传染病暴发疫情应急检测1 1一、实验室检测在传染病疫情中的作用公共卫生公共卫生疾病预防控制疾病预防控制体系体系应急反应应急反应 体系体系医疗救助医疗救助体系体系卫生监督卫生监督执法体系执法体系四个体系四个体系教育培训教育培训人才队伍人才队伍公共卫生立法公共卫生立法运行保障运行保障科研科研工作依托工作依托国家突发公共卫生事件应急预案国家突发公共卫生事件应急预案2 2. .一、实验室检测在传染病疫情中的作用传传染染病病暴暴发发疫疫情情处处置置流流程程3 3一、实验室检测在传染病疫情中的作用4 4 传染病疫情的核实、处置、总结评传染病疫情的核实、处置、总结评价等方面离不开价等方面离不开实验室检测结果实验室检测结果的支的支持。如传染病的诊断应包括流行病资持。如传染病的诊断应包括流行病资料、临床病史、体格检查和实验室检料、临床病史、体格检查和实验室检验结果等，再者验结果等，再者病原体的检出病原体的检出是确诊是确诊传染病的主要依据。传染病的主要依据。一、实验室检测在传染病疫情中的作用5 5二、标本采集与运输n临床标本的采集可以分为：临床标本的采集可以分为： 用于病原分离或检测抗原用的标本，包括用于病原分离或检测抗原用的标本，包括粪便、咽拭子、痰液、尿液、血液、脑脊粪便、咽拭子、痰液、尿液、血液、脑脊液等；液等；用于病原抗体检测的标本，通常包括急性用于病原抗体检测的标本，通常包括急性期和恢复期血清、脑脊液。期和恢复期血清、脑脊液。n尸体标本：采集有病理变化的脏器或组织。尸体标本：采集有病理变化的脏器或组织。n注意无菌操作，尽量避免污染。注意无菌操作，尽量避免污染。6 6 1.1.粪便标本粪便标本 采集病人发病采集病人发病7 7日内的粪便标本用于病日内的粪便标本用于病原检测。粪便标本采集量原检测。粪便标本采集量5 58g/8g/份，采集份，采集后立即放入无菌采便管内并密封，后立即放入无菌采便管内并密封，44暂暂存立即存立即(12h(12h内内) )送达实验室，送达实验室，2020以下以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于7070冰箱。冰箱。（一）标本采集（一）标本采集7 7 2.2.肛拭子肛拭子 采集病人发病采集病人发病7 7日内的肛拭子标本用日内的肛拭子标本用于病原检测。用采样棉签沾取少量生理盐于病原检测。用采样棉签沾取少量生理盐水，适度用力插入患者肛门，同一方向旋水，适度用力插入患者肛门，同一方向旋转采样棉签，取出棉签放入装有转采样棉签，取出棉签放入装有3 35ml5ml保保存液（维持液、或生理盐水，推荐使用维存液（维持液、或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。签杆，旋紧管盖并密封。8 8 3.3.咽拭子咽拭子 采集病人发病采集病人发病3 3日内的咽拭子标本，日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签用于病原检测。用专用采样棉签, ,适度用适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位, ,应避免应避免触及舌部触及舌部; ;迅速将棉签放入装有迅速将棉签放入装有3 35ml5ml保保存液（维持液或生理盐水）的采样管中存液（维持液或生理盐水）的采样管中, ,在靠近顶端处折断棉签杆在靠近顶端处折断棉签杆, ,旋紧管盖并密旋紧管盖并密封。封。9 9 4.4.疱疹液疱疹液 局部皮肤消毒后局部皮肤消毒后( (建议使用建议使用75%75%酒精酒精, ,不能使用碘酒不能使用碘酒),),用消毒针将疱疹挑破用用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装3 3 5ml5ml病毒保存液（维持液或生理盐水，病毒保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。可同时采集同一病例的多个疱疹作为一可同时采集同一病例的多个疱疹作为一份标本。份标本。10105.5.血液样本的采集：血液样本的采集：作血液病原培养、核酸检作血液病原培养、核酸检测时测时, ,严格用无菌穿刺法采静脉血，移入无严格用无菌穿刺法采静脉血，移入无菌的有螺口的抗凝的容器或培养瓶中送检。菌的有螺口的抗凝的容器或培养瓶中送检。6.6.血清标本：血清标本：采集急性期采集急性期( (发病发病0 05d)5d)和恢复和恢复期期( (发病发病1414 30d)30d)双份配对血清用于抗体检双份配对血清用于抗体检测。检测测。检测IgMIgM时时, ,采集采集( (发病发病7 720d)20d)血。静脉血。静脉采集采集3 35ml5ml全血全血, ,置于真空无菌采血管中置于真空无菌采血管中, ,自自凝后凝后, ,离心分离血清于无菌带垫圈的血清管离心分离血清于无菌带垫圈的血清管中中, ,旋紧管盖并密封。旋紧管盖并密封。11117.7.脑脊液标本：脑脊液标本：出现神经系统症状的病例出现神经系统症状的病例, ,要要采集脑脊液标本采集脑脊液标本, ,进行病原和抗体检测。采进行病原和抗体检测。采集时间为出现神经系统症状后集时间为出现神经系统症状后3 3日内日内, ,采集采集量为量为1.01.02.0ml2.0ml。采集后立即装入无菌带。采集后立即装入无菌带垫圈的血清管中垫圈的血清管中, ,旋紧管盖并密封。旋紧管盖并密封。8.8.尿液采集：尿液采集：中段尿采集法，先用肥皂水清中段尿采集法，先用肥皂水清洗外阴部，再以无菌水洗净，一般取首次洗外阴部，再以无菌水洗净，一般取首次晨尿的中段尿晨尿的中段尿101020ml20ml于无菌试管内。于无菌试管内。 12129.9.