第三节：紫外可见分光光度计第一部分第一部分 紫外紫外- -可见吸收光谱法的原理可见吸收光谱法的原理第二部分第二部分 紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计构造与类型构造与类型第三部分三部分 紫外紫外- -可见分光光度计的应用可见分光光度计的应用第四部分第四部分 紫外紫外- -可见吸收光谱分析的条件和影响因素可见吸收光谱分析的条件和影响因素第五部分第五部分 仪器的使用操作、维护仪器的使用操作、维护 第一部分第一部分 紫外紫外- -可见吸收光谱法的原理可见吸收光谱法的原理一、基本原理一、基本原理:光的选择性吸收光的选择性吸收 分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁，而产生了相应的吸收光谱。属分子吸收光谱。 紫外-可见吸收光谱分析是研究物质在紫外-可见光波下的分子吸收光谱的分析方法。 紫外-可见区可细分为： （1）10-200nm；远紫外光区 （2）200-400nm；近紫外光区 （3）400-800nm；可见光区可见光：可见光：混和光，由波长混和光，由波长400400760nm760nm的电磁波按适当强度的电磁波按适当强度比例混合而成，因人们视觉可觉查到，故称为可见光。比例混合而成，因人们视觉可觉查到，故称为可见光。 紫外光：紫外光：电磁波的波长小于电磁波的波长小于400nm400nm。 红外光：红外光：电磁波的波长大于电磁波的波长大于760nm760nm。吸光光度法基本理论吸光光度法基本理论1、光谱的分类q单色光：具有同一波长的光称为单色光。单色光：具有同一波长的光称为单色光。q复合光：含有多种波长的光称为复合光。复合光：含有多种波长的光称为复合光。q互补光：如果把适当颜色的两种光按一定强度比例混合，互补光：如果把适当颜色的两种光按一定强度比例混合， 可合成白色光，这两种颜色的光称为互补色。可合成白色光，这两种颜色的光称为互补色。2、几种光的性质3、 紫外-可见分光光度法概念q紫外紫外- -可见分光光度法是基于物质分子对可见分光光度法是基于物质分子对200200760nm760nm区域光的区域光的选择性吸收选择性吸收而建立起来的分析方法。而建立起来的分析方法。 引引 入入q 问题：为什么问题：为什么不同的物质呈现不同的颜色？不同的物质呈现不同的颜色？ 原原 因因q 由于由于物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收引起的，引起的， 溶液呈现的是被吸收物质的互补色。溶液呈现的是被吸收物质的互补色。 KMnOKMnO4 4水溶液呈水溶液呈紫红色，紫红色，K K2 2CrCr2 2O O7 7水溶液呈水溶液呈橙色。橙色。 许多物质的溶液本身是许多物质的溶液本身是无色或浅色无色或浅色的的，但它们与某些试，但它们与某些试剂发生反应后生成有色物质，剂发生反应后生成有色物质，例如例如FeFe3+3+与与SCNSCN- -生成生成血红色血红色配合配合物；物；FeFe2+2+与邻二氮菲生成与邻二氮菲生成红色红色配合物。配合物。 若把两种适当颜色的光按一定强度比例混合，得到白若把两种适当颜色的光按一定强度比例混合，得到白 光，那么这两种光就是互补光，其颜色就是互补色。光，那么这两种光就是互补光，其颜色就是互补色。4、 互补光与互补色5、 溶液对光的选择性吸收 溶液呈现不同的颜色是由于该溶液呈现不同的颜色是由于该溶液对光具有选择性吸收溶液对光具有选择性吸收。 当入射光（白光）全部透过溶液时当入射光（白光）全部透过溶液时溶液无色透明。溶液无色透明。 当入射光（白光）全部被溶液吸收时当入射光（白光）全部被溶液吸收时溶液黑色。溶液黑色。 当入射光（白光）通过当入射光（白光）通过KMnOKMnO4 4溶液时，该溶液选择性吸收绿溶液时，该溶液选择性吸收绿色波长的光，而将其它的色光两两互补成白光而通过，只剩下色波长的光，而将其它的色光两两互补成白光而通过，只剩下紫红色，未被互补，所以紫红色，未被互补，所以KMnOKMnO4 4呈现紫色。呈现紫色。例如：例如：K K2 2CrOCrO4 4吸收蓝色光，溶液呈黄色吸收蓝色光，溶液呈黄色 CuSOCuSO4 4溶液吸收黄光，呈现蓝色。溶液吸收黄光，呈现蓝色。物质物质结构不同结构不同跃迁跃迁时吸收和辐射的时吸收和辐射的能量不同能量不同对应的波长不同对应的波长不同 q 问题：为什么不同的物体对光具有选择性吸收？问题：为什么不同的物体对光具有选择性吸收？ 物体的颜色是由于物体对光的选择性吸收的结果物体的颜色是由于物体对光的选择性吸收的结果。其颜色就是物体吸收某种光的互补光的颜色。其颜色就是物体吸收某种光的互补光的颜色。是透射光的颜色。是透射光的颜色。 当一束平行的波长为入的当一束平行的波长为入的单色光单色光通过一均匀的有色通过一均匀的有色溶液时，光的一部分溶液时，光的一部分被容器的表面反射被容器的表面反射回来，一部分回来，一部分被被溶液吸收溶液吸收，一部分则，一部分则透过溶液透过溶液。如图所示：如图所示：6、 溶液对光的行为吸收能量守恒定律：能量守恒定律：I I0 0=I=Ia a+I+Ir r+I+It t 由于器皿相同，且反射小，所以由于器皿相同，且反射小，所以 I Ir r 0 0 I I0 0= I= Ia a + I+ It t 通过测量通过测量I It t的大小，求出吸收的光强的大小，求出吸收的光强I Ia a，I It t，吸吸收越少，透光强越多。