第十一章同工酶与气体酶学同工酶与气体酶学n第一节第一节 同工酶的基础知识同工酶的基础知识n第二节第二节 同工酶的应用同工酶的应用n第三节第三节 固氮酶的作用固氮酶的作用n第四节第四节 甲烷加氧酶的作用甲烷加氧酶的作用n第五节第五节 氧化氧化CO的酶的酶酶的多种分子形式酶的多种分子形式同工酶同工酶第一节第一节 同工酶的基础知识同工酶的基础知识* 定义：同工酶定义：同工酶(isoenzyme)是指催化相同是指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。n同工酶同工酶是指在生物体内或组织中催化相同反应而具有不同分子形式（包括不同的氨基酸序列、空间结构等）的酶，这种分子形式差异是由于酶蛋白的编码基因不同，或者虽然基因相同，但基因转录产物mRNA或者其翻译产物是经过不同的加工过程产生的。n国际生化协会同工酶分委员会建议同工酶的名称国际生化协会同工酶分委员会建议同工酶的名称根据他们在电泳中分离的位置确定根据他们在电泳中分离的位置确定，从电泳中向从电泳中向着阳极移动最远的酶开始依次编号着阳极移动最远的酶开始依次编号。 同工酶的命名同工酶的命名 ：* *实例：实例：乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDH）2种亚基类型（种亚基类型（M和和H）可以配置）可以配置成成5种种4聚体；聚体；都催化乳酸脱氢形成丙都催化乳酸脱氢形成丙酮酸，辅酶都为酮酸，辅酶都为NAD乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH(LDH1 1 LDHLDH5 5) )乳酸脱氢酶同工酶形成示意图乳酸脱氢酶同工酶形成示意图多肽多肽亚基亚基mRNA四聚体四聚体结构基因结构基因a b乳酸脱氢酶同乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱工酶电泳图谱+H4MH3M2H2M3HM4点样线点样线MHM4M3HM2H2MH3H4不同组织中不同组织中LDH同工酶的电泳图谱同工酶的电泳图谱LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌心肌 肾肾 肝肝 骨骼肌骨骼肌 血清血清-+原点原点* *生理及临床意义生理及临床意义在代谢调节上起在代谢调节上起着重要的作用；着重要的作用；用于解释发育过用于解释发育过程中阶段特有的代谢程中阶段特有的代谢特征；特征；同工酶谱的改变同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断；有助于对疾病的诊断；同工酶可以作为同工酶可以作为遗传标志，用于遗传遗传标志，用于遗传分析研究。分析研究。心肌梗死和肝病病人血清心肌梗死和肝病病人血清LDHLDH同工酶谱的变化同工酶谱的变化1 1酶酶活活性性心肌梗死酶谱心肌梗死酶谱正常酶谱正常酶谱肝病酶谱肝病酶谱2 23 34 45 5 什么叫同工酶？有何临床意义？什么叫同工酶？有何临床意义？ 同工酶是长期进化过程中基因分化的产物。同工酶是指催化的化学反应相同，酶蛋白的分子结构、理化性质、免疫学性质不同的一组酶。根据国际生化学会的建议，同工酶是由不同基因或等位基因编码的多肽链，或同一基因转录生成的不同mRNA翻译的不同多肽链组成的蛋白质。 