荧光分析法荧光分析法（fluorescence)荧光棒发光原理荧光棒发光原理 荧光棒中的化学物质主要由三种物质组成：过氧化荧光棒中的化学物质主要由三种物质组成：过氧化物、酯类化合物和荧光染料。简单地说，荧光棒发光物、酯类化合物和荧光染料。简单地说，荧光棒发光的原理就是过氧化物和酯类化合物发生反应，将反应的原理就是过氧化物和酯类化合物发生反应，将反应后的能量传递给荧光染料，再由染料发出荧光。目前后的能量传递给荧光染料，再由染料发出荧光。目前市场上常见的荧光棒中通常放置了一个玻璃管夹层，市场上常见的荧光棒中通常放置了一个玻璃管夹层，夹层内外隔离了过氧化物和酯类化合物，经过揉搓，夹层内外隔离了过氧化物和酯类化合物，经过揉搓，两种化合物反应使得荧光染料发光。两种化合物反应使得荧光染料发光。 荧光分析法荧光分析法荧光：荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从第物质分子接受光子能量被激发后，从第一激发单重态的最低振动能级返回基态时发射一激发单重态的最低振动能级返回基态时发射出的光。出的光。优点：优点：灵敏度高；选择性好；试样量少；方法灵敏度高；选择性好；试样量少；方法简单。简单。缺点：缺点：应用范围小。应用范围小。荧光分析法：荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。度进行物质鉴定和含量测定的方法。第一节第一节 荧光分析法的基本原理荧光分析法的基本原理一、分子荧光一、分子荧光（一）分子荧光的产生（一）分子荧光的产生基态基态单重态单重态S三重态三重态TE单重态：单重态：s=0，M=1，分子所处的电子能态。分子所处的电子能态。分子的多重性：分子的多重性：总自旋量子数：总自旋量子数：三重态：三重态：s=1，M=3，分子所处的电子能态。分子所处的电子能态。1.1.分子的电子能级与激发过程分子的电子能级与激发过程电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁过辐射跃迁( (发光发光) )和无辐射跃迁等方式失去能量。和无辐射跃迁等方式失去能量。2.2.荧光的产生荧光的产生传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁磷光磷光系间跨越系间跨越内转换内转换外转换外转换S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程振动弛豫振动弛豫( (vibrational relexation) )：出于激发态各振出于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子返回到同一电子能级的最量传递给溶剂分子，其电子返回到同一电子能级的最低振动能级间的过程；发生振动弛豫的时间低振动能级间的过程；发生振动弛豫的时间10 -12s s。内部能量转换内部能量转换( (internal conversion) )：当两个电子激当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。能级的过程。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫 外部能量转换外部能量转换 （external conversion)：激发态分激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而失去能量的子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而失去能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。 体系间跨越体系间跨越(intersystem crossing)：处于激发态处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程；分子由激发单重态跨越到激发三重态。的过程；分子由激发单重态跨越到激发三重态。非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫辐射能量传递过程辐射能量传递过程荧光发射：荧光发射：激发分子从激发分子从第一激发单重态的最低振第一激发单重态的最低振动能级动能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称为射称为荧光荧光；荧光辐射能要比激发能量低，荧光；荧光辐射能要比激发能量低，荧光波长大于激发波长；荧光发射时间为波长大于激发波长；荧光发射时间为10-9-10-7s。磷光发射：磷光发射：激发分子由激发分子由第一激发三重态的最低振动第一激发三重态的最低振动能级能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称为为磷光磷光；磷光辐射能要比荧光辐射能量低，磷光波磷光辐射能要比荧光辐射能量低，磷光波长大于荧光波长；磷光发射时间为长大于荧光波长；磷光发射时间为10-4-10s。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量l l 2l l 1l l 3 外转换外转换l l 2T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫荧光分光光度计的主要部件：荧光分光光度计的主要部件：光源、激发单色器、光源、激发单色器、发射单色器、样品池、检测系统。发射单色器、样品池、检测系统。光源光源激发单色器激发单色器样品池样品池发发射射单单色色器器检测器检测器放大器放大器指示器指示器记录器记录器SK-2003A型荧光光谱仪型荧光光谱仪(国内首创）国内首创）RF-5400荧光光度计荧光光度计Hitachi(日立日立)F-2500荧光分光光度荧光分光光度荧光分光光度计澳大利亚荧光分光光度计澳大利亚（二）荧光的激发光谱和发射光谱（二）荧光的激发光谱和发射光谱激发光谱激发光谱（excitation spectrum）：将激发光的光：将激发光的光源用激发单色器分光，使不同波长的入射光激发源用激发单色器分光，使不同波长的入射光激发荧光体，然后让所产生的荧光通过荧光体，然后让所产生的荧光通过固定波长的发固定波长的发射单色器射单色器而照到检测器上，测定不同波长光照射而照到检测器上，测定不同波长光照射下荧光强度的变化，以激发波长为横坐标，荧光下荧光强度的变化，以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，可得荧光物质的激发光谱。