收越少，透光强越多。 I I0 0 入射光的强度入射光的强度I Ia a 被吸收光的强度被吸收光的强度I Ir r 反射光的强度反射光的强度I It t 透过光的强度透过光的强度T=IT=It tII0 0TT，I It t，吸收吸收取值范围取值范围 ： 01由于由于T1T1，所以常用百分透过率所以常用百分透过率 ，即，即T%=TT%=T100%100%透光度（率）透光度（率）T T透过光强与入射光强之比透过光强与入射光强之比透透光光度度吸吸光光度度吸光度吸光度A A 透光率倒数的对数或透光率透光率倒数的对数或透光率的的负对数负对数。A A = = lg1lg1/ /T T = =- - lgIlgIt t/ /I I0 0= = lgI lgI0 0/ /I It tAA，I It t吸收吸收T:0T:01 1 A A的取值范围：的取值范围： 0 0 光的光的吸收程度与光程长的关系？吸收程度与光程长的关系？二、光的吸收定律二、光的吸收定律 朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律 若溶液浓度保持不变，入射光被溶液吸收的多少与溶液若溶液浓度保持不变，入射光被溶液吸收的多少与溶液液层厚度成正比。液层厚度成正比。 ALAL 在单色光的条件下，液层厚度保持不变在单色光的条件下，液层厚度保持不变, ,入射光被溶液入射光被溶液吸收的多少，与溶液浓度成正比吸收的多少，与溶液浓度成正比 。 ACAC 二、光的吸收定律二、光的吸收定律 朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律 当当一一束束平平行行的的单单色色光光通通过过均均匀匀、非非散散射射性性的的稀稀溶溶液液时时，溶溶液液对对光光的的吸吸收收程程度度与与溶溶液液的的浓浓度度及及液液层层厚厚度度的的乘乘积积成成正正比比，该式是该式是分光光度法的定量分析依据。分光光度法的定量分析依据。朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律 数学表达式：数学表达式：A=KCLA=KCL 二、光的吸收定律二、光的吸收定律 朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律A=KCLA=KCL 朗伯朗伯- -比耳定律不仅适用于有色溶液，也可适用于其比耳定律不仅适用于有色溶液，也可适用于其他均匀非散射的吸光物质（包括液体、气体和固体）；他均匀非散射的吸光物质（包括液体、气体和固体）； 该定律应用于单色光，既适用于可见光，也适用于红该定律应用于单色光，既适用于可见光，也适用于红外光和紫外光，是各类吸光光度法的定量依据；外光和紫外光，是各类吸光光度法的定量依据； 吸光度具有加和性，是指溶液的总吸光度等于各吸光吸光度具有加和性，是指溶液的总吸光度等于各吸光物质的吸光度之和。物质的吸光度之和。吸光度、吸光度、透光度透光度及浓度的关系：及浓度的关系：摩尔吸光系数摩尔吸光系数k k的讨论的讨论 吸收物质在一定波长和溶剂条件下的吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数特征常数 可作为可作为定性鉴定定性鉴定的参数；的参数； 不随不随浓度浓度c c和和光程长度光程长度b b的改变而改变的改变而改变。 温度和波长等条件一定时，温度和波长等条件一定时，k k仅与吸收物质本身的性质仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；有关，与待测物浓度无关； 同一吸收物质在同一吸收物质在不同波长不同波长下的下的k k值是值是不同不同的。的。 在最大吸收波长在最大吸收波长maxmax处的摩尔吸光系数，常以处的摩尔吸光系数，常以k kmaxmax表表示。示。 k kmaxmax表明了该表明了该吸收物质最大限度的吸光能力吸收物质最大限度的吸光能力，也反，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。 kmaxkmax越大越大表明该物质的吸光能力越强，表明该物质的吸光能力越强，用光度法测用光度法测定该物质的定该物质的灵敏度越高。灵敏度越高。 k k在数值上等于在数值上等于浓度为浓度为1mol/L1mol/L、液层厚度为、液层厚度为1cm1cm时该时该溶液在某一波长下的吸光度。溶液在某一波长下的吸光度。 标标准准曲曲线线法法测测定定未未知知溶溶液液的的浓浓度度时时发发现现：标标准准曲曲线线常常发发生生弯弯曲曲（尤尤其其当当溶溶液液浓浓度度较较高高时时），这这种种现现象象称称为为对对朗朗伯伯比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。 引起这种偏离的因素（两大类）：引起这种偏离的因素（两大类）： 物理性因素物理性因素：仪器的非理想引起；：仪器的非理想引起； 入射光不是单色光入射光不是单色光 化学性因素。化学性因素。 