动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术 动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养法和动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养法和悬浮培养法基础上，再融合了固定化细胞、流式悬浮培养法基础上，再融合了固定化细胞、流式细胞术、填充床、生物反应器技术以及人工灌流细胞术、填充床、生物反应器技术以及人工灌流等技术而发展起来的。主要包括悬浮培养、微载等技术而发展起来的。主要包括悬浮培养、微载体培养、微囊化培养、中空纤维法等。体培养、微囊化培养、中空纤维法等。如今这一技术已广泛应用于现代生物制药的研究如今这一技术已广泛应用于现代生物制药的研究和生产中。它的应用大大减少了用于疾病预防、和生产中。它的应用大大减少了用于疾病预防、治疗和诊断的实验动物，为生产疫苗、细胞因子、治疗和诊断的实验动物，为生产疫苗、细胞因子、生物产品乃至人造组织等产品提供了强有力的工生物产品乃至人造组织等产品提供了强有力的工具。具。1悬浮培养悬浮培养技术技术基本操作基本操作(1)将动物培养材料分散成细胞悬浮液将动物培养材料分散成细胞悬浮液过过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适宜滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适宜培养液的培养系统中。传代时按比例稀培养液的培养系统中。传代时按比例稀释即可继续培养。释即可继续培养。对贴壁性细胞，最初采用在培养液中加对贴壁性细胞，最初采用在培养液中加人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的贴壁面积。此方法构造简单，成本低，贴壁面积。此方法构造简单，成本低，重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的增加。但产率低，劳动强度大，占空间增加。但产率低，劳动强度大，占空间大。微载体系统培养贴壁细胞，一定程大。微载体系统培养贴壁细胞，一定程度上改变了以上这些不足。微载体是直度上改变了以上这些不足。微载体是直径径60250um的微珠。的微珠。2微载体培养技术微载体培养技术理想的细胞支持物应该具备特征：理想的细胞支持物应该具备特征：(1)生物相容性生物相容性(2)简便的无毒害固定化过程。简便的无毒害固定化过程。(3)良好的传质特性。良好的传质特性。(4)良好的机械稳定性。良好的机械稳定性。(5)最大的比表面积。最大的比表面积。(6)适合细胞生长的形状和大小。适合细胞生长的形状和大小。(7)粒径分布均一。粒径分布均一。(8)能高压灭菌。能高压灭菌。(9)可重复利用，易于清洗。可重复利用，易于清洗。(10)能保护细胞免受机械损伤。能保护细胞免受机械损伤。(11)接种方便。接种方便。(12)能固定大部分细胞。能固定大部分细胞。(13)适合大规模培养。适合大规模培养。(14)易使细胞、载体与培养基分离。易使细胞、载体与培养基分离。(15)适合于贴壁细胞和悬浮细胞的培养。适合于贴壁细胞和悬浮细胞的培养。微载体系统培养细胞的步骤是微载体系统培养细胞的步骤是：(1)选择合适的微载体类型选择合适的微载体类型(2)浸泡水化及消毒浸泡水化及消毒(3)接种接种(4)培养观察与细胞记数培养观察与细胞记数(5)(5)消化消化 ( (通常用酶消化法通常用酶消化法) )。采采用用胶胶原原酶酶消消化化比比胰胰蛋蛋白白酶酶- -EDTAEDTA法法可可获获得得更更完完整整的的细细胞胞膜膜和和更更高高的的细细胞胞活活性性。