沉淀分离技术沉淀分离技术n沉淀和结晶的区别沉淀和结晶的区别:形态形态成分纯度成分纯度n 结晶结晶:同类分子或离子以规则排列形式析出；同类分子或离子以规则排列形式析出；n 沉淀沉淀:无序析出，纯度远低于结晶。无序析出，纯度远低于结晶。n操操作作方方式式可可分分连连续续法法或或间间歇歇法法两两种种，规规模模较较小小时时，常常采用间歇法。采用间歇法。n生生物物分分子子在在水水中中形形成成稳稳定定的的溶溶液液是是有有条条件件的的，这这些就是溶液的各种理化参数。些就是溶液的各种理化参数。n任任何何能能够够影影响响这这些些条条件件的的因因素素都都会会破破坏坏溶溶液液的的稳稳定性。定性。n沉沉淀淀法法就就是是采采用用适适当当的的措措施施改改变变溶溶液液的的理理化化参参数数，控控制制溶溶液液的的各各种种成成分分的的溶溶解解度度，从从而而将将溶溶液液中中的的欲提取的成分和其它成分分开的技术。欲提取的成分和其它成分分开的技术。n沉淀法操作步骤沉淀法操作步骤 ：加入沉淀剂。加入沉淀剂。沉淀剂的陈化，促进粒子生长；沉淀剂的陈化，促进粒子生长；离心或过滤，收集沉淀物。离心或过滤，收集沉淀物。n加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。收率和沉淀物的形状都有很大影响。 沉淀能否发生；沉淀能否发生； 沉淀剂或沉淀条件下对活性结构是否有破坏作用；沉淀剂或沉淀条件下对活性结构是否有破坏作用； 沉淀剂是否容易除去；沉淀剂是否容易除去； 用于食品、医药产品的沉淀剂是否对人体有害。用于食品、医药产品的沉淀剂是否对人体有害。 沉淀过程应考虑的问题沉淀过程应考虑的问题：n沉淀技术分离生化产物的典型例子是沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取蛋白质的分离提取 优点优点：设备简单、成本低、原材料易得、：设备简单、成本低、原材料易得、 便于小批量生产；便于小批量生产； 缺点缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，：所得沉淀物可能聚集有多种物质， 或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂， 产品纯度常比结晶法低，产品纯度常比结晶法低， 过滤也较困难。过滤也较困难。eg. 从血浆中通过从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达步沉淀生产纯度高达99%的免疫球蛋白的免疫球蛋白和和96%99%的白蛋白。的白蛋白。图图1 利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图n沉淀法分离蛋白质的特点：沉淀法分离蛋白质的特点：u生生产产前前期期可可使使原原料料液液体体体体积积很很快快减减小小1050倍倍，从从而而简化生产工艺、降低生产费用简化生产工艺、降低生产费用；u使中间产物保持在一个使中间产物保持在一个中性温和的环境中性温和的环境；u可可及及早早将将目目标标蛋蛋白白从从其其与与蛋蛋白白水水解解酶酶混混合合液液中中分分离离出出来，来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；u用用蛋蛋白白质质沉沉淀淀法法作作为为色色谱谱分分离离的的前前处处理理技技术术，可可使使色色谱分离使用的限制因素降低到最少谱分离使用的限制因素降低到最少。3.2 蛋白质的溶解特性蛋白质的溶解特性n蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。构象以及分子周围的环境所决定。n蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。n一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。分子蛋白质更易溶解。图图2 蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域蛋白质性质蛋白质性质溶液性质溶液性质分子大小分子大小溶剂可利用度（如：水）溶剂可利用度（如：水）氨基酸组成氨基酸组成 pH值值氨基酸序列氨基酸序列离子强度离子强度可离子化的残基数可离子化的残基数温度温度极性极性/非极性残基比率非极性残基比率极性极性/非极性残基分布非极性残基分布氨基酸残基的化学性质氨基酸残基的化学性质蛋白质结构蛋白质结构蛋白质电性蛋白质电性化学键性质化学键性质表表1 影响蛋白质溶解度的参数影响蛋白质溶解度的参数3.3 蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质胶体溶液的稳定性防止蛋白质凝聚沉淀的屏障：防止蛋白质凝聚沉淀的屏障：蛋白质周围的水化层（蛋白质周围的水化层（hydration shell)hydration shell)可可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层） 因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（双电层厚度（电位）降低蛋白质溶液的稳电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。