细胞信号转导研究技术2015.11From Unicellular To Multicellular Organism-细胞感受环境信号、把这种信号转导入细胞细胞感受环境信号、把这种信号转导入细胞内，并做出反应的过程。内，并做出反应的过程。 细胞信号转导： What is cell signal transduction ?细胞外信号分子受体蛋白细胞内信号转导分子效应蛋白细胞反应细胞信号通路的基本组成信号转导通路的分子组成 主要由蛋白质组成： 1. 蛋白质往往具有酶活性：RTK、腺苷酸环化酶、磷脂酶C、磷酸激酶等，特异性和信号放大。2. 蛋白质相互作用：结合域，特异性。3. 蛋白质修饰：激活/失活、蛋白质相互作用 第二信使（Second messenger)：在传递过程中产生的小分子： cAMP、cGMP、IP3、 DG等，放大信号。 Signal transduction pathway protein-protein interaction Dependent on protein modification mostlyProtein post-translation modification 200 kinds of modification: Phosphorylation, Ubiquitination, SUMOylation, Dynamic and ReversesignalreceptorSignal transduction pathwayGene expression细胞对信号的反应:1.细胞质：蛋白质活性改变2.细胞核： 基因表达改变- 转录出新的或更多的蛋白质To Know Life: From Molecule To CellGeneProteinBiologicalprocess由以下几个方面决定：合成速率：mRNA 水平 稳定性：蛋白水平定位：细胞核、细胞质、细胞器活性：酶活性：激酶、NADPH氧化酶、组蛋白脱乙酰酶（HDAC）等转录活性：主要指转录因子(TF)，促进靶基因转录的活性注意：转录因子活性受到co-activator或co-repressor的调节和哪些蛋白在一起相互作用、相互影响？研究蛋白质在细胞内的活动情况需要从哪些方面入手？ SignalEffect What should we do? SignalTransduction pathwayEffect ? Two kinds of case:Transduction pathway?Case 1: SignalFunctional screening strategyRead outSignalOverexpressionsiRNA, anti-senes, dominant mutant,Specific inhibitorGene expressionSpecific activityEffect Transduction pathway?Transduction pathway?What elso should we do?1.To determine signal component involved.2. Molecular mechanism: upstream and downstream events, protein-protein interaction, protein modification, 1. To determine the target gene of transcription factor: Profile: microarray, bioinformatics, Confirmation: reportor gene assay, mapping binding site, mutation, Chip/gel shift, 2. To determine regulator involving gene expression: Signal transduction pathway.Research related to gene transcription研究实例（数据有所调整） 药物药物A A可增强某种肿瘤细胞对化疗诱导凋亡的敏感可增强某种肿瘤细胞对化疗诱导凋亡的敏感性，欲研究药物性，欲研究药物A A的作用机制。的作用机制。在某种生理或病理过程（如细胞分化、肿瘤发生、药在某种生理或病理过程（如细胞分化、肿瘤发生、药物诱导）中，最初的有关基因表达变化的信息往往可物诱导）中，最初的有关基因表达变化的信息往往可以通过以通过mRNA水平的变化水平的变化（增高或降低）（增高或降低） 来获得来获得, 并并开展进一步的研究。开展进一步的研究。DNA microarray （基因芯片）是一种用于分子生物学和医是一种用于分子生物学和医学领域的高通量技术学领域的高通量技术. 它由一系列成千上万个精微的它由一系列成千上万个精微的DNA寡寡核苷酸点排列而成，这些核苷酸点排列而成，这些DNA寡核苷酸含有百亿分之一摩尔寡核苷酸含有百亿分之一摩尔特定序列的。它们或者是一小截基因，或者是特定序列的。它们或者是一小截基因，或者是DNA的其他成的其他成分。它们被作为探针，在非常严格的条件下和一个叫做靶分分。它们被作为探针，在非常严格的条件下和一个叫做靶分子的子的cDNA 或或 cRNA样本杂交。由于靶分子带有荧光标记，样本杂交。由于靶分子带有荧光标记，因此通过探针因此通过探针-靶分子的杂交，并根据杂交后荧光的有或无靶分子的杂交，并根据杂交后荧光的有或无 ，强或弱，对靶分子中特定核酸序列的丰度进行检测。