第二节第二节 鹿的鹿的配种、人工输精技术和胚胎移植鹿的鹿的配种、人工输精技术和胚胎移植 教学目的：教学目的：1、掌握鹿在人工养殖条件下自然交配、掌握鹿在人工养殖条件下自然交配 的方式特点配种技术措施。的方式特点配种技术措施。 2、了解推广人工输精的意义、采精方、了解推广人工输精的意义、采精方 法极其特点，掌握精液品质法极其特点，掌握精液品质 检查、检查、 冷冻保存方法及输精技术要点。冷冻保存方法及输精技术要点。 3、了解鹿胚胎移植的研究进展情况。、了解鹿胚胎移植的研究进展情况。 教学重点：教学重点：鹿的配种技术措施和人工输精配套技术。鹿的配种技术措施和人工输精配套技术。 教学安排：教学安排：配种技术措施、人工输精技术各配种技术措施、人工输精技术各2学时。学时。一、鹿的自然交配方法一、鹿的自然交配方法（一）群公群母配种法（一）群公群母配种法 特点是占用圈舍少，受孕率高，但需要公特点是占用圈舍少，受孕率高，但需要公鹿较多，造成公母鹿伤亡多，后代系谱不清，容易发生近亲繁殖。鹿较多，造成公母鹿伤亡多，后代系谱不清，容易发生近亲繁殖。 1、群公群母一配到底法：、群公群母一配到底法：在配种开始时，按在配种开始时，按1：35公母比例将选公母比例将选好的种公鹿全部放入母鹿圈合群饲养，直到配种结束；配种期间患好的种公鹿全部放入母鹿圈合群饲养，直到配种结束；配种期间患病、体弱、失去配种能力的公鹿及时拨出医治或休养，不再另外增病、体弱、失去配种能力的公鹿及时拨出医治或休养，不再另外增补其他公鹿。配种旺期实施补其他公鹿。配种旺期实施“哄鹿截王助配哄鹿截王助配”。 2、群公群母适时替换公鹿配种法：、群公群母适时替换公鹿配种法：按按1：57的公母比例将种公鹿的公母比例将种公鹿放入母鹿群，在配种期间替换放入母鹿群，在配种期间替换12次种公鹿。第一批公鹿多次种公鹿。第一批公鹿多为育成公鹿，引诱母鹿早发情；为育成公鹿，引诱母鹿早发情；第二批或第三批公鹿应为壮年第二批或第三批公鹿应为壮年优秀种公鹿。优秀种公鹿。（二）单公群母配种法（二）单公群母配种法 特点是能够做到选种选配，准确特点是能够做到选种选配，准确记录配种情况，系谱清楚，伤亡较少，受胎率较高，能记录配种情况，系谱清楚，伤亡较少，受胎率较高，能较快的提高鹿群质量，但占用圈舍较多，饲养员劳动强较快的提高鹿群质量，但占用圈舍较多，饲养员劳动强度较大。度较大。1、单公群母一配到底法：单公群母一配到底法：先将母鹿分成先将母鹿分成1020只的小群，只的小群，在配种开始前，一只选好的种公鹿，配种期间放入不替在配种开始前，一只选好的种公鹿，配种期间放入不替换公鹿。特点不频繁调拨公鹿，劳动强度不大，能提高换公鹿。特点不频繁调拨公鹿，劳动强度不大，能提高公鹿利用率，后代系谱清楚。公鹿利用率，后代系谱清楚。2、单公群母适时替换公鹿配种法：、单公群母适时替换公鹿配种法：先将母鹿分成先将母鹿分成1530只的小群，只的小群，在配种开始前，先放入一只选好的种公鹿，配种期间在配种开始前，先放入一只选好的种公鹿，配种期间根据公母鹿发情配种情况适时替换公鹿。在配种初根据公母鹿发情配种情况适时替换公鹿。在配种初期和后期，每隔期和后期，每隔12周替换一次公鹿，配种旺期每周替换一次公鹿，配种旺期每隔隔37天替换一次公鹿；或公鹿每交配天替换一次公鹿；或公鹿每交配2只母鹿休息只母鹿休息1天，换入其他公鹿继续配种，以免影响母鹿受胎天，换入其他公鹿继续配种，以免影响母鹿受胎率。率。特点是能提高母鹿受胎率，但后代系谱不易分清。特点是能提高母鹿受胎率，但后代系谱不易分清。3、单公群母昼配夜息配种法：、单公群母昼配夜息配种法：每日向母鹿群放入一只选好的种公每日向母鹿群放入一只选好的种公鹿，傍晚配种完毕后将公鹿拨出。每日放入的公鹿可以根据具体情鹿，傍晚配种完毕后将公鹿拨出。每日放入的公鹿可以根据具体情况适当变换。特点是白天集中精力看配能做到配种记录完整和系谱况适当变换。