只适用浓度小于只适用浓度小于0.01mol/L0.01mol/L的稀溶液的稀溶液偏离朗伯偏离朗伯比耳定律的原因比耳定律的原因朗朗比耳定律的假定：比耳定律的假定： 所有的吸光质点之间不发生相互作用；所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液假定只有在稀溶液( (c c1010 102 2mol/L mol/L 时，吸光质点间可能发生时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。 故：朗伯故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液比耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。吸收光谱曲线（定性分析）q 将将不同波长不同波长的光依次通过某一的光依次通过某一固定固定浓度浓度和和厚度厚度的有色溶液，的有色溶液，分别测出它们对各种波长光的吸收程度（用吸光度分别测出它们对各种波长光的吸收程度（用吸光度A A表示）。表示）。q 以以波长为横坐标波长为横坐标，以，以吸光度为纵坐标作图吸光度为纵坐标作图，画出曲线，此曲，画出曲线，此曲线即称为该物质的线即称为该物质的光吸收曲线（或吸收光谱曲线）光吸收曲线（或吸收光谱曲线）。 结论：结论： 1、溶液对不同波长的光的吸收程度是不同的，存在、溶液对不同波长的光的吸收程度是不同的，存在最大吸收峰的位置称为最大吸收峰的位置称为最大吸收波长最大吸收波长max。 2、不同物质不同物质的吸收曲线，其的吸收曲线，其形状形状和和最大吸收波长最大吸收波长都都各不相同，可利用各不相同，可利用吸收曲线吸收曲线来作为物质来作为物质定性分析定性分析的依据。的依据。 1- c (KMnO4)=1.5610-4molL-12- c (KMnO4)=3.1210-4molL-13- c (KMnO4)=4.6810-4molL-1 3、不同浓度的溶液，其吸收曲线的形状相似，最大、不同浓度的溶液，其吸收曲线的形状相似，最大吸收波长也一样。吸收波长也一样。K KM Mn nO O4 4光光吸吸收收曲曲线线结论：结论：1 1、在可见光区内，、在可见光区内，KMnOKMnO4 4溶液对波长为溶液对波长为525nm525nm左右的左右的 绿色光的吸收程度最大；绿色光的吸收程度最大；2 2、KMnOKMnO4 4溶液入溶液入max = 525nmmax = 525nm；3 3、浓度不同时，其最大吸收波长不变，但浓度越大，、浓度不同时，其最大吸收波长不变，但浓度越大，吸收程度（光的吸光度）越大，吸收峰会越高。吸收程度（光的吸光度）越大，吸收峰会越高。吸收曲线的作用：吸收曲线的作用： 选择测定波长选择测定波长 开展定性分析开展定性分析 判断共存组份对测定有无干扰判断共存组份对测定有无干扰 第二部分第二部分 紫外紫外可见可见分光光度计构造与类型分光光度计构造与类型 基本构造主要由光源、单色器、吸收池、检测器和显示器五大部分组成。 一、紫外一、紫外-可见分光光度计的基本构造可见分光光度计的基本构造光源光源 单色器单色器 样品池样品池 检测器检测器 显示器显示器 作用作用 提供激发能提供激发能, ,使待测分子产生吸收。使待测分子产生吸收。 提供符合要求的入射光。提供符合要求的入射光。 要求要求 能够提供足够强的连续光谱能够提供足够强的连续光谱 有良好的有良好的稳定稳定性、较长的使用寿命性、较长的使用寿命, ,且辐射能量随且辐射能量随波长无明显变化。波长无明显变化。 波长范围应能满足分析的需要波长范围应能满足分析的需要, , 紫外波长紫外波长200200400400nmnm可见可见 400 400760760nmnm 1 1、光、光 源源1 1、热辐射光源、热辐射光源 用于可见光区，用于可见光区，如钨灯和碘钨如钨灯和碘钨灯灯；钨丝灯；钨丝灯发射波长为发射波长为3 3505025002500nmnm连续光谱。最适宜的连续光谱。最适宜的使用的范围在使用的范围在 3 3202010100000nmnm。2 2、气体放电光源气体放电光源 气体放电光源用于紫外光气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯区，如氢灯和氘灯。发射波长为发射波长为160160500500nmnm的连续光谱的连续光谱。最适宜最适宜的的使用的范围在使用的范围在185185375375nmnm。分类分类 入射狭缝：入射狭缝：光源的光由此进入单色器；光源的光由此进入单色器； 准光装置：准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；透镜或返射镜使入射光成为平行光束； 色散元件色散元件：将复合光分解成单色光；将复合光分解成单色光；棱镜或光栅棱镜或光栅； 聚焦装置：聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；至出射狭缝； 出射狭缝。出射狭缝。2 2、单、单 色色 器器将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出任意波长将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出任意波长单色光的光学系统。单色光的光学系统。 