尸体标本的采集：尸体标本的采集：取尸体标本时每个标本取尸体标本时每个标本用单独的无菌活检针至少取用单独的无菌活检针至少取1 12g2g感染部位感染部位标本，放入单独的装有相应培养基的无菌标本，放入单独的装有相应培养基的无菌容器中。容器中。1313（二）标本运输所有采集标本所有采集标本所有采集标本所有采集标本4444暂存立即（暂存立即（暂存立即（暂存立即（12h12h12h12h内）送达实验内）送达实验内）送达实验内）送达实验室室室室, , , ,如不能立即运送，用于细菌分离培养如不能立即运送，用于细菌分离培养如不能立即运送，用于细菌分离培养如不能立即运送，用于细菌分离培养4444保保保保藏，病毒分离藏，病毒分离藏，病毒分离藏，病毒分离20202020以下低温冷冻保藏。以下低温冷冻保藏。以下低温冷冻保藏。以下低温冷冻保藏。临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融, , , ,如果不能确保如果不能确保如果不能确保如果不能确保20202020的条件，应该在的条件，应该在的条件，应该在的条件，应该在0 0 0 08888运运运运输和保存。输和保存。输和保存。输和保存。标本运输时要附有采送样登记表，包含必要信标本运输时要附有采送样登记表，包含必要信标本运输时要附有采送样登记表，包含必要信标本运输时要附有采送样登记表，包含必要信息息息息, , , ,如标本编号如标本编号如标本编号如标本编号, , , ,发病日期和标本采集日期等。发病日期和标本采集日期等。发病日期和标本采集日期等。发病日期和标本采集日期等。1414三、现场快速微生物检查方法直接从临床标本中检查微生物抗原直接从临床标本中检查微生物抗原直接从临床标本中检查微生物抗原直接从临床标本中检查微生物抗原检查某些细菌的专有酶进行快速鉴定检查某些细菌的专有酶进行快速鉴定检查某些细菌的专有酶进行快速鉴定检查某些细菌的专有酶进行快速鉴定快速检测细菌生化反应的色原或荧光底物及成套快速检测细菌生化反应的色原或荧光底物及成套快速检测细菌生化反应的色原或荧光底物及成套快速检测细菌生化反应的色原或荧光底物及成套鉴定系统鉴定系统鉴定系统鉴定系统 应用不同载体的快速凝集试剂检查与鉴定微生物应用不同载体的快速凝集试剂检查与鉴定微生物应用不同载体的快速凝集试剂检查与鉴定微生物应用不同载体的快速凝集试剂检查与鉴定微生物 快速检出细菌的毒素快速检出细菌的毒素快速检出细菌的毒素快速检出细菌的毒素 微生物快速检测仪器微生物快速检测仪器微生物快速检测仪器微生物快速检测仪器 1515三、现场快速微生物检查方法 炭疽杆菌抗原检、抗体测试剂（胶体金法）炭疽杆菌抗原检、抗体测试剂（胶体金法）炭疽杆菌抗原检、抗体测试剂（胶体金法）炭疽杆菌抗原检、抗体测试剂（胶体金法）土拉热菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）土拉热菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）土拉热菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）土拉热菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）鼠疫菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）鼠疫菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）鼠疫菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）鼠疫菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）布鲁氏菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）布鲁氏菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）布鲁氏菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）布鲁氏菌抗原、抗体检测试剂（胶体金法）A A A A型肉毒毒素检测试剂（胶体金法）型肉毒毒素检测试剂（胶体金法）型肉毒毒素检测试剂（胶体金法）型肉毒毒素检测试剂（胶体金法）B B B B型葡萄球菌肠毒素检测试剂（胶体金法）型葡萄球菌肠毒素检测试剂（胶体金法）型葡萄球菌肠毒素检测试剂（胶体金法）型葡萄球菌肠毒素检测试剂（胶体金法）沙眼衣原体、肺炎支原体、沙眼衣原体、肺炎支原体、沙眼衣原体、肺炎支原体、沙眼衣原体、肺炎支原体、出血热出血热出血热出血热等快速检等快速检等快速检等快速检测试剂测试剂测试剂测试剂优点：检测速度快优点：检测速度快优点：检测速度快优点：检测速度快 缺点：假阳性率高缺点：假阳性率高缺点：假阳性率高缺点：假阳性率高1616三、现场快速微生物检查方法直接涂片染色后镜检适用于形态和染色上具直接涂片染色后镜检适用于形态和染色上具有特征性的病原菌。例如痰中查见抗酸性有特征性的病原菌。例如痰中查见抗酸性细长杆菌，脓液中发现革兰氏阳性葡萄串细长杆菌，脓液中发现革兰氏阳性葡萄串状球菌，咽喉假膜中有异染颗粒的棒状杆状球菌，咽喉假膜中有异染颗粒的棒状杆菌及菌及霍乱弧菌霍乱弧菌、艰难梭菌等。、艰难梭菌等。p优点是方便快捷，缺点是适用范围小。优点是方便快捷，缺点是适用范围小。1717四、实验室检测方法1.1.