定性，实现蛋白质的沉淀。吸引力吸引力n颗粒间的相互作用颗粒间的相互作用n颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。nVan der Waals Van der Waals 力力nKeeson Keeson 引力（偶极力）引力（偶极力）nDebye Debye 引力引力 （诱导力）（诱导力）nLondon London 引力引力 （色散力）是最重要的一种引力，因为所有（色散力）是最重要的一种引力，因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。其他沉淀法其他沉淀法金属沉淀法金属沉淀法聚电解质沉淀法聚电解质沉淀法非离子型聚合物沉淀法非离子型聚合物沉淀法3.4 蛋白质沉淀方法蛋白质沉淀方法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法中性盐盐析法中性盐盐析法成本低，不需要特别昂贵的设备成本低，不需要特别昂贵的设备成本低，不需要特别昂贵的设备成本低，不需要特别昂贵的设备操作简单、安全操作简单、安全操作简单、安全操作简单、安全对许多生物活性物质具有稳定作用对许多生物活性物质具有稳定作用对许多生物活性物质具有稳定作用对许多生物活性物质具有稳定作用一、中性盐沉淀法（盐析法）一、中性盐沉淀法（盐析法）盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程 。得到的样品欲继续纯化，需花一定时间脱盐。得到的样品欲继续纯化，需花一定时间脱盐。得到的样品欲继续纯化，需花一定时间脱盐。得到的样品欲继续纯化，需花一定时间脱盐。优点优点优点优点缺点缺点缺点缺点盐浓度盐浓度Salting-in溶溶解解度度Salting-out 蛋白质和酶均易溶于水，分子中的蛋白质和酶均易溶于水，分子中的COOH、NH2和和OH等亲水基团，与极性水分子相互作用形成水化层，等亲水基团，与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成包围于蛋白质分子周围形成亲水胶体亲水胶体亲水胶体亲水胶体，削弱了蛋白质分子，削弱了蛋白质分子之间的作用力，之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大度也越大。 1、中性盐沉淀蛋白质的基本原理、中性盐沉淀蛋白质的基本原理亲水胶体在水中的稳定因素亲水胶体在水中的稳定因素 电电电电 荷荷荷荷 水化膜水化膜水化膜水化膜 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）脱水脱水脱水脱水脱水脱水带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质（疏水胶体）（疏水胶体）不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒阴离子阴离子阳离子阳离子碱碱酸酸酸酸蛋白质蛋白质聚集沉淀聚集沉淀带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）碱碱+ + + + + + +水化膜水化膜带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质（疏水胶体）（疏水胶体）由于中性盐的亲水性大于蛋白质由于中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，量中性盐后，夺走了水分子夺走了水分子，破，破坏了水化膜，暴露出疏水区域。坏了水化膜，暴露出疏水区域。同时又同时又中和了电荷中和了电荷，破坏了亲水，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。胶体，蛋白质分子即形成沉淀。