胶胶原原酶酶专专一一性性好好，不不损损伤伤细细胞胞膜膜，效效果果较好。较好。 (6) (6)分离细胞：分离细胞：对对于于回回收收率率要要求求不不高高的的细细胞胞种种类类，分分组组沉降简单易行。沉降简单易行。脱脱离离微微载载体体的的培培养养液液放放入入细细长长容容器器，于于上上清清液液中中分分离离收收集集细细胞胞，400400r rminmin，2min2min离离心心加加速速微载体沉淀。微载体沉淀。 (7) (7)传代培养：传代培养：如如果果进进行行放放大大培培养养，可可在在细细胞胞脱脱离离微微载载体体后后，加加入入一一些些新新的的微微载载体体以以增增大大培培养养体体积积，提提高高培培养养液液的的利利用用率率，不不过过此此法法比比全部用新微载体全部用新微载体的细胞得率要少。的细胞得率要少。尽量减少培养液中尽量减少培养液中Ca2+Ca2+浓度可促进微载浓度可促进微载体之间的细胞转移体之间的细胞转移。除了交联葡聚糖为基质的微载体除了交联葡聚糖为基质的微载体, ,还可采用以还可采用以下微载体：下微载体：1)1)纤维纤维素素为为基基质质微微载载体：体：2)2)蛋白质为基质微载体：变性胶原微载体，蛋蛋白质为基质微载体：变性胶原微载体，蛋黄色，表面特性好，易与细胞结合。黄色，表面特性好，易与细胞结合。3)3)高分子材料为基质微载体：高分子材料为基质微载体：4)4)无机玻璃基质微载体。无机玻璃基质微载体。 3 3 多孔载体培养多孔载体培养一优点一优点降降低低血血清清用用量量，增增加加细细胞胞固固定定性性。大大的的生生长长空空间间，免免受受机机械械损损伤伤，可可以以提提高高搅搅拌拌强强度度和和通通气气量量，强强化传质。化传质。多多孔孔载载体体不不仅仅能能培培养养贴贴壁壁细细胞胞，也也适适合合悬悬浮浮细细胞胞的固定化连续灌流培养。的固定化连续灌流培养。多多孔孔载载体体固固定定细细胞胞过过程程简简单单，对对细细胞胞无无毒毒害害和和损损伤伤，细细胞胞可可从从长长满满细细胞胞的的微微载载体体中中自自动动转转移移到到未未长长细细胞胞的的新新载载体体上上生生长长，接接种种方方便便，培培养养简简单单，特别适合于反应器大规模培养。特别适合于反应器大规模培养。多孔载体制备的材料选择多孔载体制备的材料选择主要考虑材料的生物相容性、机械稳定性和热稳主要考虑材料的生物相容性、机械稳定性和热稳(1）生物相容性：材料对细胞必须无毒害，）生物相容性：材料对细胞必须无毒害，对贴壁细胞有良好的黏附作用。对贴壁细胞有良好的黏附作用。(2)机械稳定性：微载体在长时间搅拌状态下机械稳定性：微载体在长时间搅拌状态下不破碎；同时满足微载体清洗处理、回收利用不破碎；同时满足微载体清洗处理、回收利用的要求。的要求。(3)热稳定性：在热稳定性：在121、蒸汽灭菌下不分解、蒸汽灭菌下不分解、不破碎、不软化。不破碎、不软化。4微囊化培养技术微囊化培养技术微囊是一种用人造的半透膜制成的多孔微球体，微囊是一种用人造的半透膜制成的多孔微球体，小分子物质可以自由透过，而各种酶、辅酶、小分子物质可以自由透过，而各种酶、辅酶、离子交换剂、活性炭及蛋白等大分子物质可包离子交换剂、活性炭及蛋白等大分子物质可包裹在其中不能逸出，利用它们催化反应底物。裹在其中不能逸出，利用它们催化反应底物。微囊化培养是借鉴固定化技术将细胞包裹在微微囊化培养是借鉴固定化技术将细胞包裹在微囊中，在培养液中悬浮培养。细胞生长在各自囊中，在培养液中悬浮培养。细胞生长在各自的微小环境里受到一定的保护，细胞总的生长的微小环境里受到一定的保护，细胞总的生长体积有了一定的增加，而且减少了搅拌对细胞体积有了一定的增加，而且减少了搅拌对细胞产生的剪切力。微囊化培养为单克隆抗体、干产生的剪切力。