病原分离病原分离n 细菌的分离培养细菌的分离培养有正常菌群存在部位所取标本（如粪便），有正常菌群存在部位所取标本（如粪便），应应 接种至选择或鉴别性培养基。接种至选择或鉴别性培养基。无菌部位采集的脑脊液、血液等标本，可无菌部位采集的脑脊液、血液等标本，可直接直接 接种至营养丰富的液体或固体培养基。接种至营养丰富的液体或固体培养基。1818 细菌的鉴定细菌的鉴定生化鉴定：生化代谢特征是鉴定病原菌的重要方生化鉴定：生化代谢特征是鉴定病原菌的重要方生化鉴定：生化代谢特征是鉴定病原菌的重要方生化鉴定：生化代谢特征是鉴定病原菌的重要方法之一，如糖发酵试验；现有多种微量、快速、法之一，如糖发酵试验；现有多种微量、快速、法之一，如糖发酵试验；现有多种微量、快速、法之一，如糖发酵试验；现有多种微量、快速、半自动或全自动细菌生化反应试剂盒和检测仪器半自动或全自动细菌生化反应试剂盒和检测仪器半自动或全自动细菌生化反应试剂盒和检测仪器半自动或全自动细菌生化反应试剂盒和检测仪器, , , ,极大方便了菌株鉴定工作极大方便了菌株鉴定工作极大方便了菌株鉴定工作极大方便了菌株鉴定工作. . . .血清鉴定与分型：利用已知的特异抗体的诊断血血清鉴定与分型：利用已知的特异抗体的诊断血血清鉴定与分型：利用已知的特异抗体的诊断血血清鉴定与分型：利用已知的特异抗体的诊断血清可以确定细菌的种和型。常用方法是玻片凝集清可以确定细菌的种和型。常用方法是玻片凝集清可以确定细菌的种和型。常用方法是玻片凝集清可以确定细菌的种和型。常用方法是玻片凝集实验，在数分钟内能可得出结果。实验，在数分钟内能可得出结果。实验，在数分钟内能可得出结果。实验，在数分钟内能可得出结果。1919p 缺点：耗时长（需缺点：耗时长（需484872h72h），过程繁琐。），过程繁琐。p 优点：能获得病原菌，特异性为优点：能获得病原菌，特异性为100%100%，是许多是许多 细菌性传染病实验室确诊的最重要证据。细菌性传染病实验室确诊的最重要证据。 因此，在暴发疫情中要求尽可能进行病因此，在暴发疫情中要求尽可能进行病原菌分离来获得实验室确诊证据。原菌分离来获得实验室确诊证据。2020n 病毒分离培养病毒分离培养 鸡胚培养鸡胚培养动物接种动物接种组织培养组织培养2121病毒分离（细胞）鉴定的一般流程PCRRT-PCR / sequencing TaqMan RT-PCRDNA microarrayNASBALAMP 结果判定结果判定接种细胞接种细胞阴性结果判定标本采集标本采集细胞病变细胞病变病变观察(连续3代)标本处理细胞无病变细胞无病变ELISA检测免疫荧光中和试验血凝及抑止试验补体结合试验.血清学鉴定血清学鉴定分子生物分子生物学鉴定学鉴定蚊虫标本、血清、CSF、尸检组织标本鉴鉴定定2222病毒形态学鉴定病毒形态学鉴定观察观察CPECPE，常见的细胞形态学变化为细胞变圆、坏死、，常见的细胞形态学变化为细胞变圆、坏死、溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。正常细胞正常细胞病变细胞病变细胞2323A：正常：正常Hep-2细胞；细胞； B：发生：发生CPE后的后的 Hep-2细胞；细胞；C：正常：正常RD细胞；细胞； D：发生：发生CPE后的后的RD 细胞细胞24242.核酸检测n RT-PCRRT-PCR检测方法检测方法 聚合酶链反应聚合酶链反应聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain (Polymerase Chain (Polymerase Chain (Polymerase Chain Reaction,PCR)Reaction,PCR)Reaction,PCR)Reaction,PCR)是是是是80808080年代中期发展起来的体外核酸年代中期发展起来的体外核酸年代中期发展起来的体外核酸年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。能在一个试管内将所要研究的目的基扩增技术。能在一个试管内将所要研究的目的基扩增技术。能在一个试管内将所要研究的目的基扩增技术。能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一因或某一因或某一因或某一DNADNADNADNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万片段于数小时内扩增至十万乃至百万片段于数小时内扩增至十万乃至百万片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍倍倍倍, , , ,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNADNADNADNA供分析研供分析研供分析研供分析研究和检测鉴定。究和检测鉴定。究和检测鉴定。究和检测鉴定。PCRPCRPCRPCR技术是生物医学领域中的一项技术是生物医学领域中的一项技术是生物医学领域中的一项技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。革命性创举和里程碑。革命性创举和里程碑。革命性创举和里程碑。2525PCRPCRPCRPCR技术简史技术简史技术简史技术简史PCRPCRPCRPCR的最早设想核酸研究已有的最早设想核酸研究已有的最早设想核酸研究已有的最早设想核酸研究已有100100100100多年的历史。多年的历史。多年的历史。多年的历史。 1971197119711971年年年年KoranaKoranaKoranaKorana最早提出核酸体外扩增的设想。最早提出核酸体外扩增的设想。最早提出核酸体外扩增的设想。