性与同复性与同时纯化化产物色物色谱图；复性与复性与纯化化产物物SDS-PAGE分析分析图；紫外分光光度法紫外分光光度法测定复性与定复性与纯化化产物含量物含量结果；果；荧光光光光谱表征复性前后的构象；表征复性前后的构象；五、实验结果与讨论五、实验结果与讨论大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化SECSEC复性复性rhG-CSFrhG-CSF的色谱图的色谱图实线代表代表rhG-CSF的洗脱曲的洗脱曲线，*表示复性的表示复性的rhG-CSF脲梯度脲梯度SECSEC复性复性rhG-CSFrhG-CSF的色谱图的色谱图五、实验结果与讨论五、实验结果与讨论- -色谱图色谱图大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化1231,rhG-CSF包涵体提取液包涵体提取液;2,分子量分子量标准蛋白准蛋白(从底部到从底部到顶部依次部依次为14,400;20,100;31,000;43,000;66,200;97,400Dalton);3,SEC复性并部分复性并部分纯化后的化后的rhG-CSF五、实验结果与讨论五、实验结果与讨论- -电泳分析电泳分析大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化进样量进样量 ( ( L) L)脲梯度脲梯度SECSEC的的比活比活 (10(107 7 IUIU/ /mg)mg)脲梯度脲梯度SECSEC的的质量回收率质量回收率 (%)(%)普通普通SECSEC的比的比活活(10(107 7 IUIU/ /mg)mg)普通普通SECSEC的质的质量回收率量回收率 (%)(%)10010012.853.212.331.431.420020012.152.811.930.130.150050010.446.18.124.724.77007008.941.77.019.119.1100010008.131.85.89.39.3脲梯度梯度SEC和普通和普通SEC对rhG-CSF复性的比复性的比较五、实验结果与讨论五、实验结果与讨论- -对比分析对比分析大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化五、实验结果与讨论五、实验结果与讨论- -蛋白的构象表征蛋白的构象表征圆二色谱法荧荧光光光光谱谱法法大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化使用超声波时应控制强度在一定的限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。产生泡沫会导致蛋白质变性。样品加上上样缓冲液煮沸后，一定要进行离心，以除去颗粒物质。电泳上样时要小心，不要污染旁边的泳道。在复性蛋白时，要注意一定要缓慢加入包涵体复性缓冲液，以防止变化太快造成蛋白质聚集析出。五、实验结果与讨论五、实验结果与讨论- -注意事项注意事项大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化六、实验延伸六、实验延伸-二硫键对接二硫键对接 ZhangL,ChouCP,Moo-YoungM.DisulfidebondformationanditsimpactonthebiologicalactivityandstabilityofrecombinanttherapeuticproteinsproducedbyEscherichiacoliexpressionsystem.BiotechnolAdv2011;29:9239大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化最具有代表性的是多维能量景观学说（multidimensional energy landscape)和折叠漏斗(folding funnel)模型。这两种机制都可以很好地预测蛋白的复性路径。蛋白折叠的漏斗形能量景观图六、实验延伸六、实验延伸-蛋白质折叠机制蛋白质折叠机制大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化实时核磁共振光谱可用来跟踪蛋白的折叠反应实时核磁共振光谱可用来跟踪蛋白的折叠反应六、实验延伸六、实验延伸-蛋白折叠研究新技术蛋白折叠研究新技术大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化思考题思考题蛋白蛋白质的的CD光光谱与其分子构象有何关系？与其分子构象有何关系？圆二二色性光色性光谱法可以法可以为蛋白蛋白质分子构象提供哪些信分子构象提供哪些信息？息？蛋白蛋白质的紫外光的紫外光谱与其分子构象有何关系？与其分子构象有何关系？该方法可以方法可以为蛋白蛋白质分子构象提供哪些信息？分子构象提供哪些信息？你能否通你能否通过关关键词，查阅和和设计一个有功能一个有功能细胞因子从基因克隆、表达与复性的胞因子从基因克隆、表达与复性的实验？大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化参考文献参考文献1.Wang CZ, Wang LL, Geng XD. Renaturation with simultaneous purification of rhG-CSF from Escherichia coli by ion exchange chromatography.Biome Chromatogr., 2007,21: 1291-12962.Wang CZ, Wang LL, Geng XD. Renaturation of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor produced from Escherichia coli using size exclusion chromatography, J Liquid Chromatogr. & Related Tech., 2006, 29:203-2173.Wang CZ, Wang LL, Geng XD. High recovery refolding of rhG-CSF from escherichia coli using urea gradient size exclusion chromatography. Biotechnol.Progr., 2008, 24(1): 209-2134.Clark ED.Protein refolding for industrial processes. Curr Opin Biotechnol. 2001; 12(2):202-207.5.Singh SM, Panda AK. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng, 2005, 99(4): 303-310.6.Geng XD, Wang CZ. Protein folding liquid chromatography and its recent developments. J Chromatogr B, 2007, 849: 69-80.7.Geng XD, Wang LL. Liquid chromatography of recombinant proteins and protein drugs. J Chromatogr B, 2008, 866: 133-153.大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化罗丹明基罗丹明基“OFF-ON”型荧光探针对金属离子的型荧光探针对金属离子的识别特性及其生物学应用识别特性及其生物学应用（选修）（选修）请预习下一个实验请预习下一个实验实验五实验五化学生物学化学生物学实验课程组实验课程组 李剑利李剑利大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化