选用盐析用盐的几点考虑：选用盐析用盐的几点考虑：n盐析作用要强盐析作用要强n盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐需有较大的溶解度n盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的n来源丰富、经济来源丰富、经济2、中性盐的选择、中性盐的选择阴离子：阴离子： 柠檬酸根柠檬酸根-3酒石酸根酒石酸根-3 F-I03-H2P04-S04-CH3C00-Cl-Cl03-Br-N03-Cl04-I-CNS-阳离子：阳离子： Th4+Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+Rb+NH4+K+Na+Li+ Hofmeister对一系列离子沉淀蛋白质的能力对一系列离子沉淀蛋白质的能力进行排序，称进行排序，称Hofmeister序列序列，或感胶离子序。，或感胶离子序。 常常用用于于蛋蛋白白质质沉沉淀淀的的盐盐为为硫硫酸酸铵铵和和硫硫酸酸钠钠。硫硫酸酸钠钠虽虽无无腐腐蚀蚀性性但但低低于于40400 0C C就就不不易易溶溶解解，因因此此只只适适用用于于热热稳稳定定性性较较好好的的蛋蛋白质的沉淀过程。白质的沉淀过程。02080100 （NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101（1）溶解度大）溶解度大（2）分离效果好）分离效果好（3）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。（4）价格便宜，废液不污染环境。）价格便宜，废液不污染环境。最常用的盐：最常用的盐：硫酸铵硫酸铵缓冲能力弱，具腐蚀性，含缓冲能力弱，具腐蚀性，含N缺点缺点缺点缺点优优优优点点点点（1）加入固体盐法）加入固体盐法3、 盐析的操作方法盐析的操作方法适用：饱和度高，不增大溶液体积适用：饱和度高，不增大溶液体积加入硫酸铵固体的量：查表、计算加入硫酸铵固体的量：查表、计算查表时查表时查表时查表时注意温注意温注意温注意温度度度度饱和度饱和度： 在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐浓在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐浓度。度。（1）加入固体盐法）加入固体盐法2025g ：加入固体硫酸铵的质量：加入固体硫酸铵的质量S2：所需达到的硫酸铵饱和度：所需达到的硫酸铵饱和度S1：原溶液的硫酸铵饱和度：原溶液的硫酸铵饱和度 （2 2）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法 适用：蛋白质溶液体适用：蛋白质溶液体积不大，所需调整的积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高。硫酸铵浓度不高。 V：所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；：所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0：原溶液体积；：原溶液体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；：所需达到的硫酸铵饱和度；S1：原溶液的硫酸铵饱和度。：原溶液的硫酸铵饱和度。 优点优点 硫酸铵浓度变化连续，硫酸铵浓度变化连续，盐析效果较好。盐析效果较好。缺点缺点 硫酸铵饱和度的测定、硫酸铵饱和度的测定、计算工作手续繁琐，计算工作手续繁琐，而且透析袋容积有限、而且透析袋容积有限、盐析速度慢、硫酸铵盐析速度慢、硫酸铵耗费大。耗费大。 （3）透析平衡法）透析平衡法 方法一方法一：取料液分成等体积几份，冷却至：取料液分成等体积几份，冷却至004、盐析曲线的制作、盐析曲线的制作 各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2 2倍体积的缓冲液中，测倍体积的缓冲液中，测定其中定其中总蛋白总蛋白和和目标蛋白目标蛋白浓度（或测定离心上清液）浓度（或测定离心上清液）以饱和度为横坐标，沉淀（或上清液）中总蛋白和目标蛋白浓以饱和度为横坐标，沉淀（或上清液）中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线 蛋白质量蛋白质量(mg)或酶或酶活力活力硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度蛋白质量蛋白质量(mg)或酶或酶活力活力硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度方法二方法二各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2 