HER2HER2免疫组化检测的质量控制免疫组化检测的质量控制苏州大学附属第一医院苏州大学附属第一医院郭凌川郭凌川1内容提要内容提要HER2检测的质量控制和质量保证HER2检测质量的影响因素检测前检测中检测后HER2检测的质量保证内部质保外部质保Ring研究HER2检测的质量控制和质量保证检测的质量控制和质量保证3质量体系定义质量体系定义质量控制质量控制 （QC）用以确保HER2检测结果正确性的内部验证步骤质量保证质量保证 （QA）通过与其他实验室检测结果相比较而得到的检测技术评价的方式 （例如，外部控制）Bilous M, et al. Mod Path 2003;16:173182.质量控制与质量保证有何区别？质量控制与质量保证有何区别？质控质控达到和/或维持目标质量在检测中每个步骤均进行样品检查，从而决定是否进行相关改进操作步骤的内部验证每批实验都应进行确保每个检测结果均准确质保质保旨在改善总体检测操作与其他检测中心相比较质控质控/质保原则（推荐）质保原则（推荐）内部质量控制内部质量控制a) 染色 严格遵守免疫组化或原位杂交操作步骤 设立对照组:细胞系和组织标本免疫组化评分0/1+, 2+, 3+ 需经原位杂交确定 若对照组检测未能达标，需重新进行实验b) 评分 评价:若正常组织检测为阴性而肿瘤组织检测细胞膜膜染色阳性，则免疫组化检测即以足够乳腺癌：仅浸润性肿瘤不均匀: 选择代表性区域异质性特异区域: 按最高分评分c) 实验室 设立适当对照组d) 检测步骤 难以确定的检测病例1) 重新检测2) 将免疫组化检测结果与原位杂交检测结果对比3) 咨询外部实验室e) 记录 使用标准化检测报告表 记录任何:与标准化标本处理步骤相违背的不当操作难以确定病理诊断的病例持续质量评价持续质量评价a)对相关从业人员进行教育培训b)每年重新检测约5%的阳性和阴性病例 c)参与Ring研究Adapted by permission from Macmillan Publishers Ltd; Bilous M et al. Mod Pathol 2003;16:173182. 2003.质控质控/质保原则（推荐）质保原则（推荐）内部质量控制内部质量控制a) 染色 严格遵守免疫组化或原位杂交操作步骤 设立对照组:细胞系和组织标本免疫组化评分0/1+, 2+, 3+ ，2+需经原位杂交确定 若对照组检测未能达标，需重新进行实验b) 评分 评价:若正常组织检测为阴性而肿瘤组织检测细胞膜膜染色阳性，则免疫组化检测即以足够胃癌或胃食管交界癌：选择代表性区域不均匀: 选择代表性区域异质性特异区域: 按最高分评分c) 实验室 设立适当对照组d) 检测步骤 难以确定的检测病例1) 重新检测2) 将免疫组化检测结果与原位杂交检测结果对比3) 咨询外部实验室e) 记录 使用标准化检测报告表 记录任何:与标准化标本处理步骤相违背的不当操作难以确定病理诊断的病例持续质量评价持续质量评价a)对相关从业人员进行教育培训b)每年重新检测约5%的阳性和阴性病例 c)参与Ring研究Adapted by permission from Macmillan Publishers Ltd; Bilous M et al. Mod Pathol 2003;16:173182. 2003.HER2检测质量的影响因素检测质量的影响因素8影响影响IHC检测结果之常见问题检测结果之常见问题诸多因素会影响IHC结果的评估标本固定较差标本固定较差1染色不均 细胞质染色细胞质染色, IHC 02弥散性非均一性细胞质染色标本点状假阳性染色标本点状假阳性染色2棕色点状染色为胞质染色而非胞膜染色标本边缘假阳性染色标本边缘假阳性染色1肿瘤标本边缘染色而中心无染色1.W Hanna供图; 2. Dako供图.影响影响FISH检测结果之常见问题检测结果之常见问题标本制备染色步骤固定不完全固定不完全1片状染色;信号较弱或缺失过分固定过分固定1持续性自发性荧光;信号较弱或缺失消化封闭不完全消化封闭不完全2较强自发性荧光；背景亦呈现较强非特异性染色1.Abbott供图; 2. Ventana供图.