微囊化培养为单克隆抗体、干扰素等生产提供了有效途径。扰素等生产提供了有效途径。5中空纤维法中空纤维法中空纤维细胞培养技术是理查德中空纤维细胞培养技术是理查德克克瑞克等在瑞克等在1972年发明的。最初使用的空年发明的。最初使用的空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性膜，表面有许多海素混合组成的可透性膜，表面有许多海绵状多孔结构。这样，水分子、营养物绵状多孔结构。这样，水分子、营养物质和气体可以透过，细胞也可在上面帖质和气体可以透过，细胞也可在上面帖附生长。附生长。中空纤维细胞培养技术就是模拟细胞在体内生中空纤维细胞培养技术就是模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的长的三维状态，利用人工的“毛细血管毛细血管”中空纤维供给细胞生长的营养等条件。培养系中空纤维供给细胞生长的营养等条件。培养系统的核心部分由统的核心部分由3-6层这样的空心纤维组成，培层这样的空心纤维组成，培养时将待培养细胞接种于空心纤维的外腔。养时将待培养细胞接种于空心纤维的外腔。培养一段时间后，逐渐用无血培养基代替含血培养一段时间后，逐渐用无血培养基代替含血培养基。此时虽然细胞不再增殖，但能正常生培养基。此时虽然细胞不再增殖，但能正常生活并分泌所需的代谢产物。由手这种培养方法活并分泌所需的代谢产物。由手这种培养方法在分离和纯化分泌物时比较方便，因而在生产在分离和纯化分泌物时比较方便，因而在生产激素和单抗时经常采用。激素和单抗时经常采用。九九动物细胞生物反应器培养动物细胞生物反应器培养91生物反应器的特点分析生物反应器的特点分析由于动物细胞没有细胞壁、非常脆弱、对剪切由于动物细胞没有细胞壁、非常脆弱、对剪切敏感以及对体外培养环境有严格的要求，传统敏感以及对体外培养环境有严格的要求，传统的微生物发酵反应器不适用于动物细胞的大量的微生物发酵反应器不适用于动物细胞的大量培养，因而对动物细胞培养用反应器的设计和培养，因而对动物细胞培养用反应器的设计和过程控制提出了特殊的要求。细胞培养用生物过程控制提出了特殊的要求。细胞培养用生物反应器的种类越来越多，规模也越来越大，反反应器的种类越来越多，规模也越来越大，反应器的主要结构形式仍以搅拌式、气升式和固应器的主要结构形式仍以搅拌式、气升式和固定床为主。定床为主。用于动物细胞与组织培养的用于动物细胞与组织培养的生物反应器应具备的基本要求：生物反应器应具备的基本要求：(1)混合系统设计应能提供均匀、温和的混合状混合系统设计应能提供均匀、温和的混合状态，剪切力小，保证良好的传质效果。态，剪切力小，保证良好的传质效果。(2)反应器内反应器内空间利用率高空间利用率高，选用合适的载体系，选用合适的载体系统和材料。统和材料。(3)能严格保证能严格保证无菌无菌环境。环境。(4)能精确地控制温度、酸碱度、溶解氧和能精确地控制温度、酸碱度、溶解氧和C02浓度等条件。浓度等条件。(5)能够方便地实现能够方便地实现培养液的连续添加培养液的连续添加、样品的、样品的采样和观察。采样和观察。92生物反应器应用概况生物反应器应用概况采用生物反应器进行动物细胞培养是一种有效采用生物反应器进行动物细胞培养是一种有效的途径。但是，由于动物细胞、组织的多样性，的途径。但是，由于动物细胞、组织的多样性，使得在培养材料、培养环境等方面千差万别，使得在培养材料、培养环境等方面千差万别，因此，如何根据培养对象体内生存环境的特点，因此，如何根据培养对象体内生存环境的特点，开发合适的生物反应器模拟体内营养与环境进开发合适的生物反应器模拟体内营养与环境进行高效离体培养，并对培养条件、工艺等进行行高效离体培养，并对培养条件、工艺等进行优化将是重要的研究课题。