作用作用： 组成：组成：入射狭缝入射狭缝 准直透镜准直透镜棱棱镜镜聚焦聚焦透镜透镜出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫1 12 2800 600 500400nm 单色器的核心部分是单色器的核心部分是色散元件色散元件，起分光的作用。，起分光的作用。 色散元件主要包括：色散元件主要包括：棱镜和光栅棱镜和光栅 棱镜：棱镜：有有玻璃玻璃和和石英石英两种材料。两种材料。色散原理：色散原理： 不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率，而将不不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率，而将不同波长的光分开。同波长的光分开。光栅：光栅：是利用光的衍射与干涉作用制成的。是利用光的衍射与干涉作用制成的。 一系列等宽、等距离的平行狭缝。一系列等宽、等距离的平行狭缝。 由于玻璃可吸收紫外光，玻璃棱由于玻璃可吸收紫外光，玻璃棱镜只能用于镜只能用于4004001000nm1000nm的波长范围的波长范围即只能用于可见光域内。即只能用于可见光域内。 石英棱镜可使用的波长范围较石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从宽，可从1851854000nm4000nm，即可用于，即可用于紫外、可见和近红外三个光域。紫外、可见和近红外三个光域。 可用于紫外、可见及红外光域，且在整可用于紫外、可见及红外光域，且在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。能力。优点：色散波长范围宽、分辨本领高、优点：色散波长范围宽、分辨本领高、 成本低、便于保存和易于制备等优。成本低、便于保存和易于制备等优。缺点：各级光谱会重叠而产生干扰。缺点：各级光谱会重叠而产生干扰。 吸收池又叫比色皿：吸收池又叫比色皿：q作用：作用： 用于盛放待测溶液和决定透光液层厚度的器件。用于盛放待测溶液和决定透光液层厚度的器件。q 主要有主要有石英石英吸收吸收池池和和玻璃吸收池玻璃吸收池两种。两种。 石英石英吸收吸收池池紫外区须采用紫外区须采用 350350nmnm 玻璃玻璃吸收吸收池池可见区一般用。可见区一般用。 350350nmnm3 3、吸、吸 收收 池池q 主要规格主要规格0.5cm0.5cm、1.0cm1.0cm、2.0cm2.0cm、3.0cm3.0cm和和5.0cm5.0cm如何如何鉴别：鉴别：分别用紫外光测定，若有吸收的为玻璃比色皿分别用紫外光测定，若有吸收的为玻璃比色皿注意事项：注意事项： 手执两侧的毛面，盛放液体高度四分之三手执两侧的毛面，盛放液体高度四分之三。 不得将光学面与硬物或脏物接触，不得将光学面与硬物或脏物接触，先先用滤纸吸干水，再用滤纸吸干水，再用镜头纸或丝绸用镜头纸或丝绸擦拭。擦拭。 含有腐蚀玻璃组分（如：含有腐蚀玻璃组分（如：F F- -,H,H3 3POPO4 4等）的溶液，不得长等）的溶液，不得长期盛放在比色皿中。期盛放在比色皿中。 比色皿使用后应立即用水洗干净。若脏物洗不掉，可用比色皿使用后应立即用水洗干净。若脏物洗不掉，可用3mol/L3mol/L盐酸盐酸乙醇（乙醇（1 11 1）溶液浸泡，然后用水洗净。）溶液浸泡，然后用水洗净。 不得在火焰或电炉上加热或烘烤比色皿。不得在火焰或电炉上加热或烘烤比色皿。q 作用：作用： 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号。q 常用的常用的检测器有检测器有光电池、光电管光电池、光电管及及光电倍增管光电倍增管。4 4、检测器、检测器（ 光电转换器光电转换器 ）光电倍增管光电倍增管 光电池光电池 光电管光电管信号显示器信号显示器q 以以检流计或微安表检流计或微安表指示仪表指示仪表q 数字显示和自动记录型装置数字显示和自动记录型装置 5 5、信号显示系统、信号显示系统 (一)按仪器使用波长分类： 真空紫外分光光度计（0.1-200 nm）； 可见分光光度计（350-700 nm）； 紫外-可见分光光度计（190-1100 nm）； 紫外-可见-红外分光光度计（190-2500 nm）；（二）按仪器使用的光学系统分类： 单光束分光光度计； 双光束分光光度计 双波长分光光度计 动力学分光光度计二、紫外二、紫外-可见分光光度计的分类及特点可见分光光度计的分类及特点 （）单光束分光光度计 经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。 简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。 样品池样品池 参比池参比池 （）双光束分光光度计 经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。 自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。M1M4参比池样品池M2M3岛津UV-2450 （）双波长分光光度计 由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（1和2）的单色光；通过折波器以一定的频率交替通过同一样品池，然后由检测器交替接收信号，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值A。 