取样取样组织处理组织处理固定方式固定方式 检测仪器精准度检测仪器精准度 实验室步骤实验室步骤固定时间固定时间检测方检测方法验证法验证 检测人员检测人员抗原修复类型抗原修复类型实验试剂实验试剂对照对照实验条件实验条件使用图像使用图像分析分析判读判读标准标准 报告内容报告内容评分系统评分系统HER2检测偏倚检测偏倚检测后检测后检测前检测前检测中检测中影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素Wolff AC, et al. J Clin Oncol 2007;25:118145.HER2检测的影响因素：检测前检测的影响因素：检测前12影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素: 检测前检测前取样取样组织处理组织处理固定方式固定方式固定时间固定时间Pre-analyticHER2检测偏倚检测偏倚Wolff AC, et al. J Clin Oncol 2007; 25:118145.检测前检测前取样取样原发性乳腺癌最好为手术切除而非活检标本，包含癌旁乳腺组织避免细针穿刺活检取样转移性乳腺癌穿刺活检取样胃癌经内镜活检取样或经手术切除之标本影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素: 检测前检测前取样取样HER2检测偏倚检测偏倚Wolff AC, et al. J Clin Oncol 2007; 25:118145.检测前检测前HER2检测偏倚检测偏倚影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素: 检测前检测前组织处理方式组织处理方式提供新鲜及已定位之标本或切除后迅速经甲醛固定之标本立即转送至备检实验室:尽量缩短从标本切除至浸入10%NBF固定之间的时间，通常控制在2030分钟以内乳腺癌： 最多1小时胃癌： 2030分钟之内组织处理组织处理HER2检测偏倚检测偏倚检测前检测前HER2检测偏倚检测偏倚Wolff AC, et al. J Clin Oncol 2007;25:118145; www.her2testing.org;乳腺癌HER2检测指南（2009版）编写组 乳腺癌HER2检测指南（2009版）中华病理学杂志 2009,38(12):836840. 胃癌HER2检测指南编写组 胃癌HER2检测指南 中华病理学杂志 2011;40(8):553-557.影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素: 检测前检测前固定时间固定时间乳腺癌乳腺癌最少最少6小时小时不超过不超过48小时小时胃癌胃癌穿刺穿刺活检最少活检最少1小时小时（以便（以便充分固定充分固定）比较大的样本需要至比较大的样本需要至少少8小时小时不超过不超过48小时小时固定时间固定时间HER2检测偏倚检测偏倚检测前检测前HER2检测偏倚检测偏倚乳腺癌HER2检测指南（2009版）编写组 乳腺癌HER2检测指南（2009版）中华病理学杂2009;38(12):836840.胃癌HER2检测指南编写组 胃癌HER2检测指南 中华病理学杂志 2011;40(8):553-557.影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素: 检测前检测前固定方式固定方式 首选10%中性缓冲福尔马林（NBF）10%NBF相当于4% 甲醛溶液固定方式固定方式HER2检测偏倚检测偏倚检测前检测前HER2检测偏倚检测偏倚Wolff AC, et al. J Clin Oncol 2007; 25:118145.HER2检测的影响因素：检测中检测的影响因素：检测中18影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素：检测中：检测中检测仪器精准度检测仪器精准度实验室检测步骤实验室检测步骤检测人员检测人员抗原修复类型抗原修复类型实验试剂实验试剂对照对照实验条件实验条件HER2检测检测偏倚偏倚检测中检测中Wolff AC, et al. J Clin Oncol 2007; 25:118145.检测方法验证检测方法验证 影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素：检测中：检测中验证检测方法验证检测方法用于检测之实验步骤应经已知实验结果验证标准化实验条件需经标准化试验方法验证后才可常规应用HER2检测偏倚检测偏倚检测中检测中检测方法检测方法验证验证 Wolff AC, et al. J Clin Oncol 2007; 25:118145.