优化将是重要的研究课题。动物细胞培养用生物反应器一般有微载体动物细胞培养用生物反应器一般有微载体式、中空纤维式、灌注培养式、旋转壁式等，式、中空纤维式、灌注培养式、旋转壁式等，几种新型的反应器类型特点介绍如下：几种新型的反应器类型特点介绍如下：( (一一) )柱状中空纤维反应器柱状中空纤维反应器中空纤维细胞反应器主体是由微孔中空纤维中空纤维细胞反应器主体是由微孔中空纤维管束制成的，纤维束由外壳包裹，因此可分为管束制成的，纤维束由外壳包裹，因此可分为壳体空间及管体空间两部分，每部分各有其进壳体空间及管体空间两部分，每部分各有其进出口。一般讲，细胞生长在壳体部分，新鲜培出口。一般讲，细胞生长在壳体部分，新鲜培养液从壳体部分导人，气体在管体部分通过，养液从壳体部分导人，气体在管体部分通过，其中一部分则均匀地扩散至壳体部分。壳体部其中一部分则均匀地扩散至壳体部分。壳体部分的细胞如是附壁性的，则附着在纤维外侧，分的细胞如是附壁性的，则附着在纤维外侧，在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其消化并冲在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其消化并冲出：若是非附壁性的应采用微滤材料将其截留出：若是非附壁性的应采用微滤材料将其截留在壳体内而让废培养液排出。在壳体内而让废培养液排出。( (二二) )板框式中空纤维反应器板框式中空纤维反应器因柱状中空纤维反应器中营养供应和代因柱状中空纤维反应器中营养供应和代谢产物会存在浓度梯度，所以细胞分布谢产物会存在浓度梯度，所以细胞分布受到影响而不均匀。受到影响而不均匀。人们开发出板框式中空纤维反应器。该人们开发出板框式中空纤维反应器。该反应器的中心是一束中空纤维浅床，置反应器的中心是一束中空纤维浅床，置于两个不锈钢微孔滤板之间。于两个不锈钢微孔滤板之间。板框式中空纤维反应器板框式中空纤维反应器液营养液营养中空纤维板中空纤维板三、中心灌流式反应器三、中心灌流式反应器四、四、灌流微载体生物反应器灌流微载体生物反应器( (五五) )旋转壁式反应器旋转壁式反应器一般由水平放置的内外两个同心圆柱组一般由水平放置的内外两个同心圆柱组成。静态的内柱由半透膜构成，使气体成。静态的内柱由半透膜构成，使气体可以通过该膜进行交换。旋转的外柱由可以通过该膜进行交换。旋转的外柱由非通透性材料制成。非通透性材料制成。10生物反应器动物细胞大规模培养生物反应器动物细胞大规模培养1.病毒疫苗病毒疫苗2.非抗体免疫调节剂非抗体免疫调节剂3.多肽生长因子多肽生长因子4.酶类酶类5.激素激素6.肿瘤特异性抗原肿瘤特异性抗原7.单克隆抗体单克隆抗体8.病毒杀虫剂病毒杀虫剂注意几个问题：注意几个问题：( (一一) )细胞培养环境细胞培养环境(1)氨离子：细胞培养环境中抑制因素的积聚氨离子：细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。是提高细胞密度的主要限制因素。(2)乳酸：乳酸：(3)二氧化碳：二氧化碳积聚，对细胞产生毒二氧化碳：二氧化碳积聚，对细胞产生毒性作用或者改变细胞代谢水平。性作用或者改变细胞代谢水平。(4)甲基乙二醛甲基乙二醛(Mc)：(5)渗透压：渗透压：(6)载体：可考虑采用多孔敬载体替代容易使载体：可考虑采用多孔敬载体替代容易使细胞受机械搅拌与喷气损伤的常规载体。细胞受机械搅拌与喷气损伤的常规载体。( (二二) )细胞死亡与凋亡细胞死亡与凋亡大规模细胞培养的后期，维持细胞高的活力是大规模细胞培养的后期，维持细胞高的活力是个富有挑战性的课题。最初的研究似乎表明细个富有挑战性的课题。