最早提出核酸体外扩增的设想。1985198519851985年美国年美国年美国年美国PE-CetusPE-CetusPE-CetusPE-Cetus公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的Mullis Mullis Mullis Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链等发明了具有划时代意义的聚合酶链等发明了具有划时代意义的聚合酶链等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于反应。其原理类似于反应。其原理类似于反应。其原理类似于DNADNADNADNA的体内复制。的体内复制。的体内复制。的体内复制。PCRPCRPCRPCR的改进与完善的改进与完善的改进与完善的改进与完善 DNADNADNADNA聚合酶：大肠杆菌聚合酶：大肠杆菌聚合酶：大肠杆菌聚合酶：大肠杆菌 DNA DNA DNA DNA 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 I I I I 的的的的KlenowKlenowKlenowKlenow片段片段片段片段 T4 DNAT4 DNAT4 DNAT4 DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 耐热耐热耐热耐热DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶( ( ( (一株水生嗜热杆菌中提取一株水生嗜热杆菌中提取一株水生嗜热杆菌中提取一株水生嗜热杆菌中提取) ) ) )PCRPCRPCRPCR仪仪仪仪2626用途广泛：用途广泛：生命学科生命学科医学工程医学工程遗传工程遗传工程疾病诊断疾病诊断法医学法医学考古学考古学MullisMullisMullisMullis荣获荣获荣获荣获1993199319931993年度诺贝尔化学奖年度诺贝尔化学奖年度诺贝尔化学奖年度诺贝尔化学奖2727RT-PCRRT-PCR基本原理基本原理逆转录酶逆转录酶DNA聚合酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCRPCR扩增扩增2828提取核酸模板（病毒RNA模板为例）RNARNA提取试剂盒方法提取试剂盒方法试剂准备试剂准备试剂准备试剂准备( ( ( (按照试剂盒说明书操作按照试剂盒说明书操作按照试剂盒说明书操作按照试剂盒说明书操作) ) ) ) ：a Carrier RNAa Carrier RNAa Carrier RNAa Carrier RNA储存液配制：储存液配制：储存液配制：储存液配制： Carrier RNACarrier RNACarrier RNACarrier RNA冻干粉溶解于冻干粉溶解于冻干粉溶解于冻干粉溶解于无无无无RNARNARNARNA酶水中，储存液的浓度一般为酶水中，储存液的浓度一般为酶水中，储存液的浓度一般为酶水中，储存液的浓度一般为1 ug/uL1 ug/uL1 ug/uL1 ug/uL，并进行分，并进行分，并进行分，并进行分装，避免反复冻融。装，避免反复冻融。装，避免反复冻融。装，避免反复冻融。b Carrier RNAb Carrier RNAb Carrier RNAb Carrier RNA工作液配置：根据样品的数量计算所需裂工作液配置：根据样品的数量计算所需裂工作液配置：根据样品的数量计算所需裂工作液配置：根据样品的数量计算所需裂解液解液解液解液RLRLRLRL和和和和Carrier RNACarrier RNACarrier RNACarrier RNA溶液的体积，将裂解液溶液的体积，将裂解液溶液的体积，将裂解液溶液的体积，将裂解液RLRLRLRL与与与与Carrier RNACarrier RNACarrier RNACarrier RNA溶液颠倒混匀，即得到溶液颠倒混匀，即得到溶液颠倒混匀，即得到溶液颠倒混匀，即得到Carrier RNACarrier RNACarrier RNACarrier RNA工作液。工作液。工作液。工作液。最好现用现配，工作液最好现用现配，工作液最好现用现配，工作液最好现用现配，工作液2-82-82-82-8保存不超过保存不超过保存不超过保存不超过48484848小时。小时。小时。小时。c c c c 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液GDGDGDGD、漂洗液、漂洗液、漂洗液、漂洗液RW RW RW RW 为浓缩液，第一次使用前加入无为浓缩液，第一次使用前加入无为浓缩液，第一次使用前加入无为浓缩液，第一次使用前加入无水乙醇（试剂瓶上标注的量）混匀，室温可储存水乙醇（试剂瓶上标注的量）混匀，室温可储存水乙醇（试剂瓶上标注的量）混匀，室温可储存水乙醇（试剂瓶上标注的量）混匀，室温可储存1 1 1 1年。年。年。年。2929提取病毒RNA模板：a.a.a.a.吸取吸取吸取吸取560 560 560 560 l l l l 含有含有含有含有Carrier RNACarrier RNACarrier RNACarrier RNA的的的的RLRLRLRL到到到到1.5ml Ep1.5ml Ep1.5ml Ep1.5ml Ep离心管中。离心管中。离心管中。离心管中。b.b.b.b.加加加加140 140 140 140 l 1l 1l 1l 1标本到上述离心管中，回旋振荡标本到上述离心管中，回旋振荡标本到上述离心管中，回旋振荡标本到上述离心管中，回旋振荡15151515秒。