2倍体积的缓冲液中，测倍体积的缓冲液中，测定其中定其中总蛋白总蛋白和和目标蛋白目标蛋白浓度浓度以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线白质溶解度曲线 蛋白质量蛋白质量(mg)或酶或酶活力活力硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度蛋白质量蛋白质量(mg)或酶或酶活力活力硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度5、盐析的影响因素、盐析的影响因素 S：离子强度为：离子强度为I时蛋白质的溶解度；时蛋白质的溶解度；S0：离子强度为：离子强度为0时蛋白质的溶解度；时蛋白质的溶解度；KS：盐析常数。：盐析常数。 盐析时，蛋白质溶解度与中性盐的离子强度的关系：盐析时，蛋白质溶解度与中性盐的离子强度的关系： 当溶剂的温度一定时，对当溶剂的温度一定时，对于某一溶质，于某一溶质，S0是一常数是一常数（溶解度常数）（溶解度常数） KS越大，有效成分溶解度随盐浓度增加而减小的程度越大。越大，有效成分溶解度随盐浓度增加而减小的程度越大。KS越大，分级范围越小，盐析效果越好。越大，分级范围越小，盐析效果越好。多价阴离子具有很高的多价阴离子具有很高的KS，但高价阳离子的存在反而降低，但高价阳离子的存在反而降低KS ；大而不规则的蛋白分子大而不规则的蛋白分子KS越大。越大。KS主要取决于盐的性质：主要取决于盐的性质：KS几种盐的盐析能力的排列次序：几种盐的盐析能力的排列次序： 磷酸钾磷酸钾硫酸钠硫酸钠磷酸铵磷酸铵柠檬酸钠柠檬酸钠硫酸镁硫酸镁1纤维蛋白纤维蛋白2血红蛋白血红蛋白3拟球蛋白拟球蛋白4血清蛋白血清蛋白5肌红蛋白肌红蛋白几种蛋白盐析时离子强度与溶解度的关系图几种蛋白盐析时离子强度与溶解度的关系图 在一定在一定pH、温度条件下，改变离子强度。、温度条件下，改变离子强度。适用于早期粗提阶段的分步分离。适用于早期粗提阶段的分步分离。 在一定离子强度下，改变在一定离子强度下，改变pH、温度。适、温度。适于后期分离纯化和精制。于后期分离纯化和精制。硫酸铵盐析法测定羧基肌红蛋白：硫酸铵盐析法测定羧基肌红蛋白：蛋白质浓度蛋白质浓度g/L硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度%结果结果3058开始沉淀开始沉淀366开始沉淀开始沉淀306590%沉淀析出沉淀析出当蛋白浓度增加当蛋白浓度增加10倍时，盐析时倍时，盐析时所需硫酸铵的饱和度约减小所需硫酸铵的饱和度约减小7%。 适宜蛋白质浓度是适宜蛋白质浓度是2.53.0（25 mg/mL30mg/mL） 蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近值常选在该蛋白质的等电点附近。 在水或稀盐溶液中测得的等电点在水或稀盐溶液中测得的等电点与在高盐溶液中测得的等电点结果可与在高盐溶液中测得的等电点结果可能不一样能不一样 注意注意注意注意 温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大。和小分子有机物，温度升高溶解度加大。 但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加的。是随温度升高而增加的。 在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在在04下操作，以避免活力丧失。下操作，以避免活力丧失。 1）注意饱和度表中规定的温度；）注意饱和度表中规定的温度；2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化；）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化；3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心；离心；4）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓；）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓；5）硫酸铵使用前须用）硫酸铵使用前须用H2S处理，高浓度的硫酸铵溶液使用前处理，高浓度的硫酸铵溶液使用前需用氨水或硫酸调节至所需需用氨水或硫酸调节至所需pH。 6、注意事项、注意事项 蛋蛋白白质质等等电电点点沉沉淀淀法法是是基基于于不不同同蛋蛋白白质质离离子子具具有有不不同同等等电电点点这这一一特特性性，依依次次改改变变溶溶液液pHpH值值的的办办法法，将将杂杂蛋蛋白白沉沉淀淀除除去去，最后获得目标产物。