无需参比池。A就是扣除了背景吸收的吸光度。 对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。双波长BECKMAN-DU_640（）动力学分光光度计 解决在光化学反应、辐射化学反应和酶催化反应中，能量转化、酶的降解、生物合成等的反应变化。 特点：时间辨别、快速扫描、测定生物化学瞬间产物的吸收光谱和随时间变化值。 （三）紫外（三）紫外- -可见分光光度计主要技术指标可见分光光度计主要技术指标1.波长范围：表示仪器能测定的波长范围。波长范围越大，仪器越好，这与仪器使用的灯有关。2.波长精度：表示仪器单色器波长误差程度。波长误差越小，仪器精度越高，这与仪器使用的单色器有关。3.杂散光：表示单色光的纯度，这与制作单色器的材料和加工工艺有关。4.光度的测量精度：表示仪器每次测定显示读数的精确度，即仪器能准确读小数点后几位。位数越多，仪器精度越高，这与仪器使用的检测系统有关。5.光度测量的重现性：每次A读数的重现性，这与仪器使用的检测器的质量有关。6.分辨率：表示仪器分辨吸收光谱微细结构的能力，即指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长间距，这是衡量仪器性能的一个综合指标。 第三部分第三部分紫外紫外- -可见吸收光谱法的应用可见吸收光谱法的应用一一、定性分析、定性分析 通常根据吸收光谱的形状、吸收峰的数目以及最大吸收波长的位置和相应的摩尔吸收系数进行定性鉴定。 一般采用比较光谱法：即在相同的测定条件下，比较待测物与已知标准物的吸收光谱曲线，如果它们的吸收光谱曲线完全等同，则可认为是同一物质。在进行定性鉴定时，需要注意：1.测试溶剂：应当对标准物和待测物有良好的溶解度，本身在测定的波长内无光的吸收，有良好的稳定性。2.测试的条件：标准物和待测物测试条件要完全相同，如溶剂、PH、离子强度、温度及所用仪器等。3.更改测试条件：为了防止测试数据的假象，要对现有某些条件进行适当的变换，改变其中的某些测定条件，然后看标准物和待测物的吸收光谱是否仍然完全相同。二二、结构分析、结构分析 判断所含官能团、有机化合物的同分异构体。 （例如：某一化合物在250-300nm有强吸收带，则表示存在苯环的特征吸收；若在210-350nm有强吸收带，则可能含有两个双键的共轭单位。）三、三、纯度鉴定纯度鉴定 根据在吸收光谱最大吸收峰的位置和峰形状、数量判断该物质的纯度。四四、定量分析、定量分析 根据朗伯比尔定律，物质在一定波长处的吸光度与它的浓度呈线性关系。所以通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，便可求得溶液的浓度和含量。紫外可见分光光度法不仅用于测定微量成分，而且用于常量组分和多组分混合物的测定。 定性分析与定量分析的基础定性分析基础定性分析基础物质对光的选择吸收物质对光的选择吸收物物质的电子结构不同，所能吸收质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。物质对光的选择吸收基础。ABA 定量分析基础定量分析基础在一定的实验条件下，在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质物质对光的吸收与物质的浓度成正比。的浓度成正比。AC增增大大吸收曲线吸收曲线吸收曲线吸收曲线ABA A A 吸收曲线吸收曲线吸收曲线吸收曲线A同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max。 同一物质的浓度不同时，光吸收曲线形状相同，最大吸收波长不变，只是相应的吸收度大小不同。 物质不同，其分子结构不同，则吸收光谱曲线不同，最大吸收波长也不同。 所以可以根据吸收光谱曲线对物质进行定性鉴定和定量分析。 物质对光的吸收特征，可以用吸收曲线来描述。以入射光的波长为横坐标，溶液的吸光度A为纵坐标作图，得到的曲线即为该物质的紫外-可见吸收曲线或吸收光谱。 吸收曲线表明了物质对不同波长的入射光的吸收能力。 （一）（一）用作图法绘制标准曲线用作图法绘制标准曲线配制不同浓度的标准溶液，由低浓度至高浓度依次测定配制不同浓度的标准溶液，由低浓度至高浓度依次测定其吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，其吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，即标准曲线。即标准曲线。通过标准曲线可求得未知样品的浓度。通过标准曲线可求得未知样品的浓度。 定量分析方法标准曲线法步骤步骤 : :. .在相同条件下，配制系列标准溶液：在相同条件下，配制系列标准溶液：C C1 1、C C2 2、C Cn n（n n5 5）. .在相同的条件下，分别测定标液的吸光度值在相同的条件下，分别测定标液的吸光度值：A A1 1、A A2 2、A An n. . 绘制工作曲线：绘制工作曲线：A A纵坐标纵坐标 C C横坐标横坐标 . .在与标准溶液相同的条件下，处理样品并测定得在与标准溶液相同的条件下，处理样品并测定得A AX X. .