室温（秒。室温（秒。室温（秒。室温（1515151525252525）孵育）孵育）孵育）孵育10 min10 min10 min10 min。短暂离。短暂离。短暂离。短暂离心一次。心一次。心一次。心一次。c.c.c.c.加加加加560 560 560 560 l l l l乙醇（乙醇（乙醇（乙醇（96969696100100100100）到离心管中，盖上离心管帽，回旋振荡）到离心管中，盖上离心管帽，回旋振荡）到离心管中，盖上离心管帽，回旋振荡）到离心管中，盖上离心管帽，回旋振荡15151515秒。短暂离心一次。秒。短暂离心一次。秒。短暂离心一次。秒。短暂离心一次。d.d.d.d.从离心管中吸取从离心管中吸取从离心管中吸取从离心管中吸取630 630 630 630 l l l l溶液至溶液至溶液至溶液至Rnase-freeRnase-freeRnase-freeRnase-free吸附柱吸附柱吸附柱吸附柱CR2CR2CR2CR2中，中，中，中，6000g6000g6000g6000g（8000rpm8000rpm8000rpm8000rpm）离心）离心）离心）离心1 min1 min1 min1 min。弃。弃。弃。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。掉滤液，将套管套回原吸附柱中。掉滤液，将套管套回原吸附柱中。掉滤液，将套管套回原吸附柱中。e.e.e.e.加加加加500 500 500 500 l l l l 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液GDGDGDGD，6000g6000g6000g6000g（8000rpm8000rpm8000rpm8000rpm）离心）离心）离心）离心1 min1 min1 min1 min。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。f.f.f.f.加加加加500 500 500 500 l l l l漂洗液漂洗液漂洗液漂洗液RWRWRWRW，6000g6000g6000g6000g（8000rpm8000rpm8000rpm8000rpm）离心）离心）离心）离心1 min1 min1 min1 min。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。g.g.g.g.13400g13400g13400g13400g（12000rpm12000rpm12000rpm12000rpm）离心）离心）离心）离心3 min3 min3 min3 min。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。弃掉滤液，将套管套回原吸附柱中。h.h.h.h.打开吸附柱盖子，室温放置打开吸附柱盖子，室温放置打开吸附柱盖子，室温放置打开吸附柱盖子，室温放置3min3min3min3min，使吸附膜完全变干。，使吸附膜完全变干。，使吸附膜完全变干。，使吸附膜完全变干。i.i.i.i.将吸附柱放入一个新的将吸附柱放入一个新的将吸附柱放入一个新的将吸附柱放入一个新的1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 无无无无RNARNARNARNA酶离心管中，加入酶离心管中，加入酶离心管中，加入酶离心管中，加入60606060 l Rnasel Rnasel Rnasel Rnasefree ddH2Ofree ddH2Ofree ddH2Ofree ddH2O，盖上盖，盖上盖，盖上盖，盖上盖子，在室温孵育子，在室温孵育子，在室温孵育子，在室温孵育5min5min5min5min，6000g6000g6000g6000g（8000rpm8000rpm8000rpm8000rpm）离心）离心）离心）离心1 min1 min1 min1 min。j.j.j.j.提取的病毒提取的病毒提取的病毒提取的病毒RNARNARNARNA模板可立即进行逆转录，或贮存于模板可立即进行逆转录，或贮存于模板可立即进行逆转录，或贮存于模板可立即进行逆转录，或贮存于70707070备用。备用。备用。备用。3030全自动核酸提取简介全自动核酸提取简介313132323333343435353636RTPCR反应条件:50 4050 4050 4050 40分钟；分钟；分钟；分钟；94 594 594 594 5分钟；分钟；分钟；分钟；94 3094 3094 3094 30秒，秒，秒，秒，50 4050 4050 4050 40秒，秒，秒，秒，65 5065 5065 5065 50秒，秒，秒，秒，35353535个循环；个循环；个循环；个循环；65 1065 1065 1065 10分钟。分钟。分钟。分钟。（总时间约（总时间约（总时间约（总时间约170170170170分钟）分钟）分钟）分钟）3737电泳分析结果1.1.1.1.用用用用1 1 1 1 TAETAETAETAE配制配制配制配制% % % %的琼脂糖凝胶，加热融解后，加入的琼脂糖凝胶，加热融解后，加入的琼脂糖凝胶，加热融解后，加入的琼脂糖凝胶，加热融解后，加入GOLDVIEWGOLDVIEWGOLDVIEWGOLDVIEW( ( ( (/100mL),/100mL),/100mL),/100mL),待凝胶冷却至待凝胶冷却至待凝胶冷却至待凝胶冷却至5050505070707070左右，倒入胶槽，等胶左右，倒入胶槽，等胶左右，倒入胶槽，等胶左右，倒入胶槽，等胶凝固后放在电泳装置上；凝固后放在电泳装置上；凝固后放在电泳装置上；凝固后放在电泳装置上；2.2.2.2.