最后获得目标产物。二、等电点沉淀法二、等电点沉淀法 （1）适用于疏水性强的蛋白质）适用于疏水性强的蛋白质（2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒）无机酸通常价格便宜，无毒（4）蛋白质对低）蛋白质对低pH 敏感，易失活敏感，易失活未沉淀蛋白质的分率未沉淀蛋白质的分率pH对大豆蛋白质溶解度的影响对大豆蛋白质溶解度的影响利用等电点除杂蛋白时必须利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH值值。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想单独使用此法分辨率较低，效果不理想。例如：工业上生产胰岛素例如：工业上生产胰岛素粗提液粗提液调调PH8.0调调PH3.0去除碱性蛋白质去除碱性蛋白质去除酸性蛋白质去除酸性蛋白质胰岛素胰岛素三、有机溶剂沉淀法三、有机溶剂沉淀法 许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。加入溶剂后会加入溶剂后会使水溶液的介电常数降低使水溶液的介电常数降低，而使蛋白质分，而使蛋白质分子间的静电引力增大，导致凝集和沉淀。子间的静电引力增大，导致凝集和沉淀。蛋白质的溶剂化蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂所取，使原来和蛋白质结合的水被溶剂所取代，从而降低了它们的溶解度。代，从而降低了它们的溶解度。有机溶剂有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，使其空间如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。水层，从而使蛋白质沉淀。机理分析进展机理分析进展 对某些具有生物活性的大分子容易引起变对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。成本高。性失活，操作需在低温下进行。成本高。优点优点优点优点缺点缺点缺点缺点 分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。可用透析袋脱有机溶剂）。2、有机溶剂的选择和浓度的计算、有机溶剂的选择和浓度的计算 不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过试验加以选择。大致上以试验加以选择。大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次。 前提：能与水互溶前提：能与水互溶V = V = 需加入需加入需加入需加入100100浓度有机溶剂的体积浓度有机溶剂的体积浓度有机溶剂的体积浓度有机溶剂的体积V V0 0 = = 原溶液体积原溶液体积原溶液体积原溶液体积S S1 1 = = 原溶液中有机溶剂的浓度原溶液中有机溶剂的浓度原溶液中有机溶剂的浓度原溶液中有机溶剂的浓度S S2 2 = = 所要求达到的有机溶剂的浓度所要求达到的有机溶剂的浓度所要求达到的有机溶剂的浓度所要求达到的有机溶剂的浓度 离子强度离子强度 3、有机溶剂沉淀的影响因素、有机溶剂沉淀的影响因素 温度温度 样品浓度样品浓度 pHpH值值 有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓搅拌以免局部过浓搅拌以免局部过浓搅拌以免局部过浓 通常使用通常使用通常使用通常使用5mg/mL5mg/mL5mg/mL5mg/mL20mg/mL20mg/mL20mg/mL20mg/mL的蛋白质初浓度的蛋白质初浓度的蛋白质初浓度的蛋白质初浓度样品稳定的样品稳定的样品稳定的样品稳定的pHpHpHpH值范围内，等电点附近值范围内，等电点附近值范围内，等电点附近值范围内，等电点附近通常溶液中盐浓度以不超过通常溶液中盐浓度以不超过通常溶液中盐浓度以不超过通常溶液中盐浓度以不超过5 5 5 5为宜为宜为宜为宜 四、非离子多聚物沉淀法四、非离子多聚物沉淀法 20世世纪纪60年年代代非非离离子子型型聚聚合合物物开开始始用用于于分分离离血血纤纤维维蛋蛋白白原原和和免免疫疫球球蛋蛋白白，从从此此高高相相对对分分子子质质量量非非离离子子聚聚合合物物沉沉淀淀蛋蛋白白质质的的方方法法被被广广泛泛使使用用，如如 ： 聚聚 乙乙 二二 醇醇 （ PEG） 、 聚聚 乙乙 烯烯 吡吡 咯咯 烷烷 酮酮（PVP）、葡聚糖）、葡聚糖等。等。 u沉淀作用是聚合物与生物大分子发生沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀共沉淀作用。