最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死，而人们逐渐认识到至少胞死亡大多由于坏死，而人们逐渐认识到至少是一些细胞系在生物反应器中死亡主要原因是是一些细胞系在生物反应器中死亡主要原因是细胞凋亡。细胞凋亡。用基因工程方法将用基因工程方法将bcl2基因这种细胞凋亡基因这种细胞凋亡抑制基因导入细胞。抑制基因导入细胞。bcl2基因的过量表达能基因的过量表达能抑制细胞凋亡，提高细胞密度和目的蛋白产量。抑制细胞凋亡，提高细胞密度和目的蛋白产量。大规模动物细胞培养条件下，可通过大规模动物细胞培养条件下，可通过“细胞静止细胞静止”过程来降低营养成分消耗和代谢毒物产生。过程来降低营养成分消耗和代谢毒物产生。( (三三) ) 培养基与细胞系培养基与细胞系动物细胞培养基是细胞赖以生长、增殖的重动物细胞培养基是细胞赖以生长、增殖的重要因素。天然培养基、合成培养基后，无血清要因素。天然培养基、合成培养基后，无血清培养基开发成为当今细胞领域的一大课题。培养基开发成为当今细胞领域的一大课题。无血清培养基的优势在于避免血清的批次、质无血清培养基的优势在于避免血清的批次、质量、成分等对细胞造成的污染、毒性和不利于量、成分等对细胞造成的污染、毒性和不利于产品纯化等不良影响。产品纯化等不良影响。在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养。的产物的环境中维持高密度培养。( (四四) )过程监控过程监控测量在线氧吸收速率确定从细胞生长期测量在线氧吸收速率确定从细胞生长期生产病毒到病毒感染期和细胞死亡后终生产病毒到病毒感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间；用在线葡萄糖分析止感染的转换时间；用在线葡萄糖分析仪的测定调整灌流速度；测定氧消耗估仪的测定调整灌流速度；测定氧消耗估计营养供应率的代谢负荷；测定氧吸收计营养供应率的代谢负荷；测定氧吸收速率估测速率估测ATP的形成；测量在线氧化还的形成；测量在线氧化还原能力作为活细胞浓度的指标等均得以原能力作为活细胞浓度的指标等均得以应用。应用。测定在线氧吸收速率并用质谱仪分析废测定在线氧吸收速率并用质谱仪分析废气中二氧化碳呼出率计算呼吸商。一般气中二氧化碳呼出率计算呼吸商。一般来说，呼吸商应接近来说，呼吸商应接近1.0，这就要求细胞，这就要求细胞培养中尽量降低氧消耗和二氧化碳排出。培养中尽量降低氧消耗和二氧化碳排出。用亲和层析与在线取样系统偶联进行在线用亲和层析与在线取样系统偶联进行在线蛋白质含量测定。另外，用在线蛋白分解与蛋白质含量测定。另外，用在线蛋白分解与反相色谱监测重组蛋白的糖基化以了解产品反相色谱监测重组蛋白的糖基化以了解产品的一致性。的一致性。计数法计数法(细胞运输)当前培养细胞既在国内进行寄赠、交换和购买，当前培养细胞既在国内进行寄赠、交换和购买，也在国际交流，为此需要装运细胞的方法。也在国际交流，为此需要装运细胞的方法。一种是用液氮或干冰贮存运输，需要特殊容器，一种是用液氮或干冰贮存运输，需要特殊容器，较麻烦，且不适于长时间运行。另一方法为充液法，较麻烦，且不适于长时间运行。另一方法为充液法，方便当行，是当前多采用的方法。方便当行，是当前多采用的方法。具体方法：具体方法： 选生长状态良好的细胞，待培养近单选生长状态良好的细胞，待培养近单层后，去掉培养液充满新培养液。液量要达培养层后，去掉培养液充满新培养液。液量要达培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞一吸塞，保留微量空气。空气瓶颈部，拧紧螺帽或塞一吸塞，保留微量空气。