在帕拉膜（在帕拉膜（在帕拉膜（在帕拉膜（ParafilmParafilmParafilmParafilm）上加上）上加上）上加上）上加上6 6 6 6 电泳载样缓冲液（每个反应电泳载样缓冲液（每个反应电泳载样缓冲液（每个反应电泳载样缓冲液（每个反应需需需需1l1l1l1l）。再加上）。再加上）。再加上）。再加上5l5l5l5l的的的的PCRPCRPCRPCR反应产物与之混合；反应产物与之混合；反应产物与之混合；反应产物与之混合；3.3.3.3.将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混合溶液加到孔中；合溶液加到孔中；合溶液加到孔中；合溶液加到孔中；4.4.4.4.盖上盖子，接通电源，以盖上盖子，接通电源，以盖上盖子，接通电源，以盖上盖子，接通电源，以 5V/cm 5V/cm 5V/cm 5V/cm 电压（恒定电压）电泳，大约电压（恒定电压）电泳，大约电压（恒定电压）电泳，大约电压（恒定电压）电泳，大约35-40min35-40min35-40min35-40min，直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳；，直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳；，直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳；，直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳；38385. 5. 5. 5. 在紫外透射仪下观察在紫外透射仪下观察在紫外透射仪下观察在紫外透射仪下观察PCRPCRPCRPCR产物电泳结果，并照相作产物电泳结果，并照相作产物电泳结果，并照相作产物电泳结果，并照相作记录。记录。记录。记录。3939RT-PCR 质量控制1.1.1.1.提取提取提取提取RNARNARNARNA：选择一个：选择一个：选择一个：选择一个EV71EV71EV71EV71阳性标本同时提取作对照；阳性标本同时提取作对照；阳性标本同时提取作对照；阳性标本同时提取作对照；2.2.2.2.PCRPCRPCRPCR扩增：选择至少一个扩增：选择至少一个扩增：选择至少一个扩增：选择至少一个EV71EV71EV71EV71阳性标本阳性标本阳性标本阳性标本RNARNARNARNA同时扩增作对照；同时扩增作对照；同时扩增作对照；同时扩增作对照；3.3.3.3.电泳分析：选择合适的电泳分析：选择合适的电泳分析：选择合适的电泳分析：选择合适的Marker Marker Marker Marker （5005005005001000bp)1000bp)1000bp)1000bp)4040n 实时荧光定量PCR技术实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR定义：定义： 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧光，利用荧光信号累积实现了信号累积实现了实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，对起始进程，对起始模板进行模板进行定量分析定量分析的方法。的方法。4141分类分类(DNA (DNA 产物的荧光标记产物的荧光标记) )：非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：1 1 1 1、SYBR Green SYBR Green SYBR Green SYBR Green 特异性荧光标记：特异性荧光标记：特异性荧光标记：特异性荧光标记：2 2 2 2、TaqManTaqManTaqManTaqMan3 3 3 3、分子信标、分子信标、分子信标、分子信标 (Molecular Beacon)(Molecular Beacon)(Molecular Beacon)(Molecular Beacon)4242TaqMan-TaqMan-水解型杂交探针水解型杂交探针 55端标记有报告基团端标记有报告基团(Reporter, R) (Reporter, R) ，如，如FAMFAM、VICVIC等；等； 33端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)(Quencher, Q)； 探针完整，探针完整，R R所发射的荧光能量被所发射的荧光能量被Q Q基团吸收，无荧光，基团吸收，无荧光，R R与与Q Q分开，分开， 发荧光；发荧光； TaqTaq酶有酶有5353外切核酸酶活性，可水解探针。外切核酸酶活性，可水解探针。4343TaqMan法工作原理4444TaqMan PCRTaqMan PCR体系的构成：体系的构成：引物、引物、引物、引物、TaqManTaqManTaqManTaqMan探针、探针、探针、探针、dNTPsdNTPsdNTPsdNTPs、TaqTaqTaqTaq聚合酶、聚合酶、聚合酶、聚合酶、模板、模板、模板、模板、相应的缓冲体系等。相应的缓冲体系等。相应的缓冲体系等。相应的缓冲体系等。4545典型的典型的Real time PCRReal time PCR四阶段四阶段: : 4646荧光阈值(threshold)设定:threshold = 10SD(cycle 6-15) threshold = 10SD(cycle 6-15) 4747Ct值： C C C C代表代表代表代表Cycle, tCycle, tCycle, tCycle, t代表代表代表代表threshold,threshold,threshold,threshold,即每个反应管内即每个反应管内即每个反应管内即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。