特点是白天集中精力看配能做到配种记录完整和系谱清楚，母鹿受胎率较高，利于鹿的休息，但每日拨公鹿清楚，母鹿受胎率较高，利于鹿的休息，但每日拨公鹿2次，饲养次，饲养员劳动强度大。员劳动强度大。4、单公群母定时放入公鹿配种法：、单公群母定时放入公鹿配种法：每日在确定的时间里（特别是每日在确定的时间里（特别是母鹿集中发情的早晨和黄昏）向母鹿群放入一只选好的公鹿，每次母鹿集中发情的早晨和黄昏）向母鹿群放入一只选好的公鹿，每次放入的公鹿可根据具体情况替换。特点能准确做好配种记录，一般放入的公鹿可根据具体情况替换。特点能准确做好配种记录，一般不易漏配，但劳动强度大。不易漏配，但劳动强度大。（三）单公单母试情配种法（三）单公单母试情配种法 在发情期内，每日在发情期内，每日23次定时将次定时将12只试情公鹿放入母鹿群，根据只试情公鹿放入母鹿群，根据母鹿对试情公鹿的行为表现，判定母鹿发情时期，在发情盛期将母母鹿对试情公鹿的行为表现，判定母鹿发情时期，在发情盛期将母鹿拨入已有选定种公鹿的小圈内配种，配种后及时拨出母鹿。特点鹿拨入已有选定种公鹿的小圈内配种，配种后及时拨出母鹿。特点是提高种公鹿的利用率，可防止近亲交配，母鹿受胎率高，后代系是提高种公鹿的利用率，可防止近亲交配，母鹿受胎率高，后代系谱清楚，但需要较多人力和较大场地。谱清楚，但需要较多人力和较大场地。二、配种前的准备工作二、配种前的准备工作（一）鹿群的调整（一）鹿群的调整1、母鹿群的调整：、母鹿群的调整：在在8月中下旬仔鹿断奶后，按繁殖性能、体质外月中下旬仔鹿断奶后，按繁殖性能、体质外貌特点、血缘关系、年龄及健康状况重新组成育种核心群、一般繁貌特点、血缘关系、年龄及健康状况重新组成育种核心群、一般繁殖群、初配群、后备群、淘汰群。参配母鹿群一般以殖群、初配群、后备群、淘汰群。参配母鹿群一般以2030只为宜。只为宜。母鹿圈安排在鹿场的下风向。母鹿圈安排在鹿场的下风向。2、公鹿群的调整：、公鹿群的调整：在在8月月20日前收完再生茸后，根据体质外貌、生日前收完再生茸后，根据体质外貌、生产性能、谱系、生长发育、年龄、后代品质等重新将公鹿分为种用产性能、谱系、生长发育、年龄、后代品质等重新将公鹿分为种用群、后备种用群和非种用群。种公鹿的比例一般不少于参配母鹿总群、后备种用群和非种用群。种公鹿的比例一般不少于参配母鹿总数的数的10%。公鹿圈安排在鹿场的上风向，并尽量拉大与母鹿圈的距。公鹿圈安排在鹿场的上风向，并尽量拉大与母鹿圈的距离，以免配种期母鹿的气味诱使公鹿角斗、爬跨而造成伤亡。离，以免配种期母鹿的气味诱使公鹿角斗、爬跨而造成伤亡。（二）配种方案的制定和用品准备（二）配种方案的制定和用品准备 配种方案：育种核心群母鹿用最好的公鹿配种；一般殖群母鹿用配种方案：育种核心群母鹿用最好的公鹿配种；一般殖群母鹿用一部分最好的公鹿和较好的公鹿配种；初配母鹿群用成年公鹿配种。一部分最好的公鹿和较好的公鹿配种；初配母鹿群用成年公鹿配种。 用品准备：医疗用品器具和圈舍维修材料、各种记录表。用品准备：医疗用品器具和圈舍维修材料、各种记录表。（三）圈舍检修（三）圈舍检修三、配种技术三、配种技术（一）公母合群时间（一）公母合群时间 随拟采用的配种方法而不同，实际随拟采用的配种方法而不同，实际上母鹿在一天中多集中在早晨上母鹿在一天中多集中在早晨47时和傍晚时和傍晚1722时发情，时发情，公母鹿每日合群时间应集中在这两段时间，以便于看管和公母鹿每日合群时间应集中在这两段时间，以便于看管和记录。另外，及早将公母鹿合群可以促进母鹿发情。记录。另外，及早将公母鹿合群可以促进母鹿发情。（二）种公鹿的合理利用（二）种公鹿的合理利用 种公鹿每日上下午各配一次较种公鹿每日上下午各配一次较好，两次配种应间隔好，两次配种应间隔4小时以上；连配两日后应休息一日；小时以上；连配两日后应休息一日；替换下来的公鹿应单圈专门饲养，休养一段时间后再参加替换下来的公鹿应单圈专门饲养，休养一段时间后再参加配种。