通过通过A AX X在曲线上查找并求解在曲线上查找并求解C CX X。 （注意分析结果应为原始浓度）注意分析结果应为原始浓度）方法的特点：方法的特点： 对大批样品的测定对大批样品的测定简便、快速。简便、快速。 x为标准溶液的浓度;y为相应的吸光度;a,b称回归系数 设工作曲线方程为y=a+bx可以通过计算公式直接得到a、b与的数值。 相关系数接近1，说明工作曲线线性好。 （二）用最小二乘法确定直线回归方程（二）用最小二乘法确定直线回归方程测定时，为避免使用时出差错，所作工作曲线上必须标明测定时，为避免使用时出差错，所作工作曲线上必须标明标准曲标准曲线的名称线的名称、所用、所用标准溶液（或标样）名称和浓度标准溶液（或标样）名称和浓度、坐标分度和单位坐标分度和单位、测量条件测量条件（仪器型号、入射光波长、吸收池厚度、参比液名称）以（仪器型号、入射光波长、吸收池厚度、参比液名称）以及及制作日期制作日期和和制作者姓名制作者姓名。 能正确选择显色条件（显色剂的用量、酸度的控制）能正确选择显色条件（显色剂的用量、酸度的控制）能正确选择测量条件能正确选择测量条件 （工作波长、参比溶液）（工作波长、参比溶液）能正确分析测定过程可能产生的误差能正确分析测定过程可能产生的误差 能力目标能力目标分析测试条件的选择分析测试条件的选择 显色反应：显色反应： 在光度分析中，将试样中被测组分转变成有色化在光度分析中，将试样中被测组分转变成有色化合物的反应。合物的反应。影响条件：影响条件： 显色剂用量显色剂用量、溶液酸度溶液酸度、显色温度显色温度、显色时间显色时间、共存离子干扰共存离子干扰等。等。 显色反应条件的选择显色反应条件的选择 指有色物质指有色物质形成形成所所需的时间及有色物需的时间及有色物稳定稳定的时间。绘制的时间。绘制A-tA-t（min)min)曲线，选择曲线，选择A A较大且稳定较大且稳定的时间内进行。的时间内进行。显色时间显色时间测定浓度的选择测定浓度的选择 溶液吸光度值在溶液吸光度值在0.20.20.80.8范围内光度测量误差小范围内光度测量误差小(A=0.434(A=0.434时误差最小时误差最小) )，因此可根据样品的摩尔吸光系，因此可根据样品的摩尔吸光系数确定最佳浓度。数确定最佳浓度。 共存离子的干扰与消除共存离子的干扰与消除 共存离子本身有颜色共存离子本身有颜色共存离子与显色剂反应生成有色化合物或沉淀共存离子与显色剂反应生成有色化合物或沉淀共存离子与被测离子或显色剂作用，降低有效浓度共存离子与被测离子或显色剂作用，降低有效浓度干扰的消除：干扰的消除：控制溶液的酸度控制溶液的酸度加入掩蔽剂，掩蔽干扰离子。加入掩蔽剂，掩蔽干扰离子。改变干扰离子的价态以消除干扰改变干扰离子的价态以消除干扰选择适当的入射光波长消除干扰选择适当的入射光波长消除干扰选择合适的参比溶液选择合适的参比溶液分离干扰离子分离干扰离子 参比参比溶液的选择溶液的选择常用的空白溶液：常用的空白溶液： 溶剂空白、试剂空白、溶剂空白、试剂空白、试样空白、试样空白、平行操作空白平行操作空白定义：定义：空白溶液也称参比溶液空白溶液也称参比溶液作用：作用：测量试液的吸光度时测量试液的吸光度时, ,先用参比溶液调节透光度为先用参比溶液调节透光度为100%,100%,以以消除消除溶液中溶液中其它成组分其它成组分、吸收池吸收池和和溶剂溶剂对入射光对入射光的反射和吸收的反射和吸收所带来的误差所带来的误差。参比溶液的选择一般遵循以下原则：参比溶液的选择一般遵循以下原则： 若仅若仅待测组分与显色剂反应产物待测组分与显色剂反应产物在测定波长处在测定波长处有吸收有吸收，其，其它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水) )作参比溶液；作参比溶液； 若显色剂或其它所加试剂在测定波长处若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收略有吸收，而试液，而试液本身无吸收，用本身无吸收，用“试剂空白试剂空白”( (不加试样溶液不加试样溶液) )作参比溶液；作参比溶液； 若待测试液在测定波长处若待测试液在测定波长处有吸收有吸收，而显色剂等在此，而显色剂等在此无吸收无吸收则可用则可用“试样空白试样空白”( (不加显色剂不加显色剂) )作参比溶液；作参比溶液； 若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸收，则可在若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸收，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂溶液，试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂溶液，作为参比溶液。作为参比溶液。 溶剂空白溶剂空白 当溶液中只有待测组分在测定波长下有吸收当溶液中只有待测组分在测定波长下有吸收, ,而其它而其它组分均无吸收时组分均无吸收时, ,可用纯溶剂作参比溶液。可用纯溶剂作参比溶液。 试剂空白试剂空白 如果显色剂和其它试剂有吸收时如果显色剂和其它试剂有吸收时, ,而待测溶液无吸收则而待测溶液无吸收则取用不加待组分的其它试剂作为参比溶液取用不加待组分的其它试剂作为参比溶液( (只是不加待测只是不加待测组分。