作用。u由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水脱水而发而发生沉淀。生沉淀。u聚合物与生物大分子之间聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。在重力作用下形成沉淀析出。u通过通过空间位置排斥空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。一起而发生沉淀。非离子多聚物沉淀蛋白的原理非离子多聚物沉淀蛋白的原理 操作条件温和，不易引起生物大分子变性。操作条件温和，不易引起生物大分子变性。 沉淀效能高，使用很少量的沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀即可以沉淀相当多的生物大分子。相当多的生物大分子。 沉淀后有机聚合物较难去除。沉淀后有机聚合物较难去除。 特特 点：点： 1）选用）选用两种水溶性非离子多聚物两种水溶性非离子多聚物组成液液两相体组成液液两相体系，不等量分配，而造成分离。系，不等量分配，而造成分离。2）选用）选用一种水溶性非离子多聚物一种水溶性非离子多聚物，使生物大分子，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。方方 法法 聚聚电电解解质质是是含含有有重重复复离离子子化化基基团团的的水水溶溶性性聚聚合合物物，可可用用于于蛋蛋白白质质沉沉淀淀的的聚聚电电解解质质有有聚聚丙丙烯烯酸酸、聚聚乙乙烯烯亚亚胺胺、羧羧甲甲基纤维素和离子型多糖基纤维素和离子型多糖如肝素等。如肝素等。沉淀机理沉淀机理五、聚电解质沉淀法五、聚电解质沉淀法 蛋蛋白白质质分分子子的的相相反反电电荷荷与与聚聚电电解解质质结结合合，形形成成一一个个多多分分子子络络合合物物，当当络络合合物物超超过过游游离离蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度极极限限值值时时，就发生沉淀。就发生沉淀。六、生成盐复合物沉淀法六、生成盐复合物沉淀法 金属复合盐法金属复合盐法有机盐法有机盐法无机复合盐法无机复合盐法u能与能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈强烈结合的金属离子，如：结合的金属离子，如：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+；u能与能与羧酸结合而不与含氮化合物结合羧酸结合而不与含氮化合物结合的金属离子，如：的金属离子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+；u与与巯基化合物巯基化合物强烈结合的金属离子，如：强烈结合的金属离子，如：Hg2+、Ag+、Pb2+。金属离子沉淀蛋白质可分为三类：金属离子沉淀蛋白质可分为三类：实际使用时，金属离子的浓度常为实际使用时，金属离子的浓度常为0.02 mol/L。ZnZn2+2+沉淀尿激酶沉淀尿激酶有机盐法有机盐法无机复合盐法无机复合盐法含氮有机酸如苦味酸、苦酮含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉碱性功能团形成复合物而沉淀析出，沉淀后用乙醚除去淀析出，沉淀后用乙醚除去有机酸。有机酸。 如细胞色素如细胞色素C用用45%硫酸铵除杂后，硫酸铵除杂后，用用20% TCA即可将即可将其沉淀。其沉淀。 如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。可加入乙醚或采用离子交换除去无机盐。可加入乙醚或采用离子交换除去无机盐。 七、其他沉淀法七、其他沉淀法 1、选择性变性法、选择性变性法 酸碱变性酸碱变性酸碱变性酸碱变性 热变性热变性热变性热变性表面活性剂变性表面活性剂变性表面活性剂变性表面活性剂变性 有机溶剂变性有机溶剂变性有机溶剂变性有机溶剂变性p选择一定的条件使溶液中存在的某些选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白杂蛋白等杂质变性等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方法就称为沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方法就称为选择选择性变性沉淀法。性变性沉淀法。