不同的同工酶在不同组织器官中的含量与分布比例不同。这主要是不同组织器官合成同工酶各亚基的速度不同和各亚基之间杂交的情况不同所致。不同的同工酶对底物的亲和力不同。这种不同的组织与细胞具有不同的代谢特点。当某组织发生疾病时，可能有某种特殊的同工酶释放出来，同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断。 二分类n单基因决定的同工酶n多基因决定的同工酶n复等位基因基因决定的同工酶n修饰同工酶三同工酶的结构基础同工酶的一级结构的差异构象变化造成同工酶的差异例：苹果酸脱氢酶，在生物提中有两中类型的苹果酸脱氢酶，分别位于线粒体（倾向与苹果酸氧化）和细胞质（倾向于草酰乙酸还原）。由于编码他们的基因不同，其氨基酸组成和电泳的行为也有差别，特别是他们的动力学性态更有不同。四同工酶的常用分离和测定方法n（一） 方法1 电泳2 层析3 热稳定性4 动力学5 免疫法（二） 方法使用注意点1严格控制可能影响实验的条件，重复实验。 2尽量消除由环境造成的差异。3增大实验的样本数量及样本随机性，使之具有代表性。4实验条件标准化，减少人为操作造成的误差5基本酶谱与分析方法的标准化。6选择尽可能多的酶进行分析。同工酶的应用n一 植物系统学研究中的应用（一）原理：同工酶在不同的物种、同一物种的不同时期、同一时期的不同器官、同一器官的不同组织中都具有特异性，既是生理指标，又是可靠的遗传物质表达产物。（二）应用领域1 同工酶在栽培粮食作物（水稻、玉米、小麦、荞麦）起源和演化中的作用2同工酶在中药材起源和演化中的作用3同工酶在果树起源和演化中的作用4同工酶技术在十字花科作物育种上的应用1、下列关于同工酶的概念的叙述那一项是正确的A、是结构相同而存在部位不同的一组酶 B、是催化相同化学反应而酶的一级结构和理化性质不同的一组酶C、是催化反应及性质都相似而发生不同的一组酶D、是催化相同反应的所有酶 E、以上都不是第二节 固氮酶的作用n一固氮酶n固氮酶固氮酶是一种能够将分子氮还原成氨的酶。固氮酶是由两种蛋白质组成的：一种含有铁，叫做铁蛋白，另一种含铁和钼，称为钼铁蛋白。只有钼铁蛋白和铁蛋白同时存在，固氮酶才具有固氮的作用(因为这两种物质作为电子载体能够起到传递电子的作用）。 1种类：一种是钼铁蛋白，另一种是铁蛋白2催化的反应生物固氮原理简介 ：n生物固氮是固氮微生物特有的一种生理功能，这种功能是在固氮酶的催化作用下进行的。 固氮微生物需氧，而固氮必须是在严格的厌氧微环境中进行。组成固氮酶的两种蛋白质，钼铁蛋白和铁蛋白，对氧极端敏感，一旦遇氧就很快导致固氮酶的失活，而多数的固氮菌都是好氧菌，它们要利用氧气进行呼吸和产生能量。 n固氮菌在进化过程中，发展出多种机制来解决既需氧又防止氧对固氮酶的操作损伤的矛盾。其中之一是固氮菌以较强的呼吸作用迅速地将周围互不干涉中的氧消耗掉，使细胞周围处于低氧状态，保护固氮酶不受损伤。生物固氮过程可以用下面的反应式概括表示：N2 6H+ nMg-ATP 6e-2NH3nMg-ADPnPi 钼蛋白和铁蛋白比较固氮酶的结构n金属簇是固氮酶的中心，是金属簇是固氮酶的中心，是任何结构漫游中最引人注目任何结构漫游中最引人注目的。蛋白质编号的。