必须有节制的使用种公鹿，才能保持种公鹿的配配种。必须有节制的使用种公鹿，才能保持种公鹿的配种能力和提高母鹿的受胎率。种能力和提高母鹿的受胎率。（三）隐性发情母鹿的配种（三）隐性发情母鹿的配种 利用性欲旺盛的种公鹿追配，利用性欲旺盛的种公鹿追配，必要时采取堵截该鹿助配，或采用人工输精技术使其受必要时采取堵截该鹿助配，或采用人工输精技术使其受胎。胎。（四）鹿群的值班看管四）鹿群的值班看管1、参配公鹿的看管：、参配公鹿的看管：防止公鹿伤害母鹿；根据配种情况防止公鹿伤害母鹿；根据配种情况随时替换公鹿；作好发情配种记录；刚结束配种的鹿在随时替换公鹿；作好发情配种记录；刚结束配种的鹿在一定时间内禁止饮水；拨出的种公鹿单独组群饲养，不一定时间内禁止饮水；拨出的种公鹿单独组群饲养，不能混入生产群。能混入生产群。2、非配种公鹿的看管：、非配种公鹿的看管：远离配种母鹿圈；适当减喂精料；远离配种母鹿圈；适当减喂精料；药物处理抑制发情：己烯雌酚片或苯巴比妥片拌水喂鹿，药物处理抑制发情：己烯雌酚片或苯巴比妥片拌水喂鹿，每日早晚各一次，每次每日早晚各一次，每次24片；或拌料饲喂中药制阳灵，片；或拌料饲喂中药制阳灵， 每日两次，饲喂每日两次，饲喂35日。日。（五）返情母鹿的补配（五）返情母鹿的补配 将发情配种的母鹿重新组将发情配种的母鹿重新组成已配母鹿群，放入一只种成已配母鹿群，放入一只种公鹿，以便对返情母鹿及时公鹿，以便对返情母鹿及时补配。但需值班看配，否则补配。但需值班看配，否则后代系谱不清。后代系谱不清。五、鹿的人工输精技术五、鹿的人工输精技术（一）在养路生产中推广人工输精技术的现实意义（一）在养路生产中推广人工输精技术的现实意义1、扩大精液供应范围，充分发挥优良种公鹿的作用。、扩大精液供应范围，充分发挥优良种公鹿的作用。采用冻精配采用冻精配种技术，种技术，1只公鹿可配种只公鹿可配种300500只母鹿。冻精可长期保存，不受公只母鹿。冻精可长期保存，不受公鹿寿命限制。鹿寿命限制。2、便于早期后裔鉴定，判断种公鹿的遗传力。、便于早期后裔鉴定，判断种公鹿的遗传力。用冻精配种，与配用冻精配种，与配母鹿数量多，可在短期内繁殖大量后代，通过鉴定可以早期判断公母鹿数量多，可在短期内繁殖大量后代，通过鉴定可以早期判断公鹿的遗传力和种用价值。鹿的遗传力和种用价值。3、可防止传染性疾病的传播。、可防止传染性疾病的传播。4、克服鹿体间的三大差异，有效进、克服鹿体间的三大差异，有效进行鹿的种间杂交。行鹿的种间杂交。在进行本交时，在进行本交时，约有约有10%地马鹿肯与梅花鹿配种。地马鹿肯与梅花鹿配种。（二）鹿的人工采精技术（二）鹿的人工采精技术1、电刺激采精法：、电刺激采精法：（1）原理：采用输出频率）原理：采用输出频率2050Hz电流正弦波，刺激直电流正弦波，刺激直肠壶腹部的低级射精中枢，引起射精反射，达到采精目的肠壶腹部的低级射精中枢，引起射精反射，达到采精目的特点：安全（医疗方波）特点：安全（医疗方波）,成功率高（成功率高（98%）,鹿无痛苦鹿无痛苦（按摩感觉）。（按摩感觉）。技术参数：技术参数：输出电压：输出电压：020V最大输出电流：最大输出电流：1A输出频率：输出频率：2050Hz输出波形：正弦波输出波形：正弦波电源电压：电源电压：220V消耗功率：不超消耗功率：不超50W（2）采精器使用方法）采精器使用方法 A、接通电源：接通电源：打开开关，指示灯亮，旋转打开开关，指示灯亮，旋转“输出调节输出调节”旋钮，所旋钮，所示示读数与电压表读数相符，表示仪器正常（空载时电压表读数为零）读数与电压表读数相符，表示仪器正常（空载时电压表读数为零）B、调节仪器：调节仪器：“输出调节输出调节”旋钮调至旋钮调至“0V”位置，在输出插座接位置，在输出插座接上探上探头，将探棒插入采精鹿直肠内适当位置，此时仪器即可工作。