组分。 平行操作空白平行操作空白 用溶剂代替试样溶液，以与试样完全相同的分析步骤用溶剂代替试样溶液，以与试样完全相同的分析步骤操作，用所得的溶液做空白。操作，用所得的溶液做空白。 一般当吸光度控制在一般当吸光度控制在0.20.20.80.8时，浓度测量的相时，浓度测量的相对误差较小，这就是适宜的吸光度范围。对误差较小，这就是适宜的吸光度范围。 在实际测量中应创造条件使测量在适宜的吸光度范在实际测量中应创造条件使测量在适宜的吸光度范围内进行，可以采用下面的方法对吸光度进行调整：围内进行，可以采用下面的方法对吸光度进行调整：调节被测溶液的浓度；调节被测溶液的浓度；使用厚度不同的吸收池。使用厚度不同的吸收池。 吸光度范围的选择吸光度范围的选择 吸收池的使用吸收池的使用 选择适宜规格的吸收池，尽量把吸光度值调整在选择适宜规格的吸收池，尽量把吸光度值调整在0.20.20.80.8之间。同一实验使用同一规格的同一套吸收池之间。同一实验使用同一规格的同一套吸收池测定水样中微量铁的含量测定水样中微量铁的含量应用：应用： 方案设计框架方案设计框架根据项目根据项目查阅资料查阅资料设计实验设计实验方案方案优化实验优化实验方案方案选择合适选择合适的仪器的仪器组建实验组建实验仪器及设仪器及设备备正确规范正确规范操作操作准确记录准确记录数据数据正确处理正确处理数据数据准确表述准确表述分析结果分析结果 综合分析，一般综合分析，一般选择可见分光光度法。选择可见分光光度法。 确定分析方法确定分析方法测定铁离子含量各仪器分析方法间的比较测定铁离子含量各仪器分析方法间的比较方法方法可见分光光度方法可见分光光度方法原子吸收方法原子吸收方法ICP-AESICP-AES方法方法原理原理邻二氮菲分光光度法，最邻二氮菲分光光度法，最大波长大波长510nm510nm将样品直接吸入火焰中，于波长将样品直接吸入火焰中，于波长248.3nm248.3nm处测量铁基态原子对其空心阴处测量铁基态原子对其空心阴极灯特征辐射的吸收极灯特征辐射的吸收采用电感耦合等离子采用电感耦合等离子发射炬为光源的发射发射炬为光源的发射光谱。光谱。最低检测最低检测限限1010-4-41010-5-5g/Lg/L火焰：火焰： 1010-6-6g/Lg/L；无火焰：无火焰：1010-10-101010-14-14g/Lg/L1010-9-9g/Lg/L相对相对误差误差2%5%2%5%火焰：火焰：1%1%；无火焰无火焰3%5%3%5%1%102 mol/L 时，溶质间可能发生缔合、解离、配位等相互作用，形成新化合物，直接影响了对光的吸收，导致偏离朗伯比尔定律。 朗伯-比尔定律只适合稀溶液使用。(c 10-2 mol/L)。 研究证明： 当光吸收值小于0.1和大于1.0时，测量偏差超过10%，而当在0.1-1.0之间时，测量偏差小于10%，测量值有效可信。 A=-lgT= 0.434时，浓度测定误差最小。所以通常取 A= 0.2-0.8 （T=15%-65%）为紫外-可见光度分析的吸光度范围或称浓度范围。 介质不均匀性：朗伯比尔定律是适合于均匀，非散射的溶液。 如果被测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光通过溶液后，除一部分被试液吸收外，还有一部分因散射现象而损失，使透射比减少，因而实测吸光度增加，使标准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲。故在光度法中应避免溶液产生胶体或混浊。（二）实验条件的选择（二）实验条件的选择（1）溶剂选择溶剂应能很好地溶解被测试样，溶剂对溶质应该是惰性的。即所成溶液应具有良好的化学和光化学稳定性。 在溶解度允许的范围内，尽量选择极性较小的溶剂。溶剂在样品的吸收光谱区应无明显吸收。 （2）测量波长的选择 为了提高测定的灵敏度，入射光的波长应选择被测物的最大吸收波长max，如果max有干扰，可选择另一条灵敏度稍低，但能避免干扰的谱线，所以，适当选择入射光的波长，还能提高测定的灵敏度。（3）控制适当的吸光度范围 0.2-0.8 可从两个方面着手解决： a.控制被测物浓度 b.改变吸收池的厚度（4）选择适当的参比溶液作空白 用参比溶液调节仪器的零点，以消除由于样品池及溶剂、干扰物质对入射光的反射和吸收带来的误差，所以根据不同情况选择不同的空白。三、显色反应及其影响因素（三、显色反应及其影响因素（M+R MRM+R MR）（1）显色剂用量 在实际选用时，一般通过实验来确定：待测组分的浓度和其他条件不变，分别加入不同量的显色剂，分别测定它们的吸光度，以吸光度为纵坐标，显色剂用量为横坐标作图。在对应于吸光度恒定时对应的显色剂浓度区间内确定显色剂的用量。 (2)显色时间和反应温度 不同的显色反应的速度不同，而且反应温度对反应的速度以及反应产物等均有影响。因此，需要根据反应性质选择合适的显色时间和反应温度。 (3)反应体系的酸度 酸度对吸光光度分析的影响很复杂，它可以影响配合反应的进行程度，改变金属离子的存在形式和显色剂的颜色，为了选择合适的PH，必须综合考虑各方面的影响，适宜的酸度要由实验来确定。 (4)采用适当的手段消除干扰物质的干扰 分离物与干扰物的分离：通过前处理，使分析物与干扰物相互分离，然后进行分析，常用的分离方法有：萃取法、离子交换法、电解法、色谱法等。 