空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。作用。一般经一般经4 45 5天运输对细胞活力无大影响。时间过天运输对细胞活力无大影响。时间过长长, ,细胞活力下降。细胞活力下降。 到达后，倒出大部分培养液，到达后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所需的液体量。置保留维持细胞生长所需的液体量。置3737摄氏度培养，摄氏度培养，次日传代。次日传代。十一十一 动物细胞体外培养举例动物细胞体外培养举例肿瘤细胞的体外培养与建系过程肿瘤细胞的体外培养与建系过程体外培养肿瘤细胞的历史一定程度上代表了体外培养肿瘤细胞的历史一定程度上代表了动物细胞体外培养的发展历史。动物细胞体外培养的发展历史。1952年，盖尔年，盖尔(Gey)首先成功地建立世界上首先成功地建立世界上第一个细胞系第一个细胞系子宫颈癌细胞的细胞系，并子宫颈癌细胞的细胞系，并且使恶性肿瘤细胞的培养从间叶组织源性的细且使恶性肿瘤细胞的培养从间叶组织源性的细胞转向上皮源性细胞。胞转向上皮源性细胞。肿瘤细胞培养的发展成就主要体肿瘤细胞培养的发展成就主要体现在以下几个方面：现在以下几个方面：(1)在培养的肿瘤细胞类型上，从间充质源性的细胞在培养的肿瘤细胞类型上，从间充质源性的细胞转向上皮源性细胞，再由神经外胚层源性到造血转向上皮源性细胞，再由神经外胚层源性到造血细胞源性的发展历程。细胞源性的发展历程。(2)在方法上，从原代培养到传代培养、再到细胞系在方法上，从原代培养到传代培养、再到细胞系的建立的发展过程。的建立的发展过程。(3)培养液成分上，由纯血清培养基到含血清、再到培养液成分上，由纯血清培养基到含血清、再到无血清培养基三个阶段。无血清培养基三个阶段。(4)生物学特性上，经历了从细胞水平到亚细胞水生物学特性上，经历了从细胞水平到亚细胞水平，再到酶和分子水平的发展。平，再到酶和分子水平的发展。原代培养物经首次传代后，能在体外原代培养物经首次传代后，能在体外继续生长繁殖的细胞即为细胞系。然而，继续生长繁殖的细胞即为细胞系。然而，这并不意味着细胞能永久生长。可能过这并不意味着细胞能永久生长。可能过了若干代后，由于微生物污染、细胞分了若干代后，由于微生物污染、细胞分化成熟、细胞不适应外界环境等因素影化成熟、细胞不适应外界环境等因素影响而丧失分裂能力。根据细胞分裂能力，响而丧失分裂能力。根据细胞分裂能力，可分为有限细胞系与无限细胞系两类。可分为有限细胞系与无限细胞系两类。一般认为，如果细胞能在体外培养超过一般认为，如果细胞能在体外培养超过50代，培养时间超过一年，而且细胞的代，培养时间超过一年，而且细胞的倍增时间保持稳定时，就可以认为倍增时间保持稳定时，就可以认为建系建系成功成功。人上皮型鼻咽癌人上皮型鼻咽癌CNE-2CNE-2细胞系为例细胞系为例建系过程：建系过程：(1)取材取材(2)原代培养原代培养(3)(3)建系过程建系过程组织块在接种组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速迁移和生长。迁移和生长。2周后，可见成纤维细胞生长。周后，可见成纤维细胞生长。8周后，周后，上皮细胞生长开始明显加快上皮细胞生长开始明显加快.细胞在传代三次后细胞在传代三次后贴壁生长的细胞呈现上皮状。贴壁生长的细胞呈现上皮状。2周后细胞形成群落。第周后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长代后细胞开始呈单层生长,命命名为名为CNE-2。经生物学特性分析后确定细胞系建立成经生物学特性分析后确定细胞系建立成功功.