影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素：检测中：检测中检测仪器之精准度检测仪器之精准度应有常规校准及维护检测仪器的相关操作流程移液器孵育箱水浴锅 温度计检测仪器精准性检测仪器精准性Wolff AC, et al. J Clin Oncol 2007; 25:118145.HER2检测偏倚检测偏倚检测中检测中仪器准确度指该实验仪器能正确显示操作者的设定方式 正确运作仪器精确度指该实验仪器每次操作都能显示相同的检测结果 可重复性影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素：检测中：检测中实验室步骤实验室步骤须经验证之免疫组化实验步骤 实验室步骤实验室步骤HER2检测偏倚检测偏倚检测中检测中Wolff AC, et al. J Clin Oncol 2007; 25:118145.影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素：检测中：检测中检测人员检测人员相关检测人员应接受正规检测技术培训（包括资格考试）并给予相应支持定期考评：例如年度考评检测人员检测人员Wolff AC, et al. J Clin Oncol 2007; 25:118145;乳腺癌HER2检测指南（2009版）编写组 乳腺癌HER2检测指南（2009版）中华病理学杂志 2009,38(12):836-840HER2检测偏倚检测偏倚检测中检测中影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素：检测中：检测中抗原修复类型抗原修复类型所采用之抗原修复系统与现有实验条件相适应，并能产生可重复性结果抗原修复类型抗原修复类型Wolff AC, et al. J Clin Oncol 2007; 25:118145.HER2检测偏倚检测偏倚检测中检测中相同相同FISH阴性阴性乳腺癌组织标本乳腺癌组织标本应用相同浓度抗应用相同浓度抗HER2 抗体检测结果抗体检测结果 合理抗原修复合理抗原修复过度抗原修复过度抗原修复假阳性假阳性抗原修复对免疫组化检测结果很重要抗原修复对免疫组化检测结果很重要图片由 A Morey, St Vincents Hospital, NSW, Australia提供.影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素：检测中：检测中检测试剂检测试剂所有试剂应确保其质量稳定，经对照组实验验证后可使用所有验证应当记录，签名和登记日期检测试剂检测试剂Wolff AC, et al. J Clin Oncol 2007; 25:118145.HER2检测偏倚检测偏倚检测中检测中影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素：检测中：检测中对照对照对照组与实验组实验过程应一致应使用已知实验结果的组织作为对照可用已经验证的对照检测新抗体活性用于对照的组织标本可自行制备或购买而得对照对照HER2检测偏倚检测偏倚检测中检测中阳性及阴性对照阳性及阴性对照组织标本阳性对照组组织标本阳性对照组理想之阳性对照组理想之阳性对照组, HER2阳性阳性 (IHC3+)11.W Hanna供图; 2. L Bornstein供图.MDA MB 175, HER2阴性阴性 (IHC1+)2对照细胞系之准备对照细胞系之准备SK-BR-3, HER2阳性阳性 (IHC3+)1内部对照设置内部对照设置患者标本中肿瘤未累及部分可作为内部阴性对照组；若阴性对照结果亦出现染色，则原肿瘤标本之染色结果无效对照监控如若对照组未显示预期结果，则实验应重做例如，正常乳腺上皮膜染色 重复免疫组化检测 W Hanna供图.影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素：检测中：检测中检测实验条件检测实验条件检测应于适当条件下进行温度及湿度的变化会影响染色结果检测条件需确保得到可靠且可重复的HER2检测结果检测条件检测条件Wolff AC, et al. J Clin Oncol 2007; 25:118145.HER2检测偏倚检测偏倚检测中检测中如何达到高质量免疫组化检测如何达到高质量免疫组化检测勿让低年资实验室技术人员配置试剂若试剂未能正确配制，免疫组化结果将不可靠低年资技术人员应接收试剂配制训练及上级指导监督正确的抗体稀释可避免免疫组化的误差记录每次抗体稀释的浓度，每次登记相应日期及时间如遇错误检测结果，上述记录数据可用来追溯错误原因完善改进抗原修复方法较耗时但必须进行设计验证步骤设计验证步骤目的确定经证实或验证之相关实验步骤是否可于本实验室可行确定检测参数固定检测方法及条件试剂及浓度操作设定 (若自动化操作)操作人员技术能力样本(检测组)选择25100个样本用不同经证实的检测方式进行检测，可使用组织芯片请注意请注意: 乳腺癌与胃癌标本进行检测验证应分开进行乳腺癌与胃癌标本进行检测验证应分开进行设计验证步骤设计验证步骤记录实验验证的每一操作步骤这些记录可用于建立实验室标准化操作参考指南记录所有操作步骤若任何一个步骤发生变化，整个实验必须重做目标：阳性及阴性实验验证组与原实验结果达95%的一致性使用自动化使用自动化平台有助平台有助HER2检测标准化检测标准化方法方法抗体抗体单位单位HER2 检测准确性检测准确性自我评估自我评估专家评估专家评估自动4B5694.7%95.2%自动A0485390.0%92.0%自动CB11481.0%83.5%手动A0485678.4%85.7%手动CB11981.6%82.0%手动SP3278.0%88.0%如果使用自动化如果使用自动化检测检测，必须基于现有的，必须基于现有的经验证的经验证的手动手动操作方案操作方案PQCC委员会提供数据国家质量控制认证项目中自动与手动HER2检测方法对比HER2检测的影响因素：检测后检测的影响因素：检测后35影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素：检测后：检测后图像分析图像分析方法方法判读判读标准标准报告内容报告内容评分系统评分系统HER2检测偏倚检测偏倚检测后检测后Wolff AC, et al. J Clin Oncol 2007; 25:118145.影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素：检测后：检测后检测结果检测结果判读判读标准及评分系统标准及评分系统需依国内/国际HER2检测指南进行标准化操作HER2检测偏检测偏倚倚检测后检测后HER2检测偏倚检测偏倚判读判读标准标准评分系统评分系统图像分析图像分析方法方法IHC检测结果判读及评分检测结果判读及评分多数操作指南推荐下列分析免疫组化检测结果的标准：依细胞染色百分比及强度进行评分:乳腺癌乳腺癌: 全膜染色全膜染色评估染色侵入部分，但不包括原位部分评估染色侵入部分，但不包括原位部分寻找完整深染色及均匀的全膜区域寻找完整深染色及均匀的全膜区域胃癌：基底侧膜、侧膜或完全性膜染色胃癌：基底侧膜、侧膜或完全性膜染色分析检测结果时，细胞质染色应排除在外。若细胞质染色干扰细胞膜染色结果判断时，应重新检测。正常上皮细胞不应有染色出现。若出现染色，则应重新检测。留意待检标本出现收缩/破损,这些现象会造成检测结果的假阳性若标本染色不均，应依染色最强部位进行评分根据对照组实验结果决定实验组检测结果是否可信乳腺癌或胃癌检测应使用其特异性评分标准Wolff AC et al. J Clin Oncol 2007;25:118145; www.her2testing.org.ISH检测结果检测结果判读判读及评分及评分所有乳腺癌及胃癌IHC2+标本均需再次进行ISH检测进行确定分析ISH检测结果时之注意事项：乳腺癌：依乳腺癌：依H&E和和/或免疫组化染色检测结果来确定肿瘤的侵及程度或免疫组化染色检测结果来确定肿瘤的侵及程度; 原位癌原位癌不予评分不予评分从浸润性肿瘤的两个不同从浸润性肿瘤的两个不同区域区域数细胞数细胞胃癌：由于胃癌：由于HER2的表达异质性，必需的表达异质性，必需筛选出筛选出整个扩增区域包括来自于不同整个扩增区域包括来自于不同肿瘤领域的细胞以提供一个更加统一的分析评分标准肿瘤领域的细胞以提供一个更加统一的分析评分标准Brightfield方法如方法如SISH建议确认建议确认HER2扩增重点扩增重点区域区域依对照组检测结果决定实验组检测结果是否可信于两个肿瘤侵及区域计数至少20个不重叠的细胞若信号不均匀(25%)，应重新检测若检测结果自发荧光过强或核清晰度较差时则应重新检测若背景干扰信号辨识时，应重新检测 (10%细胞质信号)重复信号作单一计数Wolff AC et al. J Clin Oncol 2007;25:118145; www.her2testing.org.