，强或弱，对靶分子中特定核酸序列的丰度进行检测。Global gene expression analysis in stromal Pten-deleted mammary fibroblasts1、Loss of stromal Pten activates an Ets2-dependent transcriptional program。2、Stromal Ets2 promotes mammary tumorigenesis。3、Loss of Ets2 diminishes tumor formation in Pten stromal-deleted mammary glands。170 non-coding RNAs (ncRNAs) 63 HOX exons(stage I and II)Quantitative PCRHOTAIR 的高表达是转移和死亡的一个有的高表达是转移和死亡的一个有意义的判断指标意义的判断指标关注关注HOTAIR （一种（一种 lncRNA ，与甲基化，与甲基化酶酶PRC2复合体相结合）复合体相结合）基因芯片的结果如何验证？基因芯片的结果如何验证？Real-time PCR and RT-PCROVERVIEW组织或细胞抽提RNA逆转录反应生成cDNA实时定量PCR结果分析RNA的质量Should be free of protein (absorbance 260nm/280nm)Should be undegraded (28S/18S 2:1)Should be free of DNA (DNase treat)逆转录反应的引物Oligo (dt)Random hexamer (NNNNNN)SpecificPCR反应的引物specifichigh efficiencyno primer-dimersIdeally should not give a DNA signalcross exon/exon boundaryEXON1EXON2INTRON2DNAEXON1EXON2RNA设置对照阴性对照 (no DNA)checks reagents for contamination阳性对照checks that reagents and primers workespecially importance if trying to show absence of expression of a gene750bp Marker brain(+) brain( ) ( ) 两种标记技术染料染色SYBR Green探针标记TaqMan探针定量原理SYBR Green染料染料法的优缺点成本低广谱性适合初筛无模板特异性灵敏度低条件优化研究实例（数据有所调整） 药物药物A A可增强某种肿瘤细胞对化疗诱导凋亡的敏感可增强某种肿瘤细胞对化疗诱导凋亡的敏感性，欲研究药物性，欲研究药物A A的作用机制，对药物的作用机制，对药物A A处理前后的细胞处理前后的细胞进行进行cDNA arraycDNA array分析，发现药物分析，发现药物A A可诱导蛋白质可诱导蛋白质Cax Cax mRNAmRNA水平的增高。水平的增高。 以以Northern Blot Northern Blot 检测检测 CaxCax在各种组织中的表达，在各种组织中的表达，包括一些肿瘤标本。包括一些肿瘤标本。 研究实例（数据有所调整） 以以Northern Blot Northern Blot 检测检测 CaxCax在各种组织中的表达在各种组织中的表达Expression of CAX in Mouse Tissues By Northern blot analysismCAXBeta-actin5.5kb4.2kb 文献检索表明，文献检索表明， CaxCax是一种未被研究的蛋白质，基是一种未被研究的蛋白质，基本特点和功能不明，且序列不完整。本特点和功能不明，且序列不完整。首先可对其作一个生物信息学的分析。例如，在首先可对其作一个生物信息学的分析。例如，在NCBINCBI数数据库里寻找一些信息。据库里寻找一些信息。http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/*EST（BB664436）有）有236bp的的5端延伸，端延伸， RESULTS FROM BLAST IN GENEBANKPCR验证电子克隆的结果验证电子克隆的结果PCR PRODUCT WITH PRIMER B AND CEST (BB664436)cbc750bp Marker brain(+) brain( ) ( ) 电子克隆拼接后形成完整的电子克隆拼接后形成完整的5端序列端序列拼接产物编码的蛋白与人的拼接产物编码的蛋白与人的 CAX高度同源高度同源 欲进一步研究Cax的作用机制，常用的方法是寻找与Cax相互作用的蛋白，最常用的方法为酵母双杂交（yeast two-hybrid) 酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。 当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。 