2、亲和沉淀、亲和沉淀 利用蛋白质与特定的生物或合成的分子之间高度专一利用蛋白质与特定的生物或合成的分子之间高度专一的作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术，其沉淀原的作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术，其沉淀原理是理是依据依据“吸附吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。原理原理原理原理引导产生沉淀的方法有：引导产生沉淀的方法有：u离子交联离子交联u加入带相反电荷的聚合物加入带相反电荷的聚合物u加入带相反电荷的疏水基团加入带相反电荷的疏水基团u改变改变pH值，诱导产生疏水沉淀值，诱导产生疏水沉淀u温度诱导产生沉淀温度诱导产生沉淀配基配基-载体复合物与目的蛋白质的分离载体复合物与目的蛋白质的分离基本过程：基本过程：亲和结合亲和结合 洗洗 涤涤 初始阶段：将一个目标蛋白质初始阶段：将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲和与键合在可溶性载体上的亲和配体络合成沉淀；配体络合成沉淀；所得沉淀物用一种适当的所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质可能存在的杂质用一种适当的用一种适当的试剂将目标蛋试剂将目标蛋白质从配体中白质从配体中离解出来离解出来3.4 核酸的沉淀方法核酸的沉淀方法 核酸分离纯化应维持在核酸分离纯化应维持在0-4的低温的低温条件下，条件下，以防止核酸的变性和降解。以防止核酸的变性和降解。 为防止核酸酶引起的水解作用，可加入为防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二十二烷基硫酸钠烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羟羟基喹啉、柠檬酸钠基喹啉、柠檬酸钠等以抑制核酸酶的活性。等以抑制核酸酶的活性。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法钙盐沉淀法钙盐沉淀法溶剂沉淀法溶剂沉淀法常用的沉淀分离法有：常用的沉淀分离法有：1 1、有机溶剂沉淀法、有机溶剂沉淀法 由于核酸都不溶于有机溶剂，所以由于核酸都不溶于有机溶剂，所以可在核酸提取液中加可在核酸提取液中加入乙醇、异丙醇或入乙醇、异丙醇或2-2-乙氧基乙醇，使乙氧基乙醇，使DNADNA或或RNARNA沉淀下来沉淀下来。核酸沉淀的形状与其相对分子质量密切相关：核酸沉淀的形状与其相对分子质量密切相关： 相对分子质量相对分子质量106Da106Da的双链的双链DNADNA可以可以丝状纤维丝状纤维缠绕在玻棒缠绕在玻棒上；上； 相对分子质量稍小的双链相对分子质量稍小的双链DNADNA或单链或单链DNADNA、RNARNA则以则以凝胶形凝胶形式式存在。存在。 这些核酸经离心后存在于沉淀中，用这些核酸经离心后存在于沉淀中，用70%70%乙醇乙醇洗涤，除去洗涤，除去其它盐和小分子物质，干燥后即为核酸制品。其它盐和小分子物质，干燥后即为核酸制品。 2 2、等电点沉淀法、等电点沉淀法脱氧核糖核蛋白脱氧核糖核蛋白的等电点为的等电点为pH 4.2；核糖核蛋白核糖核蛋白的等电点力的等电点力pH 2.0-2.5；tRNA的等电点为的等电点为pH 5。 3、钙盐沉淀法、钙盐沉淀法核酸提取液核酸提取液核酸提取液核酸提取液10%10%氯化钙氯化钙氯化钙氯化钙钙盐形式钙盐形式钙盐形式钙盐形式1/51/5体积的乙醇体积的乙醇体积的乙醇体积的乙醇DNADNADNADNA钙盐沉淀钙盐沉淀钙盐沉淀钙盐沉淀4、选择性溶剂沉淀法、选择性溶剂沉淀法 在核酸提取液中加入氯仿在核酸提取液中加入氯仿/异戊醇或氯仿异戊醇或氯仿/辛醇，振荡辛醇，振荡一段时间，使一段时间，使蛋白质在氯仿蛋白质在氯仿/水界面上形成凝胶状沉淀水界面上形成凝胶状沉淀而离心而离心除去，除去，核酸仍留在水溶液中核酸仍留在水溶液中。 在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，核酸的苯酚在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，水溶液提取液中，DNA和和RNA都进入水层都进入水层，而，而蛋白质沉淀于蛋白质沉淀于苯酚层中苯酚层中被分离除去。被分离除去。 在在DNA与与RNA的混合液中，用的混合液中，用异丙醇选择性地沉淀异丙醇选择性地沉淀DNA而与而与留在溶液中的留在溶液中的RNA分离。分离。 沉淀法应用沉淀法应用n利用蛋白质沉淀大规模提纯蛋白与免疫球蛋利用蛋白质沉淀大规模提纯蛋白与免疫球蛋白的工艺白的工艺n柠檬酸的生产柠檬酸的生产n萃取萃取 一沉淀法提取分离茶多酚一沉淀法提取分离茶多酚标标准准沉沉淀淀法法回回收收柠柠檬檬酸酸流流程程图图加热到加热到7070度度