蛋白质编号1n2c1n2c图是一图是一个开始漫游的好地方个开始漫游的好地方它既它既包括了钼铁蛋白（中央蓝色包括了钼铁蛋白（中央蓝色和紫色的），也包括两个结和紫色的），也包括两个结合在末端的铁蛋白二聚体合在末端的铁蛋白二聚体（绿色表示）。金属离子用（绿色表示）。金属离子用空间填注的表示方法很容易空间填注的表示方法很容易显示出铁硫簇，显示出铁硫簇，P P簇和铁簇和铁钼簇排成一排。这个结构钼簇排成一排。这个结构是通过不同寻常的是通过不同寻常的ATPATP类比类比揭示揭示ATPATP的结合位点：一个的结合位点：一个ADPADP分子和一个铝氟化合物分子和一个铝氟化合物离子。这两个分子分别结合离子。这两个分子分别结合在两个末端，与铁蛋白形成在两个末端，与铁蛋白形成了稳定的聚合体，从根本上了稳定的聚合体，从根本上将铁蛋白粘合在铁钼蛋白上。将铁蛋白粘合在铁钼蛋白上。二固氮酶的研究热点n生物固氮研究正在分子和原子水平上开展1固氮基因表达的氨阻遏和氧敏感机制2共生结瘤固氮中植物与微生物相互关系的基因表达和调控3根瘤菌结瘤因子的结构和生物合成4根瘤菌及其宿主植物的基因组学转录组学和蛋白质组学5固氮酶的结构和功能及其化学模拟一、自养微生物的一、自养微生物的CO2固定固定两类自养生物固定两类自养生物固定CO2的条件和途径的条件和途径二、生物固氮二、生物固氮 生物固氮作用生物固氮作用：将大气中分子态氮通过微生物固氮酶将大气中分子态氮通过微生物固氮酶的催化而还原成氨的过程。大气中的催化而还原成氨的过程。大气中90%以上的分子态以上的分子态氮，都是由微生物固定成氮化物的，生物固氮是地球氮，都是由微生物固定成氮化物的，生物固氮是地球上仅次于光合作用的生物化学反应。上仅次于光合作用的生物化学反应。（一）固氮微生物（一）固氮微生物(nitrogen fixing organisms ,diazotrophs） 80余属，全部为原核生物（包括古生菌），主要包括细菌、放余属，全部为原核生物（包括古生菌），主要包括细菌、放线菌和蓝细菌。线菌和蓝细菌。 根据固氮微生物与高等植物及其他生物的关系，可将它们分为根据固氮微生物与高等植物及其他生物的关系，可将它们分为以下以下3类：类： 1、自生固氮微生物、自生固氮微生物 2、共生固氮微生物、共生固氮微生物 3、联合固氮微生物、联合固氮微生物 1 1、自生固氮菌、自生固氮菌 独立生活状况下能够固氮的微生物。独立生活状况下能够固氮的微生物。 生活在土壤或水域中，能独立地进行固氮，但并不将生活在土壤或水域中，能独立地进行固氮，但并不将氨释放到环境中，而是合成氨基酸，组成自身蛋白质。氨释放到环境中，而是合成氨基酸，组成自身蛋白质。自生固氮微生物的固氮效率较低，每消耗自生固氮微生物的固氮效率较低，每消耗1克葡萄糖大克葡萄糖大约只能固定约只能固定1020毫克氮。毫克氮。2 2、共生固氮菌、共生固氮菌 与其它生物形成共生体，在共生体内进行固氮的微生物与其它生物形成共生体，在共生体内进行固氮的微生物。 只有在与其他生物紧密地生活在一起的情况下，才能固氮只有在与其他生物紧密地生活在一起的情况下，才能固氮或才能有效地固氮；并将固氮产物氨，通过根瘤细胞酶系或才能有效地固氮；并将固氮产物氨，通过根瘤细胞酶系 统的作用，及时运送给植物体各部，直接为共生体提供氮统的作用，及时运送给植物体各部，直接为共生体提供氮源。共生体系的固氮效率比自生固氮体系高得多，每消耗源。