GAL4 为转录因子，含DBD(DNA-binding domain)和AD(Activating domain)两个结构域Cax as bait, cloned to GAL4-BD vectorcDNA library, cloned to GAL4-AD vector CAX的全长的全长cDNA序列序列Caxp50p65Caxp65Yeast two-hybrid screening：p65（RelA）是Cax的相互作用蛋白以DBD-Cax和AD-p65共转染酵母，进一步证实它们的相互作用或体外翻译的蛋白，或体外翻译的蛋白，如如35S标记的标记的p65。In Vitro Binding Assay GST pull-down assay, Glutathione-S-transferase谷谷胱苷肽巯基转移酶胱苷肽巯基转移酶glutathione-Sepharose beadsIn Vitro Binding Assay GST pull-down assay, Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶GST or GST-Cax fusion proteins were expressed in E. coli BL21 cells and purified with glutathione-Sepharose beads. pcDNA-p65 was subjected to in vitro translation to produce a p65 protein labeled with 35Smethionine. Purified GST-Cax or GST proteins bound to glutathione-Sepharose beads were incubated with 35S-labeled p65 After intensive washing, the beads were resuspended and subjected to (SDS-PAGE) and autoradiography. Input GST GST-Cax GST pull-down samplep65GST-CaxGSTBorg proteins control septin organization and are negativelyregulated by Cdc42NATURE CELL BIOLOGY/VOL 3 OCTOBER 2001Grard Joberty, Richard R. Perlungher, Peter J. SheffieldGST fusion proteins were immobilized on glutathioneSepharose beads and incubated with cell lysates. NIH 3T3 cells were labelled with 35Smethionine. The cell extracts were centrifuged and the supernatants were precleared with glutathioneSepharose beads and incubated with the GSTBorg3 for 20 min. Beads were washed with the same buffer. Proteins were eluted with 20 mM glutathione. GSTBorg3 was digested with thrombin. Proteins were then separated, digested and identified as described previously. GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。其基本原理是将靶蛋白外试验技术。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白固化在谷胱融合蛋白固化在谷胱甘肽亲和树脂上甘肽亲和树脂上, 充当一种充当一种“诱饵蛋白诱饵蛋白”。当目的蛋白溶液过柱。当目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白捕获蛋白”(目的蛋白目的蛋白),洗脱结合洗脱结合物后通过物后通过SDS-PAGE电泳分析电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白诱饵蛋白”和和“捕获蛋白捕获蛋白”均可通过细均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白以及体外翻译等方法获得。胞裂解物、纯化的蛋白以及体外翻译等方法获得。 His-Cax - + - + HA-p65 - - + + IP: Anti-His IB: Anti-HA Anti-His Anti-HA IP: Anti-HA IB: Anti-HisTotal cell lysates 1 2 3 4 In Vivo Binding Assay (Co-mmunoprecipitation, CoIP ) (免疫共沉淀免疫共沉淀)protein A-agarose beads HA-p65Anti-His-IgGProtein AHis-Caxagarose beads 有时侯，抗体可以直接偶联到agarose beads上Anti-HA-IgGHis-CaxHA-p65agarose beads MNO现在我们有足够的证据表明，p65是Cax的相互作用蛋白p65是转录因子NF B的一个亚基，NF B已经得到广泛深入的研究。