4848荧光定量PCR标准曲线绘制:4949结果分析条件设定和结果判断结果分析条件设定和结果判断: :对照结果：阴性对照应为阴性；阳性对照应为阳性；对照结果：阴性对照应为阴性；阳性对照应为阳性；CtCt值无数值的（与阴性对照应一致）标本为阴性样本；值无数值的（与阴性对照应一致）标本为阴性样本；CtCt值值35.035.0的样本为阳性；的样本为阳性；CtCt值值35.035.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性， 否则为阳性。否则为阳性。 5050荧光荧光PCRPCR特点特点l灵敏度高灵敏度高l特异性强特异性强l全封闭全封闭PCRPCR过程，无需后处理，降低污染机会。过程，无需后处理，降低污染机会。l即时反映扩增过程，更适用于定量。即时反映扩增过程，更适用于定量。l可实现一管多检（如：双通道、三通道检测）可实现一管多检（如：双通道、三通道检测）l仪器自动分析，更快获得结果。仪器自动分析，更快获得结果。l探针设计有一定难度，较难达到一管多检的要求。探针设计有一定难度，较难达到一管多检的要求。l出现污染，更难处理。出现污染，更难处理。51513.血清学方法n ELISA ELISA 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验底物（底物（TMBTMB）酶标二抗酶标二抗病毒特异性抗体病毒特异性抗体病毒分离物（抗原）病毒分离物（抗原） ELISAELISA用于检测病毒分用于检测病毒分离物，既可以鉴定病毒种离物，既可以鉴定病毒种类，也可以鉴定出病毒的类，也可以鉴定出病毒的血清学亚类。本方法的特血清学亚类。本方法的特异性和敏感性都比较高，异性和敏感性都比较高，而且适用于大量的样本检而且适用于大量的样本检测，这对于新分离病毒的测，这对于新分离病毒的初步鉴定工作具有非常重初步鉴定工作具有非常重要的意义。要的意义。 5252lTypes of ELISA:Direct ELISA;Direct ELISA;Indirect ELISA;Indirect ELISA;Sandwich/Capture ELISASandwich/Capture ELISAA Basic ELISACoating antigenCoating antigenBlock remaining Block remaining binding sitesbinding sitesWash out excess Wash out excess reagentreagentAdding samplesAdding substrateReading Printing resultsAdding secondary antibody5353注意事项注意事项待检病毒分离物在检测前需要待检病毒分离物在检测前需要5656，3030分钟进行灭活；分钟进行灭活；所有使用的抗体在所有使用的抗体在2020条件保存，若短期内（条件保存，若短期内（1 12 2周）经常使用，可暂储存于周）经常使用，可暂储存于44，避免反复冻融；，避免反复冻融；加样时，按规定的量加到微孔板孔的下加样时，按规定的量加到微孔板孔的下1/31/3处，应避免溅出和产生气泡；加每份标本应更换吸头，避免处，应避免溅出和产生气泡；加每份标本应更换吸头，避免交叉污染；交叉污染；温育时，最好使用水浴法或湿盒法，避免产生边缘效应；微孔板不可叠加放置；温育时，最好使用水浴法或湿盒法，避免产生边缘效应；微孔板不可叠加放置；测测ODOD值前将微孔板底部的水吸干，避免值前将微孔板底部的水吸干，避免ODOD值出现负值或损坏滤光片；值出现负值或损坏滤光片；移液枪的加样误差一般应在移液枪的加样误差一般应在1010以内；水浴箱允许有以内；水浴箱允许有11的误差；洗板机洗板后的残液量一般不超的误差；洗板机洗板后的残液量一般不超过过2L2L，达到人工扣板不湿即可；酶标仪经常维护光学部分，防止霉变，并且定期检测校正；，达到人工扣板不湿即可；酶标仪经常维护光学部分，防止霉变，并且定期检测校正；ELISA ELISA 鉴定病毒的程度依赖于抗体的特异性程度鉴定病毒的程度依赖于抗体的特异性程度病毒组特异性抗体病毒组特异性抗体 病毒属病毒属/ /组组病毒特异性多克隆抗体病毒特异性多克隆抗体 病毒种（易受血清学交叉反应影响）病毒种（易受血清学交叉反应影响）病毒特异性单克隆抗体病毒特异性单克隆抗体 病毒种类病毒种类病毒血清型特异性抗体病毒血清型特异性抗体 病毒种类及血清型别病毒种类及血清型别5454n IFA 免疫荧光技术 免疫荧光技术于免疫荧光技术于19421942年发明，该技术在医学年发明，该技术在医学和微生物学研究中的应和微生物学研究中的应用越来越广泛。间接免用越来越广泛。间接免疫荧光法具有安全、快疫荧光法具有安全、快速、简便、结果直观、速、简便、结果直观、敏感性和特异性较高等敏感性和特异性较高等优点，它同样可以检测优点，它同样可以检测病毒种类和亚类。病毒种类和亚类。