头，将探棒插入采精鹿直肠内适当位置，此时仪器即可工作。C、调节刺激时间调节刺激时间：旋动：旋动“输出调节输出调节”旋钮到所需位置（由低挡开旋钮到所需位置（由低挡开始，始，逐步升高），每档可随时掌握刺激时间，将旋钮调至逐步升高），每档可随时掌握刺激时间，将旋钮调至“0V”位置，位置，则刺激停止。则刺激停止。D、反复刺激：反复刺激：在每档刺激间隔一定时间后，再旋动在每档刺激间隔一定时间后，再旋动“输出调节输出调节”旋钮逐步提高输出电压，反复刺激，直至射精。旋钮逐步提高输出电压，反复刺激，直至射精。E、采精完毕：采精完毕：关上电源，从直肠中取出探棒，并将关上电源，从直肠中取出探棒，并将“输出调节输出调节”旋旋钮调至钮调至“0V”位置，拔出电源插头。位置，拔出电源插头。(3)采精方法采精方法A、保定稳妥采精鹿：保定稳妥采精鹿：一是用特制的鹿用医疗保定器保定采精鹿。一是用特制的鹿用医疗保定器保定采精鹿。保定时间保定时间35分钟，需分钟，需34人。目前多应用麻醉保定采精鹿，肌肉注人。目前多应用麻醉保定采精鹿，肌肉注射眠乃宁或鹿眠宝射眠乃宁或鹿眠宝2ml，57分钟，待鹿倒地后即可采精。分钟，待鹿倒地后即可采精。B、采精操作：采精操作：待鹿保定好后，剪净尿道口附近的被毛，用生理盐待鹿保定好后，剪净尿道口附近的被毛，用生理盐水冲洗阴筒内污物并搓干，用创布覆盖鹿躯体；用温肥皂水或水冲洗阴筒内污物并搓干，用创布覆盖鹿躯体；用温肥皂水或13%盐水灌肠排除蓄粪，将探棒涂上液体石蜡插入直肠，深约盐水灌肠排除蓄粪，将探棒涂上液体石蜡插入直肠，深约15；接通电源，打开输出开关，先从接通电源，打开输出开关，先从1档（档（3V）开始刺激，刺激开始刺激，刺激56秒间歇秒间歇11.5，连续刺激，间歇，连续刺激，间歇68次之后升高到次之后升高到2档（档（6V）。）。刺激间歇方法同前，依此类推，至刺激间歇方法同前，依此类推，至3档（档（9V），），4档（档（12V）。当鹿在某个档次射精时不在当鹿在某个档次射精时不在升档，用集精杯收集精液，直至升档，用集精杯收集精液，直至射精结束。一般情况下鹿在射精结束。一般情况下鹿在26档射精。如果升至档射精。如果升至7档（档（1420V）仍不射精，可休息仍不射精，可休息46分钟，再分钟，再从从1档重新开始刺激。档重新开始刺激。2、假阴道采精法、假阴道采精法 此法需要有驯化良好的采精公鹿和有此法需要有驯化良好的采精公鹿和有一定驯化基础的母鹿作台鹿（或制作假台鹿）。真台鹿发一定驯化基础的母鹿作台鹿（或制作假台鹿）。真台鹿发情分泌外激素（在假台鹿臀部涂上发情母鹿的尿液），情分泌外激素（在假台鹿臀部涂上发情母鹿的尿液），刺激公鹿性欲，在台鹿臀下按上假阴道，诱导公鹿爬跨刺激公鹿性欲，在台鹿臀下按上假阴道，诱导公鹿爬跨时进行采精。时进行采精。 假阴道由外壳、内胎、集精杯、气卡、假阴道由外壳、内胎、集精杯、气卡、胶塞等构成。采精前要检查胶塞等构成。采精前要检查 假阴道内外胎不漏水，内假阴道内外胎不漏水，内胎无邹褶、无弯曲、松紧适度，再装上胎无邹褶、无弯曲、松紧适度，再装上集精杯，用集精杯，用75%的酒精消毒，的酒精消毒，酒精挥发后用稀释液冲洗酒精挥发后用稀释液冲洗12次。由注水孔向内胎注入次。由注水孔向内胎注入4555水水400500ml，内胎内胎1/21/3涂润滑剂。向内胎吹涂润滑剂。向内胎吹气，调节压力，采精前保证气，调节压力，采精前保证假阴道温度假阴道温度3840 。 不同采精方法对茸鹿精液量和品质的影响不同采精方法对茸鹿精液量和品质的影响鹿别鹿别 采精方法采精方法 采精量采精量 密度密度 活力活力梅花鹿梅花鹿 假阴道法假阴道法 0.61.0ml (30004000) 106/ml 0.9 电刺激法电刺激法 1.02.0ml 1000) 106/ml 0.7马鹿马鹿 假阴道法假阴道法 1.02.0ml (18603700) 106/ml 0.8 电刺激法电刺激法 2.05.0ml 1380 106/ml 0.7（三）精液品质检查（三）精液品质检查1、常规检查项目：、常规检查项目：A、射精量：射精量：假阴道采精假阴道采精0.61ml。