下一步的研究应该是Cax是否参与调节NF B的活性，如何调节？NF-B的激活的激活 转录因子(transcription factor)在在GPCR途径中有途径中有CREB酶偶联受体：酶偶联受体： RTK-Ras-MAPK途径中有途径中有cMyc, cJun, cFos 其他：其他：STAT、Smad在受调蛋白水解依赖的信号转导途径中有在受调蛋白水解依赖的信号转导途径中有NF-B 在核受体信号途径中在核受体信号途径中, 核受体核受体自身为转录因子。自身为转录因子。 转录因子就是基因转录因子就是基因调控蛋白，通过与调控蛋白，通过与DNA上基因调控序列结合，上基因调控序列结合，调节基因转录。调节基因转录。在研究某些因素对在研究某些因素对NFNFBB信号系统的影信号系统的影响的时候，分为不同层次：响的时候，分为不同层次：细胞质层次：细胞质层次： IBIB激酶的激活激酶的激活（kinase assay)kinase assay)IBIB的降解的降解(Western blot)(Western blot)细胞核层次：细胞核层次：NFNFBB与与DNADNA的结合能力（的结合能力（in vitro) in vitro) （EMSA)EMSA)NFNFBB与与DNADNA的结合（的结合（in vivo)in vivo)(ChIP)(ChIP)NFNFBB与与co-activatorco-activator或或co-repressorco-repressor的关系的关系0 5 10 15 30 60 0 5 10 15 30 60 min VectorHis-CaxIB(37KD)-actinCaxCax对对I IBB降解的降解的影响影响(Western blot)制备稳定表达制备稳定表达CaxCax的细胞系：的细胞系：逆转录病毒载体或逆转录病毒载体或pcDNA3 G418pcDNA3 G418筛选筛选TNF抗原等蛋白样品经SDS处理后全部带上负电荷，从而使蛋白之间仅有分子大小的差异。将少量待测蛋白样本加入夹在两块玻璃平板之间的聚丙烯酰酰凝胶顶部的加样孔中。组织或细胞组织或细胞的蛋白裂解的蛋白裂解产物产物凝胶凝胶玻璃玻璃平板平板将凝胶置于电场中，凝胶的底部接正极。带负电荷的蛋白向凝胶底部的正极泳动，并按分子大小的不同形成分离的条带。蛋白分子的泳动速率与分子的大小成反比，最小的多肽最先到达凝胶的底部。凝胶可以用能结合多肽的染液进行染色。最终在凝胶中显示样本中各多肽的位置。BlottingUsed to identify a single protein/DNA/RNA molecule in a complex mixture that has been separated by gel electrophoresisProbes are labeled for easy visualizationWhen antibodies are used to probe for specific proteins in a gel, this is called “western blotting”Southern blotting is probing for a DNA sequence with a DNA probeNorthern blotting is probing for an RNA sequence with a DNA probeAntibodiesProteins that play a critical role in humoral immunityTo cell biologists, they are “tools” for researchHighly selective for specific moleculesEasy to purifyEasy to chemically modify with “tags” that can be visualizedCan sometimes impact the function of a protein in a living cell (e.g., herceptin)Polyclonal antibodies次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）胸腺嘧啶核苷激酶（胸腺嘧啶核苷激酶（TK） 次黄嘌呤（次黄嘌呤（hypoxanthine,H）氨甲喋呤（氨甲喋呤（aminopterin,A）胸腺嘧啶核苷（胸腺嘧啶核苷（thymidine,T）氨甲喋呤是叶酸的拮抗剂氨甲喋呤是叶酸的拮抗剂 DAPIHis-Cax Anti-His免疫荧光：免疫荧光：p65可能位于细胞核或细胞质，那么Cax定位于哪里呢？亚细胞定位带标签的重组蛋白带标签的重组蛋白重组蛋白His-tagHA-tag共定位重组重组DNA技术技术Cax与p65的细胞核共定位: TNFalpha处理2小时 Anti-p65 Anti-PML Anti-Cax Anti-Cax Merge MergeP65与Cax共定位于细胞核内对NF-kB的功能有何影响？ 转录因子受到转录因子受到co-activator或或co-repressor的调节，可的调节，可以引起染色体重构，从而以引起染色体重构，从而改变核小体的局部构象，改变核小体的局部构象，使得转录复合体易于或不使得转录复合体易于或不易于接近转录起始点。