影响影响HER2检测结果之因素检测结果之因素：检测后：检测后检测报告检测报告检测报告应包含以下信息：标本部位及类型固定液种类标本离体至固定时间标本固定的时间抗体检测方法图像分析方法对照设置HER2检测偏检测偏倚倚检测后检测后HER2检测偏倚检测偏倚报告内容报告内容乳腺癌HER2检测指南（2009版）编写组 乳腺癌HER2检测指南（2009版）中华病理学杂2009;38(12):836840.HER2检测检测的的质量保证质量保证41理想的理想的质量体系包括质量体系包括内部质保计划外部质保计划参与Ring研究内部质保内部质保4343内部质保理想计划内部质保理想计划继续进行质控及检测仪器维护继续进行实验室人员技术训练及能力测评实验步骤严格遵守标准化操作方案常规对照组 (阳性，阴性及内部对照组)；任何对照组若出现非预期实验结果，则应重新检测将检测阳性率及阴性率与已发表数据比较，从而监控检测质量对病理医生进行继续教育及能力测评(如进行同行检测能力比较)继续进行常规评价及总结，分析现存问题，及时弥补不足外部质保外部质保4545外部质保内容外部质保内容美国病理学会（CAP）认证内容要求检查时记录验证检测之方法检测步骤之使用检测技术人员之培训标本及试剂之正确标记标本及试剂之正确贮存检测仪器之校准及质控内部质保计划及实施依据检测质量检测技术人员及病理医生检测能力之测评检测报告之准确性及质量正确提交检测结果Wolff AC, et al. J Clin Oncol 2007; 25:118145.参与外部质保之益处参与外部质保之益处可证明本实验室HER2检测结果是否准确可验证本实验室检测方法检测操作较差之实验室可得到较多相关建议及帮助本实验室检测技术及检测结果判读的困难可得到及时纠正及弥补美国病理医师学会（美国病理医师学会（CAP） 认证认证（乳腺癌乳腺癌）CAP 提供HER2检测认证熟练检测(按照ASCO*/CAP HER2 检测指南和认证列表)质量管理/QC结果报告具有IHC或ISH进行HER2检测条件的CAP认证实验室需要注册并参与CAP认可的熟练性测试实验室表现将被监测； 实验室必须达到90%或以上的测试评分（如果每次测试都能成功提交的话）发送HER2切片到其他设备进行组织处理和染色、并将结果拿回进行判读的实验室，必须参与熟练性测试http:/www.cap.org Accessed 14 December 2010.*ASCO, 美国临床肿瘤医师协会英国国家外部质量保证评价计划英国国家外部质量保证评价计划 （乳腺癌）（乳腺癌）向全球实验室开放计划针对免疫组化及原位杂交检测参与该计划的实验室每季度需对该计划组织所提供的细胞系标本进行免疫组化检测，检测结果将交回该计划组织送回该计划组织之检测结果将由四位专家进行最终评分，取平均分作为参与实验室最后得分最终评分结果有利于相关实验室改进现有实验操作技术以及接受相关技术培训http:/www.ukneqas.org.uk Accessed 14 December 2010.Ring研究研究50什么是什么是Ring研究？研究？Ring研究是指几个不同的检测中心对同样的组织样本进行评估。评估分几轮进行，在每一轮评估中，每个检测中心轮流提供组织样本。然后对不同检测中心的检测结果进行比较，从而评价每个检测中心的检测水平Ring研究确保研究确保HER2检测持续准确：胃癌检测之经验检测持续准确：胃癌检测之经验德国、法国及其他国家已经发表了Ring研究的相关内容初步研究数据显示：只要严格遵守检测步骤，不同病理医生HER2检测结果可达一致检测胃癌HER2状态的病理医生需经特别培训，并遵守胃癌检测特异性操作指南Rschoff J, et al. Virchows Archiv 2010;457:299307.Ring研究应确定病理医生每次研究应确定病理医生每次HER2检测结果及评分检测结果及评分是否一致是否一致实验室间差异预选代表所有肿瘤类型的待检标本依检测试剂盒生产商标准操作步骤进行检测检测员间差异经染色的已知HER2表达水平的肿瘤检测标本检测标本由不同病理医生独立评估HER2评分差异并不由不同实验室间染色结果差异而决定Ring研究流程图示例研究流程图示例选择胃癌组织芯片样本依检测试剂盒生产商标准操作步骤检测HER2(免疫组化或原位杂交)确定与胃癌免疫组化检测评分相关问题不同实验室间差异选择经免疫组化染色的系列组织芯片样品不同病理医生独立检测 (强度及检测区域评分)检测员间差异请注意：组织芯片并不适用于治疗相关的诊断；然而可用于质控、质保评价http:/www.her2testing.org.总结总结尽量降低HER2检测之偏倚率检测前检测中检测后标准化操作培训及教育监控及检测复评与其他实验室比较检测结果如有需要应采取补救措施持续性、常规性及不断的评估