电刺激采精电刺激采精12mlB、色泽、气味：色泽、气味：乳白色或浅白色，有的略带微黄色。乳白色或浅白色，有的略带微黄色。C、云雾状：云雾状：好的精液在集精杯内呈云雾状。好的精液在集精杯内呈云雾状。D、活力：活力：是指在显微镜下用直线运是指在显微镜下用直线运动的精子百分率表示的精子的运动动的精子百分率表示的精子的运动能力。假阴道采精能力。假阴道采精0.80.9，电刺激，电刺激采精采精0.760.87。常温精液配种活力常温精液配种活力0.6以上，冻精解冻后以上，冻精解冻后0.3以上可用。以上可用。E、密度检查密度检查:精子在显微镜视野中精子在显微镜视野中的密度分为密的密度分为密10亿亿/ml以上，中以上，中310亿亿/ml，稀稀13亿亿/ml。2、精液定期检查项目、精液定期检查项目A、精子数：精子数：在显微镜下用血球计数器精确计算。在显微镜下用血球计数器精确计算。B、精子畸形率精子畸形率（%）=畸形精子数畸形精子数/计算精子总数计算精子总数100C、精子死或检查：精子死或检查：用伊红苯用伊红苯胺黑（胺黑（5%伊红水溶液伊红水溶液+1%苯胺黑水溶液）染色，苯胺黑水溶液）染色，死精子为红色，活精子不着死精子为红色，活精子不着色或头部核环处淡红色。色或头部核环处淡红色。D、精子顶体异常检查精子顶体异常检查;E、精子抗力测定精子抗力测定;F、精子存活时间精子存活时间;G、精子的酸碱度：精子的酸碱度：用用精密精密PH试纸测定，鹿试纸测定，鹿精液精液PH为为6.67.3。 梅花鹿正常精子形态梅花鹿正常精子形态（四）精液的稀释（四）精液的稀释1、稀释目的：、稀释目的：扩大容量；增加配种数量；提供营扩大容量；增加配种数量；提供营养；缓冲酸碱度；延长精子存活时间；便于保存养；缓冲酸碱度；延长精子存活时间；便于保存和运输；提高公鹿利用率。和运输；提高公鹿利用率。2、精液稀释液应具备的条件：、精液稀释液应具备的条件：营养丰富、渗透压营养丰富、渗透压相同、酸碱度适宜有缓冲作用、减少或消除副性相同、酸碱度适宜有缓冲作用、减少或消除副性腺分泌物的有害作用、成本低、易于制备和推广腺分泌物的有害作用、成本低、易于制备和推广3、配制稀释液的操作要求：、配制稀释液的操作要求：用具洁净、药品称量用具洁净、药品称量准确、按步骤配制、配后过滤、现用现配。准确、按步骤配制、配后过滤、现用现配。4、稀释倍数的确定：、稀释倍数的确定：依据精子活力和密度确定，依据精子活力和密度确定，鹿用电刺激采精活力和密度不如假阴道采精，稀鹿用电刺激采精活力和密度不如假阴道采精，稀释倍数一般为释倍数一般为14倍。倍。5、稀释液配方、稀释液配方常温输精稀释液常温输精稀释液 A、蒸馏水蒸馏水 100 ml 柠檬酸钠柠檬酸钠 2.98g 卵卵 黄黄 20 ml 青、链霉素各青、链霉素各 10IUB、12%乳糖乳糖 80ml 卵卵 黄黄 20ml 青、链霉素各青、链霉素各 10IU颗粒冻精稀释液颗粒冻精稀释液 A、蒸馏水蒸馏水 100 ml 葡萄糖葡萄糖 0.8 g 柠檬酸钠柠檬酸钠 2.8g 卵卵 黄黄 10ml B、蒸馏水蒸馏水 100 ml 柠檬酸钠柠檬酸钠 1.7g 酒石酸钾钠酒石酸钾钠 1.0g 甘甘 油油 7ml(60加入加入) 卵卵 黄黄 20ml（40加入振荡）加入振荡） 细管冻精稀释液细管冻精稀释液 A、 蒸馏水蒸馏水 34.41ml 三羟甲基氨基甲烷（三羟甲基氨基甲烷（tris） 1.21g 果果 糖糖 0.5g 柠檬酸钠柠檬酸钠 0.67g 甘甘 油油 3.20ml 卵卵 黄黄 10ml B、 12%蔗糖溶液蔗糖溶液 75ml 卵卵 黄黄 20ml 甘甘 油油 5ml 青青 霉霉 素素 8IU 链链 霉霉 素素 2.5IU6、精液的稀释方法、精液的稀释方法 根据精子活力、密度和精液量确定稀释倍数和稀释液根据精子活力、密度和精液量确定稀释倍数和稀释液量。