易于接近转录起始点。?Cax 很可能是很可能是NFNFBB的的共共激活因子（激活因子（ co-activator)或或共抑制因子共抑制因子(co-repressor)用报告基因来检测转录因子的活化：用报告基因来检测转录因子的活化：1.绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白 2. 半乳糖苷酶半乳糖苷酶 3. 荧光素酶荧光素酶(Luciferase)TitrationHis-CaxJ16CaxCax抑制抑制NFNFBB的转录活性的转录活性5-deletion analysis can identify transcription-control sequences in DNA upstream of a geneIFN- 、IFN- 可诱导胚胎成纤维可诱导胚胎成纤维细胞细胞CAX的表达的表达RT-PCRRT-PCR结果结果1000U/ml IFN- M - +/+c 6h 12h 24h -/-c G3PDHmCAXNorthernNorthern100U/ml IFN- C 6h 12h 24h C 6h 12h 24h G3PDHmCAX+/+-/-An electrophoretic mobility shift assay (EMSA), also referred as a gel shift assay, gel mobility shift assay, is a common technique used to study protein-DNA or protein-RNA interactions. This procedure can determine if a protein or mixture of proteins is capable of binding to a given DNA or RNA sequence, and can sometimes indicate if more than one protein molecule is involved in the binding complex. p65NFB binding sites凝胶电泳迁移率变迁分析（凝胶电泳迁移率变迁分析（Electrophoretic mobility Electrophoretic mobility shift assay,EMSAshift assay,EMSA） ，也称，也称Gel ShiftGel Shift。检测转录因子与检测转录因子与DNADNA结合的能力（结合的能力（in vitro) in vitro) ：检测转录因子与检测转录因子与DNADNA结合的能力（结合的能力（in vitro) in vitro) ：凝胶电泳迁移率变迁分析（凝胶电泳迁移率变迁分析（Electrophoretic mobility Electrophoretic mobility shift assay,EMSAshift assay,EMSA） ，也称，也称Gel ShiftGel Shift。TNF - + - + NF-BFree probeVector His-CaxCaxCax不影响不影响NFNFBB与与DNADNA结合的能力（结合的能力（DNA binding DNA binding capacitycapacity）1.1.核蛋白粗提物核蛋白粗提物2.2.3232P P 标记标记NF-BNF-B探针探针3.3.1 1与与2 2孵育孵育, SDS-, SDS-PAGE,PAGE,放射自显影放射自显影检测转录因子与检测转录因子与DNADNA结合的能力（结合的能力（in vitro) in vitro) ：凝胶电泳迁移率变迁分析（凝胶电泳迁移率变迁分析（Electrophoretic mobility Electrophoretic mobility shift assay,EMSAshift assay,EMSA） ，也称，也称Gel ShiftGel Shift。凝胶电泳迁移率改变分析（凝胶电泳迁移率改变分析（EMSAEMSA）是目前研究转录调控）是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，但是由于蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，但是由于许多许多转录调控蛋白有相似或相同的转录调控蛋白有相似或相同的DNADNA结合位点结合位点，这种体外分，这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNADNA结合的状况。染色质免疫沉淀分析（结合的状况。染色质免疫沉淀分析（ChIPChIP）是基于体）是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNADNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。方法。染色质免疫沉淀技术（染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, chromatin immunoprecipitation assay, CHIPCHIP）研究体内研究体内DNADNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质状态下固定蛋白质DNADNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的富集目的蛋白结合的DNADNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与而获得蛋白质与DNADNA相互作用的信息。