共生体系的固氮效率比自生固氮体系高得多，每消耗 1克葡萄糖大约能固定克葡萄糖大约能固定280毫克氮。毫克氮。根瘤菌的根瘤根瘤菌的根瘤满江红鱼星藻地衣3 3、联合固氮菌、联合固氮菌 联合固氮作用是固氮微生物与植物之间存在的一种联合固氮作用是固氮微生物与植物之间存在的一种简单共生现象。它既不同于典型的共生固氮作用，也不简单共生现象。它既不同于典型的共生固氮作用，也不同于自生固氮作用。这些固氮微生物仅存在于相应植物同于自生固氮作用。这些固氮微生物仅存在于相应植物的根际，不形成根瘤，但有较强的专一性，固氮效率比的根际，不形成根瘤，但有较强的专一性，固氮效率比在自生条件下高。在自生条件下高。 通常在水域环境中，共生性固氮系统不常见。大通常在水域环境中，共生性固氮系统不常见。大量的氮主要靠自由生活的微生物固定，在有氧区主要是量的氮主要靠自由生活的微生物固定，在有氧区主要是蓝细菌的作用，在无氧区主要是梭菌的作用。蓝细菌的作用，在无氧区主要是梭菌的作用。1 1、生物固氮反应的、生物固氮反应的6 6要素要素固氮酶固氮酶ATP的供应的供应还原力及其传递载体还原力及其传递载体还原底物还原底物 N2镁离子镁离子严格的厌氧微环境严格的厌氧微环境（二）固氮的生化机制（二）固氮的生化机制2NH3+H2+1824ADP+1824PiN2+8H+1824ATP生物固氮总反应：生物固氮总反应：固二氮酶（固二氮酶（dinitrogenase）（组份）（组份）：是还原氮气的活性中心。）：是还原氮气的活性中心。固氮酶除了能催化固氮酶除了能催化N2 NH3，还可催化，还可催化H H2、C2H2 C2H4。固氮酶：是一种复合蛋白，由固二氮酶和固二氮酶还固氮酶：是一种复合蛋白，由固二氮酶和固二氮酶还原酶两种相互分离的蛋白构成。原酶两种相互分离的蛋白构成。固二氮酶还原酶（固二氮酶还原酶（dinitrogenase reductase）（组份）（组份）：）： 是一种只含铁的蛋白。是一种只含铁的蛋白。ATPADP+P(Fe4S4)2.2e- Fd.2e- Fd (Fe4S4)2 FeMoCo.2e- FeMoCo 2NH3N22 2、固氮的生化途径、固氮的生化途径2NH3+H2+1824ADP+1824PiN2+8H+1824ATP氧障呼呼 吸吸无氧呼吸无氧呼吸发发 酵酵光合作用光合作用NAD(P)H+H+.N NMoMo + HMoNNMoFdFd.还原剂还原剂ADP+Pi Mg2+ATP-MgATP-MgATP Mg2+Mo Mo2NH3底物底物能量能量产物产物N N自生固氮菌固氮的生化途径细节自生固氮菌固氮的生化途径细节N2分子经固氮酶的催化而还原成分子经固氮酶的催化而还原成NH3后，就可与后，就可与相应的酮酸结合，形成各种氨基酸。相应的酮酸结合，形成各种氨基酸。（三）好氧菌固氮酶避害机制（三）好氧菌固氮酶避害机制 固氮酶的两个蛋白组分对氧极其敏感，一旦遇氧就很快导致不固氮酶的两个蛋白组分对氧极其敏感，一旦遇氧就很快导致不可逆的失活。固氮生化反应都必须受活细胞中各种可逆的失活。固氮生化反应都必须受活细胞中各种“氧障氧障”的的严密保护。严密保护。 大多数固氮微生物都是好氧菌，在长期进化过程中，已进化出大多数固氮微生物都是好氧菌，在长期进化过程中，已进化出适合在不同条件下保护固氮酶免受氧害的机制。适合在不同条件下保护固氮酶免受氧害的机制。 