IFAIFA检测病毒分离物示意图检测病毒分离物示意图FITC FITC 标记的抗标记的抗IgGIgG抗体抗体特异性病毒抗体特异性病毒抗体细胞内的病毒细胞内的病毒5555IFA IFA 鉴定病毒的程度依赖于抗体的特异性程度鉴定病毒的程度依赖于抗体的特异性程度5656注意事项：注意事项：制片时感染病毒的细胞生长不宜过密制片时感染病毒的细胞生长不宜过密 ，在试验操作过程中，在试验操作过程中，切勿损伤细胞；切勿损伤细胞；每次试验必须设立严格对照；每次试验必须设立严格对照；不要正对着抗原片的孔冲洗，以免将细胞冲落；不要正对着抗原片的孔冲洗，以免将细胞冲落；荧光标记抗体的浓度要合适，过高会造成非特异性荧光；荧光标记抗体的浓度要合适，过高会造成非特异性荧光；荧光染色标本完成封片后，应立即镜检，若没有立即镜检的荧光染色标本完成封片后，应立即镜检，若没有立即镜检的条件条件, ,或要保留备查或要保留备查, ,应将标本置于应将标本置于44、密闭、避光等；、密闭、避光等；观察荧光时，要将细胞形态学特征和特异荧光的强度结合起观察荧光时，要将细胞形态学特征和特异荧光的强度结合起来综合判断，不可偏废；来综合判断，不可偏废；5757n中和试验 中和试验是病毒在活体内或细胞培中和试验是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验。一种试验。 中和抗体是作用于病毒表面抗原中和抗体是作用于病毒表面抗原 ( (衣壳或包膜衣壳或包膜) ) 的抗体，同种不同型病毒的抗体，同种不同型病毒间一般无交叉，特异性高，而且抗体在间一般无交叉，特异性高，而且抗体在体内维持时间长。中和抗体阳性不一定体内维持时间长。中和抗体阳性不一定表示正在感染中，也可能因以前有过隐表示正在感染中，也可能因以前有过隐性感染所致。因此，中和试验适用于人性感染所致。因此，中和试验适用于人群免疫情况的调查，在临床诊断上较少群免疫情况的调查，在临床诊断上较少使用。使用。5858未知病毒的鉴定过程与方法未知病毒的鉴定过程与方法现场流行病学提出病原学假设现场流行病学提出病原学假设病毒类病毒类 细菌类细菌类 寄生虫类寄生虫类 。标本采集标本采集病原分离病原分离光光镜镜 电电镜镜免免疫疫学学方方法法分分子子生生物物学学5959电子显微镜技术电子显微镜技术 电子显微镜，简称电镜，诞生于电子显微镜，简称电镜，诞生于电子显微镜，简称电镜，诞生于电子显微镜，简称电镜，诞生于30303030年代年代年代年代初初初初, , , ,但直到但直到但直到但直到60606060年代以前年代以前年代以前年代以前, , , ,电子显微镜在生物医电子显微镜在生物医电子显微镜在生物医电子显微镜在生物医学中的应用主要限于细胞生物学、微生物、学中的应用主要限于细胞生物学、微生物、学中的应用主要限于细胞生物学、微生物、学中的应用主要限于细胞生物学、微生物、实验病理学等研究领域。使用电子来展示物实验病理学等研究领域。使用电子来展示物实验病理学等研究领域。使用电子来展示物实验病理学等研究领域。使用电子来展示物件的内部或表面的显微镜。其分辨率（约件的内部或表面的显微镜。其分辨率（约件的内部或表面的显微镜。其分辨率（约件的内部或表面的显微镜。其分辨率（约0.10.10.10.1纳米）远高于光学显微镜的分辨率（约纳米）远高于光学显微镜的分辨率（约纳米）远高于光学显微镜的分辨率（约纳米）远高于光学显微镜的分辨率（约200200200200纳纳纳纳米）。许多病毒，尤其是肿瘤病毒就是用电米）。许多病毒，尤其是肿瘤病毒就是用电米）。许多病毒，尤其是肿瘤病毒就是用电米）。许多病毒，尤其是肿瘤病毒就是用电镜发现的。电镜可为病毒的分类提供了最直镜发现的。电镜可为病毒的分类提供了最直镜发现的。电镜可为病毒的分类提供了最直镜发现的。电镜可为病毒的分类提供了最直观的依据，例如观的依据，例如观的依据，例如观的依据，例如2003200320032003年肆虐全球的年肆虐全球的年肆虐全球的年肆虐全球的SARSSARSSARSSARS病毒病毒病毒病毒就是首先在电镜下观察到并确认是病毒而不就是首先在电镜下观察到并确认是病毒而不就是首先在电镜下观察到并确认是病毒而不就是首先在电镜下观察到并确认是病毒而不是支原体的。是支原体的。是支原体的。是支原体的。6060透射电子显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描电子显微镜6161五、结果的报告 解释 分析实验室检测、结果分析原则实验室检测、结果分析原则快速准确快速准确日常监测与突发应急检测相结合的原则日常监测与突发应急检测相结合的原则多种检测方法并用，实验结果相结合的多种检测方法并用，实验结果相结合的原则原则检测结果与现场调查综合分析的原则检测结果与现场调查综合分析的原则6262案例一 2003年SARS之争 63636464案例二 安徽无形体聚集病例65656666案例三 水源性腹泻暴发6767总 结实验室检测结果是确定病因的重要依据，但实验室检测结果是确定病因的重要依据，但实验室结果实验室结果要和要和现场调查现场调查情况、患者的情况、患者的临临床表现床表现综合分析，才能确定病因。综合分析，才能确定病因。检检验验结结果果的的正正确确性性不不仅仅取取决决于于实实验验室室的的条条件件和和技技术术水水平平，还还与与检检验验样样品品的的采采集集、保保存存、送送样样等等方方面面有有关关。因因此此在在分分析析检检验验结结果果时时，应综合考虑各种困难影响检验结果的因素应综合考虑各种困难影响检验结果的因素6868阳性结果不一定能说明病原因子在暴发事件阳性结果不一定能说明病原因子在暴发事件中的致病作用；阴性结果也不一定能完全中的致病作用；阴性结果也不一定能完全否定某种病原因子的病因假设。否定某种病原因子的病因假设。无菌部位病原检测结果、分离阳性通常具有无菌部位病原检测结果、分离阳性通常具有明确的诊断意义。明确的诊断意义。病因结论应有多专业人员从分讨论，综合判病因结论应有多专业人员从分讨论，综合判断。断。总 结6969谢谢 谢谢河河南南省省疾疾病病预预防防控控制制中中心心 7070