原则是预计解冻后每粒颗粒冻精含有效精子数不少量。原则是预计解冻后每粒颗粒冻精含有效精子数不少于于1500万。稀释时，多采用两次稀释法，即先将与精液万。稀释时，多采用两次稀释法，即先将与精液等温（等温（2025）不含甘油的第一稀释液沿试管壁缓慢）不含甘油的第一稀释液沿试管壁缓慢加入精液中，最终达到稀释倍数的一半，并慢慢降温加入精液中，最终达到稀释倍数的一半，并慢慢降温（不少于（不少于60min）至至45，再加入与精液等温的第二，再加入与精液等温的第二稀释液。第二液的加入可采用一次、多次以及缓慢滴入稀释液。第二液的加入可采用一次、多次以及缓慢滴入等方法，甘油最终浓度为等方法，甘油最终浓度为5%7%。转动试管，使其均。转动试管，使其均匀混合。匀混合。7、精液的平衡、精液的平衡 是指稀释液中的甘油与精子在是指稀释液中的甘油与精子在25条件下相互作用，条件下相互作用，使甘油对精子起到保护作用，达到保护目的。方法是将使甘油对精子起到保护作用，达到保护目的。方法是将稀释好的精液用硫酸纸封好管口，再用棉花包好试管或稀释好的精液用硫酸纸封好管口，再用棉花包好试管或直接将试管放入装有直接将试管放入装有200ml与精液等温（与精液等温（2025）的水）的水杯中，一并放入杯中，一并放入5的冰箱中缓缓降温平衡的冰箱中缓缓降温平衡35h。（五）精子冷冻的理论依据（五）精子冷冻的理论依据玻璃化学说玻璃化学说 精子在精子在-0.6冰点以下开始结冰，水分子形成结晶冰点以下开始结冰，水分子形成结晶造成局部高渗透压，使精子脱水，原生质干涸。并造成局部高渗透压，使精子脱水，原生质干涸。并对精子造成机械损伤，破坏细胞膜，导致精子死亡。对精子造成机械损伤，破坏细胞膜，导致精子死亡。 -0.6-50是精子的冰结晶区，在是精子的冰结晶区，在-15-25危害最危害最大。为避免形成冰结晶，必须迅速通过此区，而形大。为避免形成冰结晶，必须迅速通过此区，而形成玻璃化结晶。因此，冷冻速度越快效果越好。所成玻璃化结晶。因此，冷冻速度越快效果越好。所谓玻璃化是指精子水分保持原来无序排列，不形成谓玻璃化是指精子水分保持原来无序排列，不形成冰晶，而呈坚硬均匀的团块，原生质没有明显脱水，冰晶，而呈坚硬均匀的团块，原生质没有明显脱水，细胞不遭破坏，可以复苏。甘油吸水性强，在冰晶细胞不遭破坏，可以复苏。甘油吸水性强，在冰晶过程中限制水分子晶格排列，使精子不发生脱水，过程中限制水分子晶格排列，使精子不发生脱水，并能缩短危险区。并能缩短危险区。（六）精液冷冻操作技术（六）精液冷冻操作技术1、颗粒冷冻法：、颗粒冷冻法：（1）滴冻：将）滴冻：将2040目的铜网放在目的铜网放在5立升的广口液氮罐内，立升的广口液氮罐内，铜网距液氮罐口铜网距液氮罐口810cm，距离液氮面距离液氮面57厘米，网面中厘米，网面中心温度在心温度在-120-80。如果没有低温温度计，可根据滴。如果没有低温温度计，可根据滴冻时颗粒上是否出现一束上升的白雾来判断温度是否适冻时颗粒上是否出现一束上升的白雾来判断温度是否适宜，并调整铜网距液氮面的距离。每毫升精液滴冻宜，并调整铜网距液氮面的距离。每毫升精液滴冻10粒粒为宜，滴冻结束后，盖上容器盖，停留为宜，滴冻结束后，盖上容器盖，停留23min，然后将然后将已冻精粒投入液氮中。随机抽样检查，解冻活率已冻精粒投入液氮中。随机抽样检查，解冻活率0.3以以上为合格，装入纱布袋，标记后放入液氮中保存。上为合格，装入纱布袋，标记后放入液氮中保存。（2）解冻：在解冻管内加入）解冻：在解冻管内加入2.9%的柠檬酸钠溶液的柠檬酸钠溶液0.2ml，在在4043温水中加热温水中加热23min，然后放入一粒冻精，轻然后放入一粒冻精，轻轻摇晃，使之融化，待融化轻摇晃，使之融化，待融化2/3时取出放在手中，借手时取出放在手中，借手温全部融化，取少许放在玻片上镜检。