1、好氧性自生固氮菌的抗氧保护机制、好氧性自生固氮菌的抗氧保护机制（1）呼吸保护）呼吸保护 固氮菌科的菌种能以极强的呼吸作用迅速将周围环境中的氧消固氮菌科的菌种能以极强的呼吸作用迅速将周围环境中的氧消耗掉，使细胞周围微环境处于低氧状态，保护固氮酶。耗掉，使细胞周围微环境处于低氧状态，保护固氮酶。（2）构象保护）构象保护 在高氧分压条件下，在高氧分压条件下，Azotobacter vinelandii（维涅兰德固氮（维涅兰德固氮菌）和菌）和A.chroococcum（褐球固氮菌）等的固氮酶能形成一个（褐球固氮菌）等的固氮酶能形成一个无固氮活性但能防止氧害的特殊构象。无固氮活性但能防止氧害的特殊构象。2、蓝细菌固氮酶的抗氧保护机制、蓝细菌固氮酶的抗氧保护机制 蓝细菌在光照下会因光合作用放出的氧而使细胞内氧浓度急剧蓝细菌在光照下会因光合作用放出的氧而使细胞内氧浓度急剧增高。增高。分化出特殊的还原性异形胞：缺乏产氧光合系统分化出特殊的还原性异形胞：缺乏产氧光合系统，脱氢酶和，脱氢酶和氢氢 化酶的活性高，维持很强的还原态；化酶的活性高，维持很强的还原态； SOD活性高，解除氧的毒害；活性高，解除氧的毒害； 呼吸强度高，可消耗过多的氧。呼吸强度高，可消耗过多的氧。非异形胞蓝细菌固氮酶的保护非异形胞蓝细菌固氮酶的保护 能通过将固氮作用与光合作用进行时间上的分隔来达到；能通过将固氮作用与光合作用进行时间上的分隔来达到； 通过束状群体中央处于厌氧环境下的细胞失去能产氧的光合系通过束状群体中央处于厌氧环境下的细胞失去能产氧的光合系统统 II，以便于进行固氮反应；，以便于进行固氮反应； 通过提高过氧化物酶和通过提高过氧化物酶和SOD的活性来除去有毒过氧化合物。的活性来除去有毒过氧化合物。3、豆科植物根瘤菌的抗氧保护机制、豆科植物根瘤菌的抗氧保护机制 只有当严格控制在微好氧条件下时，才能固氮；只有当严格控制在微好氧条件下时，才能固氮； 根瘤菌还能在根毛皮层细胞内迅速分裂繁殖，随后分化为根瘤菌还能在根毛皮层细胞内迅速分裂繁殖，随后分化为膨大而形状各异、不能繁殖、但有很强固氮活性的类菌体。膨大而形状各异、不能繁殖、但有很强固氮活性的类菌体。许多类菌体被包在一层类菌体周膜中，膜的内外有能与许多类菌体被包在一层类菌体周膜中，膜的内外有能与O2结合的豆血红蛋白。结合的豆血红蛋白。三、固氮酶的应用n（1） 农业中：固氮肥料的研究 （2） 生物制氢技术中的应用n光合生物产氢 能够产氢的光合生物包括光合细菌和藻类。n光合细菌属于原核生物，催化光合细菌产氢的酶主要是固氮酶。第三节 甲烷加氧酶的作用一概念甲烷单加氧酶是甲烷利用细菌(methanotrophic bacteria)代谢过程中的重要酶系，在细菌细胞内直接利用分子氧作为底物催化甲烷氧化成甲醇。 二酶的性质n1甲烷利用细菌的分类和表现形态n可根据所利用碳源和能源不同将甲烷利用细菌分成：专性甲烷利用细菌兼性甲烷利用细菌拟甲烷利用细菌2酶的组成n组分A为245KD左右的羟基化酶；n组分B为15KD左右的调节蛋白；n组分C为分子量为40KD左右的还原酶3活性中心n羟基化酶是一个由三种亚基组成的二聚体蛋白n什么是MMOB?调节蛋白第四节 氧化CO的酶n一羧基养细菌的CO脱氢酶n二硫酸盐还原细菌的CO脱氢酶n三光养厌氧菌的CO脱氢酶n四甲烷养细菌的甲烷单加氧酶