加入掩蔽剂：在被测液中加入与干扰物质产生稳定的无色络合物的试剂，使干扰物不与显色剂作用。 选择适当的波长：一般选择max为入射光波长。如果max处有共存组分干扰时，应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。选择合适的参比溶液： 1.若被测液（M），显色液（R）及其它试剂均为无色，H2O作空白。2.若显色剂与其它试剂均为无色，而被测液中其它离子有色时，不加显色剂的被测液作参比。3.若显色剂、其它试剂及被测液均有色，可在被测液中加入掩蔽剂，使被测组分掩蔽起来而不与显色剂作用，然后加入显色剂的溶液作参比溶液，这样可消除一些共有离子的干扰。 第五部分第五部分仪器的使用操作及维护仪器的使用操作及维护一、仪器的使用操作规程1.准备工作1.1打开光度计主机电源（预热20-30 min）。1.2开启计算机电源。1.3 双击UV-Probe图标，即启动UV-2450的控制程序。1.4 单击连接键，进入光度计自检，自检过程中切勿开启样品室门。自检完毕后，单击确定键进入检测界面。2. 测定2.1 2.1 光谱扫描光谱扫描参数和显示的设置、空白基线校正、供试品测量、光谱测定、数据处理 。2.2 2.2 光度测定光度测定参数和显示的设置、空白基线校正、标准品测量、供试品测量。2.3 2.3 动力学测定动力学测定参数和显示的设置、空白基线校正、供试品测量。3.仪器使用完毕，取出样品室内吸收池，退出UV-Probe软件系统。4.关闭计算机。5.关闭光度计电源。6.按要求做好仪器使用登记。二、仪器的维护 1.温度和湿度 室温保持在1535，相对湿度宜控制在45%80%。 防尘、防震、防电磁干扰，仪器周围不应有强磁场。不要暴露在阳光直射的地方，不要放在有腐蚀性气体或在UV波长范围内有吸收的有机和无机气体的环境内。2.如果开机后钨灯和氘灯不亮，应首先检查保险丝。若断了应更换新的保险丝。注意更换保险丝时，关闭电源开关并切断电源。3.为了防止光电管疲劳，不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命。4.光度计灯源寿命有限，若长时间不测量，应通过UVProbe软件断开连接（点击“Disconnect”），然后关闭光度计电源。5.仪器自检和扫描的过程中，不要打开样品室盖。 6.软件不会自动保存数据，所有的数据要保存都必须点击“Save”或者“Save As”进行另存。否则数据会丢失。 7.7.样品室的出射和入射石英窗不应有污染，不要用手触摸样品室中透光窗面，若不小心接触过，要用无水乙醇擦拭。8.比色皿的使用方法 拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。 清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。如比色皿被有机物沾污，可用盐酸-乙醇混合洗涤液（12）浸泡片刻，再用水冲洗。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。每次做完实验时，应立即洗净比色皿，用干净绸布或擦镜纸擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防尘保存。 比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，避免硬的物品把透光面划伤，以保护透光面。 测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。 吸收池装盛样品以池体的4/5为度，使用挥发性溶液时应加盖。9.9.注意软件的正常交流，防止计算机病毒感染。10.10.在停止工作期间，主机样品室内应放入袋装硅胶干燥剂。用防尘罩罩住整个仪器。三.期间核查（1）外观检查 1.1 样品室应密封良好，无漏光现象。干燥剂的位置摆放合理，无阻挡光路情况。1.2 吸收池的透光面应光洁，无划痕和斑点，任一面不得有裂纹。 1.3 仪器与计算机的接口处接触良好，光源工作正常，无灯丝熔断问题。（2）波长准确度的校正 利用氘灯的两个特征波长峰486.0nm和656.1nm来检查波长的精确度。波长的漂移范围：0.3nm。 （3）基线平坦度 扫描2001000nm的基线，吸光度的漂移范围：0.001Abs以内。 （4）时间扫描 用动力学分光光度法在500nm扫描，漂移范围：0.004Abs/h(电源启动2h后)。 四、操作规程问题处理：1、仪器不能初始化 检查光路是否受堵；关机（电脑及UV）重启；如不成功，查看说明书；2、数据或谱图波动大 调零是否正确（重新调零）、参比样值是否过大（如果吸收值大于2.0，可能会出现波动大）。 3、基线不能平整（允许波动范围在 0.001之间） 扫描速度是否过快（改“快速”扫描为“中速”扫描或更低）、波长范围是否过窄（扩大扫描波长范围）。4、吸收值异常 波长设置是否正确（重新调整波长，并重新调零）、测量时是否调零（如被误操作，重新调零）、比色皿是否用错（测定紫外波段时，要用石英比色皿）、样品准备是否有误（如有误，重新准备样品）。 5.数据不稳 预热时间不够（预热20分钟以上）；环境振动过大、光源附近空气流速大、外界强光照射等;光电管、电路等其它原因（送修）。 本节结束