温全部融化，取少许放在玻片上镜检。2、细管冷冻法、细管冷冻法（1）细管印字：）细管印字：细管又称麦管，使用无毒聚乙烯制成，细管又称麦管，使用无毒聚乙烯制成，容量有容量有0.25ml和和0.5ml两种。在细管上印有代号、品种、两种。在细管上印有代号、品种、编号、生产日期等，放在冰箱内预冷。编号、生产日期等，放在冰箱内预冷。（2）分装：）分装：用法国凯劳式分装机要在平衡后分装，用日用法国凯劳式分装机要在平衡后分装，用日产式分装机要在分装后平衡。产式分装机要在分装后平衡。（3）冷冻：）冷冻：细管精液铜网冷冻，铜网距液氮面细管精液铜网冷冻，铜网距液氮面57cm，距液氮罐口距液氮罐口78cm，网面温度网面温度-120。将平衡后的精液。将平衡后的精液细管铺在铜网上，盖上容器盖，冷冻细管铺在铜网上，盖上容器盖，冷冻810min，然后浸然后浸入夜氮中。抽样检查解冻活力在入夜氮中。抽样检查解冻活力在0.3以上为合格，装入以上为合格，装入纱布袋，标记后放入液氮中保存。纱布袋，标记后放入液氮中保存。（七）人工输精技术（七）人工输精技术1、输精时机：、输精时机：采用母鹿接受试情公鹿爬跨后采用母鹿接受试情公鹿爬跨后810h内一次内一次输精，也可采取母鹿发情后输精，也可采取母鹿发情后612h两次输精。两次输精。2、输精步骤、输精步骤：（1）母鹿保定：）母鹿保定：采用医疗保定器保定或眠乃宁麻醉保定。采用医疗保定器保定或眠乃宁麻醉保定。（2）输精操作：）输精操作：用用鸭嘴开膣器鸭嘴开膣器缓慢插入母鹿阴道开膣，缓慢插入母鹿阴道开膣，用吸入精液的输精器对准子宫颈口输精。用吸入精液的输精器对准子宫颈口输精。80%达到子宫达到子宫内输精，小部分为子宫颈内输精。现多采用直径内输精，小部分为子宫颈内输精。现多采用直径4厘米，厘米，长约长约20cm，前端内壁装有光源的聚乙烯管前端内壁装有光源的聚乙烯管(圆筒开膣器圆筒开膣器)代替传统开膣器实施输精，效果较好。马鹿可采用直代替传统开膣器实施输精，效果较好。马鹿可采用直肠把握输精。肠把握输精。 魏海军采用魏海军采用腹腔镜法腹腔镜法给梅花鹿母鹿输精，给梅花鹿母鹿输精，输精部位直达子宫角，输精部位直达子宫角，1998 年受胎率达年受胎率达57%。直肠把握输精法直肠把握输精法是是目目前前在在马马鹿鹿繁繁殖殖中中应应用用最最广广泛泛的的方方法法，一一般般人人工输精准胎率都在工输精准胎率都在90以上。以上。操作方法是输精员剪短并磨平指甲戴上塑料手套，操作方法是输精员剪短并磨平指甲戴上塑料手套，用温肥皂水充分灌肠，排出宿粪，一手伸入直肠用温肥皂水充分灌肠，排出宿粪，一手伸入直肠并隔着直肠壁找到并握住子宫颈，使子宫颈口握并隔着直肠壁找到并握住子宫颈，使子宫颈口握于手心内，另一手持输精枪，从阴道前庭入口斜于手心内，另一手持输精枪，从阴道前庭入口斜向与直肠内手壁呈向与直肠内手壁呈75角缓缓插入，当枪头部位角缓缓插入，当枪头部位进入后，再将输精枪后端抬起呈平行状态缓缓插进入后，再将输精枪后端抬起呈平行状态缓缓插入阴道内通过双手相互配合，使输精枪找到并插入阴道内通过双手相互配合，使输精枪找到并插入子宫颈口，通过入子宫颈口，通过4个子宫颈皱褶，将精液注入个子宫颈皱褶，将精液注入到子宫体内。然后撤回输精枪。输精时必须轻插，到子宫体内。然后撤回输精枪。输精时必须轻插，慢注，缓出，防止精液倒流和生殖道损伤。慢注，缓出，防止精液倒流和生殖道损伤。 优点优点 用具简单，操作安全，不易感染，母鹿用具简单，操作安全，不易感染，母鹿无痛感刺激，初配的育成马鹿都可使用；无痛感刺激，初配的育成马鹿都可使用；输精部位深，受胎率较开膣器法大幅度输精部位深，受胎率较开膣器法大幅度提高。提高。 圆筒式开膣器输精法圆筒式开膣器输精法此方法主要用于梅花母鹿输精。