强度为纵坐标，可得荧光物质的激发光谱。注意：注意：激发光谱与其吸收光谱极为相似，但激发光激发光谱与其吸收光谱极为相似，但激发光谱曲线是谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则，吸收曲线则是是吸光度与波长的关系曲线吸光度与波长的关系曲线，两者性质是不同的。，两者性质是不同的。荧光光谱（荧光光谱（fluorecence spectrum）：）：固定激固定激发光波长为最大激发波长发光波长为最大激发波长，而让荧光物质发射，而让荧光物质发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同波的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同波长下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光长下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。荧光物质的最大激发波长（荧光物质的最大激发波长（ ex）和最大）和最大发射波长发射波长（ em）是鉴定物质的根据；也是定是鉴定物质的根据；也是定量测定最为灵敏的条件。量测定最为灵敏的条件。荧光光谱的普遍特性荧光光谱的普遍特性1.斯托克斯位移斯托克斯位移(Stokes shift): 激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值；荧光发；荧光发射波长总是大于激发光谱波长。射波长总是大于激发光谱波长。室温下菲的乙醇溶液荧光光谱室温下菲的乙醇溶液荧光光谱2.荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从而荧光重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从而荧光发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的形状发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的形状与激发波长无关。与激发波长无关。3.荧光光谱与激发光谱的镜像关系荧光光谱与激发光谱的镜像关系荧光光谱的普遍特性荧光光谱的普遍特性激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。nm200280360440520020406080100Fab4b3b2b1b0c0c1c2c3c4蒽的激发光谱（虚线）蒽的激发光谱（虚线）荧光光谱（实线）荧光光谱（实线）蒽的能级跃迁蒽的能级跃迁V=0V=1V=2V=3V=4V=0V=1V=2V=3V=4b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4E4E3E2E1E4E3E2E1荧光猝灭：荧光猝灭：荧光物质分子与溶剂分子或其他荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。象称为荧光猝灭。荧光熄灭剂：荧光熄灭剂：能引起荧光强度降低的物质。能引起荧光强度降低的物质。4.荧光熄灭剂荧光熄灭剂荧光熄灭法荧光熄灭法: : 荧光物质加入某些猝灭剂后，其荧荧光物质加入某些猝灭剂后，其荧光强度的减少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，光强度的减少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，可用于测定猝灭剂的含量，这种方法称为荧光熄可用于测定猝灭剂的含量，这种方法称为荧光熄灭法。灭法。（二）有机化合物分子结构与荧光的关系（二）有机化合物分子结构与荧光的关系物质产生荧光必须具备的条件：物质产生荧光必须具备的条件：（1）物质的）物质的分子必须具有能够吸收紫外和较短分子必须具有能够吸收紫外和较短波长可见光的结构波长可见光的结构; ;（2）只有那些具有只有那些具有 - - 共轭双键的分子才能发共轭双键的分子才能发射较强的荧光射较强的荧光. .二、荧光与分子结构二、荧光与分子结构1.1.长共轭结构（芳香族化合物）长共轭结构（芳香族化合物） 共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移205nm278nm286nm321nm356nm404nm0.110.290.362.2.分子的刚性分子的刚性分子刚性越强，分子振动少，与其它分子碰分子刚性越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高，荧撞失活的机率下降，荧光量子效率提高，荧光长移。光长移。3.3.取代基对分子发射荧光的影响取代基对分子发射荧光的影响（苯环上）取代（苯环上）取代 给电子基团，使给电子基团，使 共轭程度升高。荧光强度共轭程度升高。荧光强度增加：如增加：如CH3，NH2 ，OH ，OR等。等。(苯环上）取代吸电子基团时，荧光强度减弱甚至熄灭：如：苯环上）取代吸电子基团时，荧光强度减弱甚至熄灭：如： ，COOH ，CHO， NO2 ，N=N。高原子序数原子，增加体系间跨越的发生，使荧光减弱甚高原子序数原子，增加体系间跨越的发生，使荧光减弱甚至熄灭。如：至熄灭。如：Br，I 。1.1.分子荧光分析中，含有重原子如碘、溴的分子易发生：分子荧光分析中，含有重原子如碘、溴的分子易发生： ( ( )A A 振动弛豫振动弛豫B B 内部转换内部转换C C 体系间跨跃体系间跨跃D D 荧光发射荧光发射答案：答案：C C2.2.在下列的四种说法中，哪一种是不正确的（）在下列的四种说法中，哪一种是不正确的（）A A分子荧光发射光谱通常与吸收光谱互为镜像关系；分子荧光发射光谱通常与吸收光谱互为镜像关系；B B分子荧光发射光谱形状与激发波长没有关系；分子荧光发射光谱形状与激发波长没有关系；C C分子荧光发射光谱与激发波长不同而变化；分子荧光发射光谱与激发波长不同而变化；D D分子荧光发射的强度与激发光的强度成正比的关系。分子荧光发射的强度与激发光的强度成正比的关系。答案：答案：C C. .下列说法正确的是下列说法正确的是 ( )( )A A 分子的刚性平面有利于荧光的产生分子的刚性平面有利于荧光的产生B B 磷光辐射的波长比荧光短磷光辐射的波长比荧光短C C 磷光比荧光的寿命短磷光比荧光的寿命短D D 荧光猝灭是指荧光完全消失荧光猝灭是指荧光完全消失答案：答案：A A