相互作用的信息。该技术主要应用：该技术主要应用：1.1.组蛋白修饰研究组蛋白修饰研究 2.2.转录调控分析转录调控分析 3.3.药物开药物开发研究发研究 4.4.有丝分裂研究有丝分裂研究 5.DNA5.DNA损失与凋亡分析。损失与凋亡分析。下图是下图是ChIPChIP技术的作用原理。技术的作用原理。 = p65Intact cellCrosslink with formaldehydeHarvest cellsSonicate to fragment chromatinReverse crosslinking by heating at 65C overnight and use RNAse and proteinase K to degrade protein and RNACheck fragmentation by running an agarose gelDivide chromatin into 3 aliquots: (1) input, (2) IP with IgG, (3) IP with p65 antibodyPerform IP活细胞状态下固定蛋白质活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物复合物将其随机切断将其随机切断免疫学方法沉淀免疫学方法沉淀Reverse crosslinking by heating at 65C overnightUse RNAse and proteinase K to degrade protein and RNAPurify DNA and run PCR on target sequences (cyclin D)Run SDS-PAGE to check if protein was precipitated by the antibody specificallyinputIgGp65IgGp65inputIgGp65Positive primer检测转录因子与检测转录因子与DNADNA结合（结合（in vivo)in vivo)：染色体免疫沉：染色体免疫沉淀（淀（chromotin immunoprecipitation ,ChIPchromotin immunoprecipitation ,ChIP） InputAnti p65 His-Cax cyclin D1 promoter cyclin D1 promoter VectorIgGCaxCax不影响不影响NFNFBB与与DNADNA的结合（的结合（DNA binding DNA binding ）Anti-p65-IgGp65NFB binding sites cyclin D1 promoter1.Chromotin processing to small fragments(500-600bp)2.Anti-p65 immunoprecipitation3.PCR for cyclin D1 promoter(containing NFB binding sites )细胞质层次：细胞质层次： IBIB激酶的激活激酶的激活（kinase assay)kinase assay)IBIB的降解的降解(Western blot)(Western blot)细胞核层次：细胞核层次：NFNFBB与与DNADNA的结合能力（的结合能力（in vitro) in vitro) （EMSA)EMSA)NFNFBB与与DNADNA的结合（的结合（in vivo)in vivo)(ChIP)(ChIP)CaxCax对对NFNFBB信号系统的影响作用环信号系统的影响作用环节可能在节可能在co-repressorco-repressor 共激活因子（共激活因子（ co-activator)或共抑制因子或共抑制因子(co-repressor)往往往就是通过调节组蛋白的翻译往就是通过调节组蛋白的翻译后修饰实现其功能的后修饰实现其功能的 组蛋白可以有多种翻译后修饰组蛋白可以有多种翻译后修饰形式：形式： 磷酸化磷酸化 乙酰化乙酰化 泛素化泛素化 甲基化甲基化 这些修饰会影响组蛋白的构这些修饰会影响组蛋白的构 象，从而影响转录复合体与象，从而影响转录复合体与DNA的结合：的结合：Histone code引起染色体重构引起染色体重构 (Remodeling)的因子：的因子：1.ATP-dependant Remodeling Complexes2.HAT or HDAC Complexes HAT: histone acetyltransferase（组蛋白乙酰转移酶）（组蛋白乙酰转移酶） HDAC: histone deacetylase（组蛋白脱乙酰酶）（组蛋白脱乙酰酶）His-CaxHis-CaxTSATSA，不影响不影响CaxCax对对NFNFBB的抑制作用；的抑制作用；NAM,NAM, 可解除可解除CaxCax对对NFNFBB的抑制作用。的抑制作用。 TSATSA，第一、二类组蛋白脱乙酰酶（第一、二类组蛋白脱乙酰酶（HDACHDAC）的抑制剂；的抑制剂；NAM, NAM, 第三类第三类HDACHDAC的抑制剂。的抑制剂。 Cax Cax是依赖于第三类是依赖于第三类HDACHDAC活性的活性的co-repressorco-repressor