操作方法是把此方法主要用于梅花母鹿输精。操作方法是把已麻醉的待输精母鹿抬到输精台上，身体与头已麻醉的待输精母鹿抬到输精台上，身体与头向下倾斜向下倾斜30角，术者将直径角，术者将直径3.3cm，长长25cm的的圆筒开膣器事先消毒，然后用生理盐水浸湿，圆筒开膣器事先消毒，然后用生理盐水浸湿，徐徐插入阴道。使开膣器前端紧靠子宫颈口处，徐徐插入阴道。使开膣器前端紧靠子宫颈口处，借助灯泡光线，找到子宫颈口。另一手将已装借助灯泡光线，找到子宫颈口。另一手将已装好精液的输精枪插入子宫颈内好精液的输精枪插入子宫颈内23cm，注入精注入精液，接着慢慢取出输精枪，每只母鹿输精要用液，接着慢慢取出输精枪，每只母鹿输精要用消毒好的枪头单独使用，不能重复使用。消毒好的枪头单独使用，不能重复使用。 腹腔镜输精法腹腔镜输精法适用于很难通过子宫颈输精的中小型鹿的输精。适用于很难通过子宫颈输精的中小型鹿的输精。操作方法是将发情母鹿或经过同期发情后的母操作方法是将发情母鹿或经过同期发情后的母鹿，麻醉保定在特制保定台上，头斜向下，与鹿，麻醉保定在特制保定台上，头斜向下，与地面呈地面呈30角。剪去腹中线到乳房前的腹毛，洗角。剪去腹中线到乳房前的腹毛，洗净消毒处理后，在乳房前净消毒处理后，在乳房前10cm的腹正中线的两的腹正中线的两侧皮肤各切侧皮肤各切2cm的小切口，在一侧放入充气管，的小切口，在一侧放入充气管，充入充入CO2，供给腹内光源，通过刺入套管针，供给腹内光源，通过刺入套管针，将腹腔内窥镜伸入腹腔，观察子宫角及排卵点将腹腔内窥镜伸入腹腔，观察子宫角及排卵点情况。情况。腹腔镜输精法腹腔镜输精法通过对侧的切口，借助内窥镜把卵巢上有黄通过对侧的切口，借助内窥镜把卵巢上有黄体发育一侧的子宫角用牵引钳拉出，在子宫体发育一侧的子宫角用牵引钳拉出，在子宫角远端角远端1/3处输入解冻后的精液，然后放回子处输入解冻后的精液，然后放回子宫角，伤口缝合一针，注射宫角，伤口缝合一针，注射160万单位青霉万单位青霉素或其他长效抗菌素，手术结束后注射苏醒素或其他长效抗菌素，手术结束后注射苏醒灵药物使母鹿苏醒。采用此种输精方法，灵药物使母鹿苏醒。采用此种输精方法，7人配合，每小时可完成人配合，每小时可完成1520只母鹿的输精。只母鹿的输精。 输精次数输精次数马马鹿鹿可可在在每每一一个个发发情情期期输输精精一一次次，也也可可在在第第一一次次输输精精后后间间隔隔8h再再输输精精一一次次。梅梅花花母鹿在一个发情期内输精母鹿在一个发情期内输精2次为宜。次为宜。 七、母鹿的同期发情与胚胎移植七、母鹿的同期发情与胚胎移植（一）母鹿同期发情的意义（一）母鹿同期发情的意义1、便于人工输精技术的推广和应用。、便于人工输精技术的推广和应用。2、便于合理组织大规模养鹿生产和科学化的饲养、便于合理组织大规模养鹿生产和科学化的饲养 管理。管理。3、同期发情是胚胎移植工作的基础。、同期发情是胚胎移植工作的基础。4、提高母鹿的繁殖力，减少空怀和不孕。、提高母鹿的繁殖力，减少空怀和不孕。（二）同期发情的方法（二）同期发情的方法1、阴道栓塞法、阴道栓塞法2、口服药物法、口服药物法3、埋植法、埋植法4、前列腺素法、前列腺素法（三）鹿胚胎移植（三）鹿胚胎移植1、胚胎移植的意义：、胚胎移植的意义：充分利用优秀母鹿的繁殖力，充分利用优秀母鹿的繁殖力，短期内繁殖更多优秀后代；加快育种进程。短期内繁殖更多优秀后代；加快育种进程。2、基本技术程序、基本技术程序 选择繁殖力高的母鹿做供体母鹿选择繁殖力高的母鹿做供体母鹿选择生产力选择生产力一般的母鹿作受体母鹿，并与供体母鹿做同期发一般的母鹿作受体母鹿，并与供体母鹿做同期发情处理情处理供体母鹿超数排卵供体母鹿超数排卵优良种鹿精液输精优良种鹿精液输精收集胚胎收集胚胎胚胎精检（胚胎分级分期、胚胎分胚胎精检（胚胎分级分期、胚胎分割、性别鉴定、冻存等）割、性别鉴定、冻存等）手术胚胎移植手术胚胎移植妊娠妊娠分娩分娩